李洪利 張維 李慧 王君瑋 曹金山

非洲豬瘟（African swine fever，ASF）是由屬于非洲豬瘟病毒科、非洲豬瘟病毒屬的非洲豬瘟病毒（ASFV）引起的豬的一種急性、高度接觸性傳染病。強(qiáng)病毒株感染家豬的發(fā)病率和死亡率達(dá)100%，曾在非洲、美洲和歐洲部分地區(qū)廣泛流行，并造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。目前，該病在非洲的東部和南部地區(qū)、俄羅斯的北高加索地區(qū)仍時(shí)有發(fā)生。由于對(duì)養(yǎng)豬業(yè)危害很大，而且無有效的疫苗用于預(yù)防，世界動(dòng)物衛(wèi)生組織（OIE）將其列為法定呈報(bào)的動(dòng)物疫病，我國(guó)規(guī)定其為一類動(dòng)物傳染病。

ASFV顆粒有囊膜，呈二十面體對(duì)稱?；蚪M由單分子線狀雙股DNA組成，長(zhǎng)度為170～190 kb之間，含有共價(jià)的閉合末端、反轉(zhuǎn)重復(fù)區(qū)和發(fā)夾結(jié)構(gòu)，編碼許多與病毒復(fù)制有關(guān)的酶和對(duì)病毒生存?zhèn)鞑ゾ哂兄匾饔玫牡鞍住?/p>

ASFV主要以豬的巨噬細(xì)胞為感染靶細(xì)胞，病毒通過受體介導(dǎo)的胞吞機(jī)制侵入靶細(xì)胞，利用其囊膜與內(nèi)吞泡膜的融合機(jī)制將病毒釋放到細(xì)胞質(zhì)，然后，病毒核衣殼被轉(zhuǎn)移到宿主細(xì)胞核周圍，先利用包裝在病毒粒子內(nèi)的酶和細(xì)胞因子進(jìn)行mRNA的轉(zhuǎn)錄，以提供病毒復(fù)制所需的DNA聚合酶等。在感染6 h后，病毒開始在細(xì)胞質(zhì)中復(fù)制，病毒早期基因表達(dá)轉(zhuǎn)向晚期基因表達(dá)。然后，在細(xì)胞質(zhì)的病毒工廠進(jìn)行病毒裝配，形成完整的病毒粒子，裝配好的病毒粒子轉(zhuǎn)移到細(xì)胞膜，經(jīng)細(xì)胞膜出芽釋放。

1 ASFV感染機(jī)制的研究

1.1 病毒對(duì)宿主細(xì)胞的侵入機(jī)制ASFV

利用受體介導(dǎo)的胞吞作用和感染細(xì)胞的結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)入宿主細(xì)胞。細(xì)胞表面的特異性識(shí)別受體是決定宿主類別和病毒組織侵染性的關(guān)鍵因素。病毒編碼的許多蛋白參與病毒與細(xì)胞表面受體結(jié)合及病毒侵入宿主細(xì)胞的過程。宿主細(xì)胞膜具有與病毒p12蛋白的結(jié)合位點(diǎn)，病毒的感染力依賴于p12蛋白與細(xì)胞受體的結(jié)合。到目前為止，p12是唯一競(jìng)爭(zhēng)性的與靶細(xì)胞結(jié)合的蛋白。蛋白pE248R是嵌膜蛋白，位于成熟病毒粒子的內(nèi)膜，對(duì)病毒早期侵入宿主細(xì)胞至關(guān)重要。

ASFV感染宿主細(xì)胞后，機(jī)體會(huì)產(chǎn)生抗體中和病毒，抑制病毒的附著及胞吞入宿主細(xì)胞，抗體可以結(jié)合結(jié)構(gòu)蛋白 p30、p54、p72，p54、p72蛋白的抗體可以抑制病毒復(fù)制循環(huán)期的病毒附著，而 p30抗體可以抑制病毒感染靶細(xì)胞。

此外，ASFV感染靶細(xì)胞還依賴于內(nèi)吞體的酸化作用和動(dòng)力蛋白GTP酶活性。ASFV通過網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的胞吞作用進(jìn)入宿主細(xì)胞，網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的胞吞作用需要?jiǎng)恿Φ鞍譍TP酶激活。在ASFV感染過程中，網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的胞吞作用及其主要成分EPs-15起著重要的作用。

