□ 趙文靜 內(nèi)蒙古自治區(qū)產(chǎn)品質(zhì)量檢驗研究院 崔騰飛 陳錦華 寧夏大學(xué)農(nóng)學(xué)院

1 引言

在單一食品中，牛乳被稱為為數(shù)不多的營養(yǎng)完全食品之一[1-2]。原料乳（生鮮牛奶）含有蛋白質(zhì)、脂肪、乳糖和各種維生素以及礦物質(zhì)等一百多種人體需要的營養(yǎng)元素，但也正是因為如此，原料乳中蛋白質(zhì)等營養(yǎng)物質(zhì)極易被微生物分解利用，在貯藏過程中生長、繁殖，導(dǎo)致原料乳品質(zhì)變化。原料乳位于奶業(yè)產(chǎn)業(yè)鏈的最上游，所以其質(zhì)量安全將直接影響到乳制品的質(zhì)量與安全，而原料乳細菌總數(shù)是衡量生牛乳原料的重要指標，所以檢測原料乳細菌總數(shù)對控制原料乳質(zhì)量與安全至關(guān)重要。

傳統(tǒng)檢測原料乳中細菌總數(shù)指標按照GB478.2-2010方法進行的，此檢測方法是基于平板培養(yǎng)和菌落計數(shù)，需耗時48 h，且檢測結(jié)果也存在著嚴重的滯后性，并且容易導(dǎo)致在原料奶的儲藏和運輸環(huán)節(jié)造成二次污染，無法滿足原料乳快速、安全等的驗收要求。因此，實時、快速、準確地檢測原料乳中細菌總數(shù)對加強原料乳質(zhì)量控制具有重要的現(xiàn)實意義?，F(xiàn)今用于原料乳快速檢測方法有顯微鏡檢測、流式細胞計數(shù)法45、還原實驗法光電法、ATP熒光計數(shù)法、PCR技術(shù)等。各種方法各有優(yōu)缺點，但沒有一項技術(shù)同時具有快速、準確、無需樣品預(yù)處理、實時、無損等優(yōu)點，高光譜成像技術(shù)是基于非常多窄波段的影像數(shù)據(jù)技術(shù)，具有非常豐富的吸收譜帶，能夠識別樣品的大量信息，并將圖譜合二為一，是單一的光譜或者圖譜無法比擬的，最大的特點是能夠?qū)资畟€乃至幾百個窄波段以進行連續(xù)的光譜覆蓋，而且光譜分辨率高、操作方便等[2-3]，用平均光譜反映樣本，建立原料乳檢測模型、相關(guān)性好，能夠滿足方便、快速、無損、準確等檢測原料乳細菌總數(shù)的要求。

本文以原料乳為研究對象，利用可見/近紅外高光譜成像技術(shù)采集樣品400～1 000 nm的光譜數(shù)據(jù)，選取正交信號校正法（orthogonal signal correction，OSC）、多元散射校正（Multiple Scattering Correction，MSC）、 卷 積平 滑（Savitzky－ Golay，SG） 3種預(yù)處理方法減少噪音干擾，結(jié)合PLSR建模方法優(yōu)選最佳的預(yù)處理方法；使用連續(xù)投影算法（Successie Projection Algorithm，SPA）、 無 信息消除變量（Uninformative Variable Elimination，UVE）等2種數(shù)據(jù)降維方法，結(jié)合使用偏最小二乘回歸（partial least squares regression，PLSR） 建模方法分別對全波段和特征波段建模；選取最優(yōu)模型，為原料乳中細菌總數(shù)的快速檢測奠定理論基礎(chǔ)。

2 實驗

2.1 材料與試劑

樣品來源于寧夏銀川市平吉堡牧場乳樣，每份原料乳為100 mL。將獲得的奶罐新鮮乳樣快速置于滅菌取樣瓶中，4 ℃恒溫保溫箱帶回實驗室，編號之后置于冰箱中4 ℃冷藏。每天測試一次（貯藏期1～7 d，共計七次），每次隨機取20個乳樣作為試驗樣本，用于高光譜數(shù)據(jù)采集和測定細菌總數(shù)。

2.2 儀器

實驗過程中使用的儀器主要為：Hyper Spec VIS/NIR 高光譜成像系統(tǒng)（美國Headwall Photonics 公司），如圖1所示。

2.3 高光譜信息采集

為避免圖像采集時環(huán)境光的干擾，獲得更加精確的數(shù)據(jù)，高光譜圖像數(shù)據(jù)采集前，預(yù)先根據(jù)光源的照度設(shè)定好高光譜攝像頭曝光時間以保證圖像清晰，并調(diào)整好輸送裝置的速度以避免圖像空間分辨率失真。采集光譜圖像前需對高光譜進行預(yù)熱[3]和參數(shù)設(shè)定，半小時后應(yīng)對儀器進行校準[4]。通過多次預(yù)實驗確定了最終光譜掃描的參數(shù)：物距為400 mm，輸送裝置的步距為180 μm/s，成像光譜儀的曝光時間為35 ms，掃描起始位置90 mm，掃描線實際長度為60 mm。