1.2 ASFV侵入宿主細(xì)胞后的DNA復(fù)制機(jī)制

ASFV DNA的復(fù)制開始于宿主細(xì)胞的細(xì)胞核復(fù)制時(shí)期，然后是細(xì)胞質(zhì)復(fù)制時(shí)期，所以病毒的核質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)在病毒的復(fù)制循環(huán)過程中起重要作用。蛋白p37在ASFV復(fù)制過程中介導(dǎo)病毒DNA的核質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)，在感染早期，蛋白p37伴隨病毒DNA進(jìn)入并聚集于細(xì)胞核，病毒DNA在宿主細(xì)胞核復(fù)制后，蛋白 p37和病毒DNA一起轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞質(zhì)，然后聚集于細(xì)胞質(zhì)的病毒工廠中。

當(dāng)ASFV感染豬體時(shí)，機(jī)體會(huì)啟動(dòng)免疫反應(yīng)，被感染的細(xì)胞激活自殺程序，ASFV通過抑制細(xì)胞凋亡使病毒在宿主細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行復(fù)制。A179L基因編碼的蛋白與bcl-2作用相似，可在ASFV感染時(shí)期調(diào)節(jié)宿主細(xì)胞凋亡，在感染早期阻止細(xì)胞凋亡，使病毒在宿主細(xì)胞內(nèi)大量復(fù)制，對(duì)病毒持續(xù)性感染起著重要作用。A224L基因編碼的蛋白可抑制半胱天冬酶活性來提高細(xì)胞的存活。此外，MGF360和MGF530基因也可以提高感染細(xì)胞的存活率，對(duì)ASFV在宿主細(xì)胞中的復(fù)制起重要作用。

ASFV通過兩種系統(tǒng)來維持病毒基因組的完整。一種是DNA前體合成所需要的酶系統(tǒng)，如核苷酸還原酶、胸苷激酶、胸苷酸激酶等；另一種是堿基切除修復(fù)系統(tǒng)，可以修復(fù)水解或氧化造成的病毒DNA的堿基損傷。病毒DNA聚合酶X是分布廣泛的聚合酶，雖然缺乏校對(duì)3'～5'核酸內(nèi)切酶活性，但在病毒感染時(shí)，DNA聚合酶X參與了病毒的堿基切除修復(fù)。ASFV蛋白pE296R是Ⅱ 類AP核酸內(nèi)切酶，對(duì)AP位點(diǎn)具有特異性核酸內(nèi)切活性并具有校對(duì)3'～5'核酸內(nèi)切酶活性，能夠有效地切除錯(cuò)配，在病毒感染后期，AP核酸內(nèi)切酶在感染細(xì)胞的病毒工廠中，參與后期的病毒堿基切除修復(fù)過程。ASFV利用DNA聚合酶X、連接酶和 AP核酸內(nèi)切酶組成了病毒切除修復(fù)系統(tǒng)來保證病毒基因復(fù)制的精確性。

ASFV編碼的蛋白pE165R屬于dUTP酶家族，可減少dUTP含量，并提供胸苷酸激酶底物來保證病毒DNA的完整性。在自然感染條件下，dUTP酶可以降低dUTP的濃度，進(jìn)而降低dUTP錯(cuò)配入病毒DNA的可能性，以保證基因復(fù)制的精確性。

1.3 參與 ASFV裝配過程的蛋白及裝配機(jī)制

ASFV在宿主細(xì)胞質(zhì)核周的病毒工廠進(jìn)行裝配，裝配部位集中在微管形成中心和高爾基復(fù)合體。在病毒工廠中ASFV的裝配開始于前體膜結(jié)構(gòu)的形成，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)源性病毒膜是內(nèi)層病毒被膜前體。被膜前體經(jīng)外衣殼的逐步裝配形成二十面體結(jié)構(gòu)。多聚蛋白pp220和pp62的蛋白酶解加工是與裝配有關(guān)的重要的成熟過程。跨膜結(jié)構(gòu)蛋白 p54對(duì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜的募集和轉(zhuǎn)化為病毒被膜前體至關(guān)重要，在病毒裝配位點(diǎn)，p54的表達(dá)可以影響病毒多蛋白類的正常定位，抑制 p54的表達(dá)會(huì)中斷內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜向病毒裝配位點(diǎn)內(nèi)部的轉(zhuǎn)移，進(jìn)而阻礙內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜轉(zhuǎn)化成被膜前體及病毒顆粒的形成。

多聚蛋白pp220和pp62的蛋白酶解加工是ASFV核裝配過程的關(guān)鍵步驟。在病毒感染過程中，這兩種蛋白被蛋白水解酶逐步加工，產(chǎn)生6種主要的結(jié)構(gòu)蛋白，蛋白p150、p37、p34、p14來源于pp220，蛋白p35、p15來源于pp62。兩種多聚蛋白的成熟產(chǎn)物是組成核殼的基本組件，約占病毒粒子蛋白總量的30%。ASFV蛋白水解酶pS273R可催化多聚蛋白前體的蛋白酶解加工，并參與病毒感染后期的成熟過程，對(duì)病毒的核裝配起重要的作用。p17在病毒膜前體轉(zhuǎn)化為二十面體結(jié)構(gòu)中間體的過程中起重要的作用，p17是內(nèi)膜蛋白，位于病毒包膜前體及胞內(nèi)成熟病毒顆粒，p17的表達(dá)對(duì)多蛋白pp220和pp62的酶解加工至關(guān)重要，p17表達(dá)的抑制導(dǎo)致膜前體的積累和衣殼及核殼主要成分的離域，阻礙病毒前體膜的成熟，影響病毒在病毒工廠前體膜階段的形態(tài)學(xué)變化。非結(jié)構(gòu)蛋白pB602L在ASFV感染的后期表達(dá)，是衣殼蛋白 p72正確折疊的伴侶蛋白。抑制pB602L合成可影響病毒多聚蛋白 pp220和 pp62的蛋白酶解加工，并且導(dǎo)致p72蛋白的減少和衣殼蛋白pE120R的離域，pB602L對(duì)病毒粒子二十面體結(jié)構(gòu)的形成起著重要的作用。

1.4 成熟病毒粒子向胞外的運(yùn)輸釋放機(jī)制

病毒轉(zhuǎn)運(yùn)最普遍的方式是在宿主細(xì)胞內(nèi)的病毒成分利用微管進(jìn)行直接的大范圍轉(zhuǎn)運(yùn)。經(jīng)過裝配以后，成熟的ASFV顆粒離開病毒工廠，經(jīng)細(xì)胞質(zhì)，然后由宿主細(xì)胞釋放。裝配的 ASFV從裝配部位到細(xì)胞表面的運(yùn)輸依賴于微管和驅(qū)動(dòng)蛋白。ASFV感染可提高微管的穩(wěn)定性，在病毒復(fù)制的早期，ASFV利用微管向核周區(qū)域進(jìn)行分子運(yùn)輸。驅(qū)動(dòng)蛋白為胞內(nèi)物質(zhì)（如線粒體、溶酶體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、mRNA）的轉(zhuǎn)運(yùn)提供動(dòng)力，并利用微管把病毒從核周裝配部位轉(zhuǎn)移到質(zhì)膜。ASFV顆粒的運(yùn)輸主要通過蛋白p54和動(dòng)力蛋白LC8輕鏈的直接結(jié)合來控制微管動(dòng)力復(fù)合物的胞內(nèi)運(yùn)輸。病毒的結(jié)構(gòu)蛋白同小分子動(dòng)力蛋白復(fù)合物的直接結(jié)合可以形成微管介導(dǎo)的病毒運(yùn)輸?shù)姆肿訖C(jī)制。此外，蛋白pE102R對(duì)胞內(nèi)病毒從裝配部位向質(zhì)膜的運(yùn)輸起重要作用。

1.5 ASFV逃避宿主免疫防御機(jī)制的蛋白及其作用機(jī)制

ASFV利用非常有效的機(jī)制逃避宿主的免疫防御系統(tǒng)。細(xì)胞因子類是炎性介導(dǎo)和免疫反應(yīng)的重要調(diào)節(jié)物質(zhì)，可以刺激炎性反應(yīng)對(duì)抗病毒感染。ASFV可以抑制感染的巨噬細(xì)胞中IFN-α和 TNF-α的分泌及致炎細(xì)胞因子類的產(chǎn)生。

ASFV利用A238L基因編碼蛋白阻礙NFκB激活的機(jī)制抑制促炎癥反應(yīng)和抗病毒細(xì)胞因子的產(chǎn)生。A238L基因編碼蛋白與 IκB有相似的錨蛋白重復(fù)序列，與宿主的NFκB結(jié)合使NFκB處于非活化狀態(tài)，導(dǎo)致NFκB不能與靶DNA結(jié)合，減少致炎細(xì)胞因子產(chǎn)生量。A238L基因編碼蛋白還可以通過抑制鈣神經(jīng)素磷酸酶的活性，使鈣神經(jīng)素依賴性通道和 NFAT轉(zhuǎn)化因子的活性受到抑制。