圖像采集前，為減弱成像光譜儀暗電流和室內(nèi)照明對圖像的影響，應(yīng)在暗室進行操作儀器，避免雜散光對采集樣本的干擾。同時需對儀器進行黑白校正[5]，如公式（1）所示。

圖1 VIS/NIR 高光譜成像系統(tǒng)

式（1）中：RO是樣本原始的漫反射光譜圖像，W是白板的漫反射圖像（反射率約100%），D是暗圖像（反射率0%），R是校正后的漫反射光譜圖像。

2.4 細菌總數(shù)的測定

2.4.1 測定方法

參照食品安全國家標準GB 4789.2-2010[6]，采用平板計數(shù)法對乳中細菌總數(shù)進行測定。具體方法如下。

（1）稀釋：取原料乳，充分搖混，使樣品呈均勻狀態(tài)。以十倍稀釋法，將原料乳稀釋成10-1、10-2、l0-3、l0-4、10-5系列。

（2） 接種：從最大稀釋度開始，各取l mL l0-3、10-4、10-5的原料乳稀釋液，分別放入已標記好的培養(yǎng)皿內(nèi)。培養(yǎng)基融化，待冷至45 ℃左右時，在火焰旁倒入培養(yǎng)皿內(nèi)，細菌總數(shù)對應(yīng)PCA培養(yǎng)基，倒完迅速蓋好，放在桌面上輕輕搖轉(zhuǎn)，使稀釋的樣品與培養(yǎng)基均勻混合，待平板冷卻固化后，倒置。

（3）培養(yǎng)：于合適的培養(yǎng)溫度下培養(yǎng)一定的時間，對應(yīng)細菌總數(shù)選擇PCA合成培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)48小時。

（4） 計數(shù)：所有平板在培養(yǎng)到足夠的時間后，選擇每皿出現(xiàn)30～300個菌落的稀釋度為準，計算出每毫升牛奶中含細菌總數(shù)。計算公式如下。① 若只有一個稀釋度平板上的菌落數(shù)在適宜計數(shù)范圍內(nèi)，N每毫升樣品中總活菌數(shù)=同一稀釋度兩次重復(fù)的菌落平均數(shù)×稀釋倍數(shù)×10；②若有兩個連續(xù)稀釋度的平板菌落數(shù)在適宜計數(shù)范圍內(nèi)時，按公式（2）計算：N= ∑ C/(n1+0.1n2)d 。

式（2）中：N——樣品中菌落總數(shù)；∑C——（含適宜范圍菌落數(shù)的平板）；n1——第一稀釋度（低稀釋倍數(shù)），n2——第二稀釋度(高稀釋倍數(shù))，d——稀釋因子（第一稀釋度）。

2.4.2 平板計數(shù)瓊脂（PCA）

胰蛋白胨5.0 g/L，酵母浸粉2.5 g/L，葡萄糖瓊脂1.0 g/L，瓊脂15.0 g/L,加熱溶解于1 000 mL蒸餾水中，調(diào)pH值7.0，分裝三角瓶，121 ℃高壓滅菌15分鐘，備用。取適宜稀釋得樣品液1 mL，加入無菌平皿中心，傾入冷至44～46 ℃的平板計數(shù)瓊脂，混勻，待瓊脂凝固后，放置36 ℃培養(yǎng)48小時進行計數(shù)菌落。

2.5 圖像處理

利用高光譜成像系統(tǒng)采集樣品圖像后，使用ENVI4.6（ Research System Inc，USA）軟件選取感興趣區(qū)域（Region of Interest，ROI），計算出的平均光譜值作為反射光譜。

2.5.1 模型建立

樣本在采集光譜時，由于儀器噪音、暗電流等因素的影響，導(dǎo)致光譜曲線產(chǎn)生不重復(fù)和基線漂移等現(xiàn)象[7-8]，本文采用 MSC[9]、SG[10]、OSC[11]三種預(yù)處理方法對原始光譜進行處理，多元散射校正（MSC）去除高光譜漫反射光譜中樣品的鏡面反射及不均勻性造成的噪聲，消除漫反射光譜的基線漂移及光譜不重復(fù)性，在光譜與濃度線性關(guān)系較好和組分性質(zhì)相似的情況下，MSC校正的效果較好；卷積平滑（SG）盡可能減小平滑對有用信息的影響；SG+MSC兩種預(yù)處理方法相結(jié)合，可以更好地減少干擾，因此，獲得更多有用信息。光譜預(yù)處理后采用偏最小二乘回歸（PLSR）法建立模型。其PLSR方法是一種全新的回歸模型方法，在模型預(yù)測研究中應(yīng)用較為廣泛。PLSR方法結(jié)合了多元線性回歸（MLR）與主成分分析（PCR）兩種方法的優(yōu)勢。在光譜矩陣中，對自變量X相互正交方向上最大方差主成分提取，同時對應(yīng)變量實測值剪切力Y中光譜矩陣進行冗余信息降維處理，并將Y光譜矩陣引入X矩陣中進行快速分解，同時計算每一個新的主成分數(shù)前，將X得分與Y得分進行交換，使得X主成分數(shù)與剪切力Y最大程度的直接相關(guān)聯(lián)，其作用是消除變量多重共線性，也充分利用了光譜數(shù)值、吸收值與剪切力之間的線性關(guān)系，使得模型預(yù)測能力最大程度提高。