巨噬細(xì)胞是 TNF-α的主要來源，TNF-α是抑制病毒感染的多效性細(xì)胞因子，TNF-α轉(zhuǎn)錄可以被幾種轉(zhuǎn)錄因子如NFκB、NFAT和c-Jun調(diào)節(jié)。轉(zhuǎn)錄輔助激活因子的過量表達(dá)可恢復(fù)TNF-α啟動(dòng)子的活性。A238L基因編碼蛋白通過抑制NFκB、NFAT和 c-Jun的表達(dá)抑制TNF-α的活性。A238L基因編碼蛋白抑制TNF-α表達(dá)是ASFV逃避宿主免疫反應(yīng)的有效機(jī)制。

此外，感染細(xì)胞的凋亡也是機(jī)體免疫防御的重要組成部分。ASFV某些基因通過調(diào)節(jié)宿主細(xì)胞凋亡使病毒逃避免疫防御，如A179L基因和與A224L基因編碼的蛋白可以調(diào)節(jié)程序性的細(xì)胞死亡或干擾宿主細(xì)胞反應(yīng)。

2 ASFV檢測(cè)方法的研究

由于ASF無有效的疫苗用于防控，因此敏感、特異、快速的ASFV實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)對(duì)ASF的防控和根除措施的實(shí)施至關(guān)重要。目前，用于檢測(cè) ASFV的方法主要有ELISA、病毒核酸檢測(cè)、免疫印跡（IB）、紅細(xì)胞吸附試驗(yàn)（HD）、直接免疫熒光實(shí)驗(yàn)（DIF）、間接免疫熒光（IFA）等方法。OIE推薦檢測(cè) ASFV的方法有PCR、實(shí)時(shí)熒光定量PCR、ELISA和IB。其中，病毒核酸檢測(cè)和ELISA操作簡(jiǎn)單，可以快速敏感的檢測(cè)ASF，是監(jiān)測(cè) ASF傳播流行首選的兩種方法。

2.1 病毒核酸檢測(cè)

King等針對(duì)ASFV VP72基因建立了TaqMan熒光定量PCR檢測(cè)可以用于鑒別診斷ASF、典型豬瘟（CSF）和豬皮炎腎病綜合癥（PDNS）。Zsak等建立的檢測(cè) ASFV實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法，該方法檢測(cè)組織樣品的敏感性高于血液樣品，因此可以用于檢測(cè) ASFV感染的組織樣品。Basto等建立了檢測(cè)蜱ASFV的套式PCR方法，該方法采用內(nèi)參對(duì)照，敏感性高于OIE推薦的PCR檢測(cè)方法，可以用來檢測(cè)蜱是否攜帶ASFV。Giammarioli等建立了檢測(cè)CSFV、ASFV、2型豬圓環(huán)病毒（PCV2）、豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）、豬細(xì)小病毒（PPV）5種病毒的多重PCR檢測(cè)方法，檢測(cè)ASFV的單重PCR方法的敏感性高于多重PCR方法，可以用于這 5種病毒感染的鑒別診斷。

Tignon等針對(duì) VP72基因設(shè)計(jì)引物探針，建立了檢測(cè) ASFV的實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法，采用內(nèi)部參照，檢測(cè)限為5.7～57拷貝的ASFV基因組 DNA，該方法敏感性高于OIE推薦的常規(guī)PCR和實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法。MGB探針實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法是快速、靈敏和特異的檢測(cè) ASFV的方法，McKillen等根據(jù)9GL基因建立了MGB實(shí)時(shí)熒光定量 PCR檢測(cè)方法，最低可以檢測(cè)到20拷貝標(biāo)準(zhǔn)DNA。該方法檢測(cè)臨床樣品中的 ASFV，敏感性與 OIE推薦TaqMan熒光定量PCR方法相當(dāng)，檢測(cè)范圍為2×101～2×1010拷貝。

Ronish等基于ASFVVP72基因建立了線性指數(shù)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（linear-after-the-exponential PCR，LATE-PCR）檢測(cè)方法，LATE-PCR是不對(duì)稱PCR的一種形式，該方法可以大量擴(kuò)增單股目的片段，在PCR擴(kuò)增的終點(diǎn)進(jìn)行熒光讀數(shù)，通過溶解曲線分析目的片段的擴(kuò)增，可以用于檢測(cè)組織樣品的病毒，其敏感性可以達(dá)到大約1拷貝的病毒DNA，為 ASFV的實(shí)驗(yàn)室診斷提供了敏感的檢測(cè)方法。

環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（LAMP）技術(shù)檢測(cè)速度、敏感性、特異性均優(yōu)于PCR技術(shù)，并且檢測(cè)成本遠(yuǎn)低于熒光定量PCR，針對(duì)拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ基因建立的檢測(cè)ASFV的LAMP方法，最低可以檢測(cè)到330拷貝DNA的病毒，并可以用于ASFV的檢測(cè)。該方法與實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)血液和組織樣品的結(jié)果一致。在ASF流行地區(qū)，該方法為ASF的診斷提供了特異、實(shí)用、經(jīng)濟(jì)、快速的分子檢測(cè)模式。

2.2 ELISA檢測(cè)方法

Pastor等用細(xì)胞質(zhì)可溶性抗原CS-P，建立了斑點(diǎn)免疫檢測(cè)方法（DIA），敏感性與 OIE推薦的ELISA和IB方法相當(dāng)，檢測(cè)150個(gè)陽性樣品，ELISA檢測(cè)92%為陽性，IB檢測(cè)98%為陽性，DIA檢測(cè)96%為陽性，其最大的優(yōu)勢(shì)是檢測(cè)快速。利用VP73單克隆抗體，建立的檢測(cè)樣品中ASFV抗原的ELISA方法，能夠檢測(cè)到濃度為 0.5 μg/mL的VP73抗原和2.3×102pfu/mL的全病毒顆粒。此外，以昆蟲細(xì)胞表達(dá)的 p30蛋白作為包被抗原，建立的檢測(cè)ASF抗體的ELISA方法，敏感性與OIE推薦的ELISA的敏感性相當(dāng)，特異性高于 OIE推薦的ELISA。該方法在檢測(cè)早期感染的樣品時(shí)具有更高的敏感性，可以用于ASFV特異性抗體的早期檢測(cè)。

Gallardo等利用重組蛋白pK205R，pB602L，p104R和p54建立的ELISA檢測(cè)方法，用OIE推薦的ELISA方法檢測(cè)的歐洲地區(qū)豬血清來評(píng)估該方法，結(jié)果顯示，以蛋白 pK205R，pB602L和p54建立的方法具有較高的敏感性和特異性，與檢測(cè)ASFV的標(biāo)準(zhǔn)IB結(jié)果基本一致。pB602L和p54建立的ELISA檢測(cè)方法的敏感性要高于 OIE推薦ELISA和蛋白 p30為抗原建立的ELISA方法的敏感性，為ASF的抗體血清學(xué)檢測(cè)提供了更多選擇。

3 結(jié)語

ASF可通過動(dòng)物產(chǎn)品的國(guó)際、國(guó)內(nèi)貿(mào)易，邊境互市，野生動(dòng)物遷徙和昆蟲媒介等途徑傳播，該病的高發(fā)病率和高致死率不僅給養(yǎng)豬業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。ASFV感染的靶細(xì)胞是豬的單核巨噬細(xì)胞系統(tǒng)，并以其特有基因編碼數(shù)量眾多、機(jī)制復(fù)雜的病毒蛋白參與ASFV吸附、侵入宿主細(xì)胞、病毒復(fù)制與裝配、逃避宿主免疫防御系統(tǒng)等功能，使病毒能更有效地感染宿主細(xì)胞，引起豬的急性、熱性、出血性的臨床癥狀和病理損害。深入地研究ASFV編碼基因及相關(guān)蛋白的功能，探討ASFV對(duì)宿主細(xì)胞的感染機(jī)制，將為 ASF的預(yù)防和控制以及 ASFV疫苗的探索研究提供重要的理論依據(jù)。目前，隨著對(duì)ASFV生物特性和分子特性研究的不斷深入，已從 ASFV感染的細(xì)胞中分離鑒定出至少54種病毒蛋白。雖然有些病毒蛋白的功能尚不清楚，但隨著對(duì)ASFV研究的不斷深入，ASFV的致病機(jī)制將會(huì)越來越清晰。目前，尚無有效的疫苗來預(yù)防ASF，因此快速、敏感、特異的檢測(cè)方法對(duì)ASF傳播流行的監(jiān)測(cè)至關(guān)重要，建立及應(yīng)用敏感和特異的病原學(xué)診斷方法為ASF的有效防控及根除措施的實(shí)施奠定了基礎(chǔ)。

（摘自《中國(guó)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào)》2012年第10期）