2.5.2 模型評判

采用PLSR建立乳中細菌總數(shù)預(yù)測模型。通過校正集相關(guān)系數(shù)（Rc）與校正集均方根誤差（rootmean-square error of calibration set，RMSEC）、預(yù)測集相關(guān)系數(shù)（Rp）與預(yù)測集均方根誤差（rootmean-square error of prediction set,RMSEP）以及交互驗證均方根誤差（RMSECV）指標進行模型的性能評價。Rc、Rp值越高，其模型相關(guān)性越好；RMSEC、RMSECV、RMSEP值 越低，其模型預(yù)測能力越好。因此，利用PLSR方法所建立效果較好的模型應(yīng)具有較高的Rc、Rcv、Rp與較低的RMSEC、RMSECV、RMSEP 值[12]。除此之外，也可以利用Rc+Rp說明模型總體的乳中細菌總數(shù)檢測精度[13]。

2.6 數(shù)據(jù)分析

The Unscrambler X 10.4軟件對光譜預(yù)處理，圖像分析軟件為ENVI 4.6，Matlab R2014a軟件進行建模、劃分樣本集，繪圖軟件為origin 8。

3 結(jié)果與分析

3.1 篩選最佳預(yù)處理方法

本文中采用Galvao等[14]提出的 SPXY（sample set partitioning based on joint x-y distances）法，將剔除異常值的原料乳樣本按3∶1劃分為校正集樣本和驗證集樣本。

表1為原始光譜以及預(yù)處理光譜的PLSR建模結(jié)果，由相關(guān)系數(shù)、均方根誤差評價模型穩(wěn)定性，圖2為原始光譜圖?？梢钥闯鍪褂肙SC預(yù)處理方法，建模效果降低，因此，經(jīng)過預(yù)處理的光譜建模效果不一定高于原始光譜模型效果；使用其他幾種預(yù)處理方法，模型相關(guān)系數(shù)均高于原始光譜，均方根誤差低于原始光譜，說明這幾種預(yù)處理方法可以消除噪音干擾，提高建模效果；經(jīng)過數(shù)據(jù)和圖像對比分析，確定SG為最佳預(yù)處理方法。

3.2 光譜數(shù)據(jù)降維

3.2.1 SPA算法選取特征波長

SPA[15]算法可以在很大程度上精簡模型，應(yīng)用SPA選取特征波長時，設(shè)置變量范圍為5-25，歸一化處理后得到前五個波長變量下的RMSECV值，分別為 413、469、525、671、703 nm，特征波長占總波長的4%。

3.3.2 UVE提取特征變量

使用UVE[16]提取原料乳光譜特征波長，運行程序得到輸入變量的穩(wěn)定性結(jié)果，如圖4所示。

圖4豎線左右兩側(cè)各為125個變量（左邊為波長變量，右邊為隨機變量）。用此方法共選取了13個特征波長，分別為 416、479、501、503、517、598、634、658、667、692、711、852、981 nm，特征波長占總波長的10.4%。

表1 不同預(yù)處理方法的PLSR模型

圖2 原始光譜圖

圖3 SPA提取的特征波長數(shù)

圖4 UVE-PLSR穩(wěn)定性分布曲線

表2 不同波長提取方法建立的PLS模型的結(jié)果

3.4 建立模型

對全波段和特征波段分別建立PLSR模型，見表2。整體來看，使用SPA算法提取特征變量數(shù)后的建模效果稍高于全波段模型，而UVE建模效果不如全波段建模效果；對比分析3種模型，建模效果最優(yōu)的是SPA+PLAR，Rc、Rp分別為0.91 95、0.821 4。

4 結(jié)論

本文以原料乳為研究對象，采集原料乳400～1 000 nm的光譜圖像，提取反射光譜，同時采用平板計數(shù)法對乳中細菌總數(shù)進行測定，對光譜值和化學(xué)值建立PLSR模型，高光譜成像技術(shù)可以實現(xiàn)原料乳中細菌總數(shù)預(yù)測。主要結(jié)論如下。

（1）對原始光譜采用3種方法進行預(yù)處理，通過對比分析數(shù)據(jù)和圖像信息，確定SG為最佳預(yù)處理方法，該預(yù)處理方法降低了噪音，去掉了無用信息，提高了建模效果，結(jié)果：Rc、Rp為0.9190、0.8109。

（2）基于最優(yōu)預(yù)處理方法，使用了2種數(shù)據(jù)降維方法，提取特征波長數(shù)分別為5、13，占到全波段的4%、10.4%。

（3）對以上2種降維處理數(shù)據(jù)分別建立PLSR模型，SPA+PLAR為最優(yōu)模型，Rc、Rp分別為0.919 5、0.821 4，提取特征波長可減少冗長數(shù)據(jù)，降低維數(shù)，實現(xiàn)快速檢測。