周永軍，張輝，牛中奇

1.咸陽(yáng)師范學(xué)院物理與電子工程學(xué)院，陜西咸陽(yáng)712000；2.西安電子科技大學(xué)電子工程學(xué)院，陜西西安710071

前言

極低頻（Extremely Low Frequency,ELF）電磁環(huán)境是指頻率在3～1 000 Hz的交變電磁場(chǎng)環(huán)境［1］。隨著工業(yè)化、信息化技術(shù)的快速發(fā)展及其產(chǎn)品的廣泛使用，人類無(wú)時(shí)無(wú)刻不暴露在ELF電磁環(huán)境中且暴露的ELF電磁功率密度也越來(lái)越大。早在1975年就有環(huán)境科學(xué)家預(yù)言，人類生存環(huán)境空間電磁能量密度將每年增加7%～14%，照此速度，2125年人類生存環(huán)境空間電磁能量密度是1975年的700倍［2］。毫無(wú)疑問(wèn)，ELF電磁環(huán)境污染將是今后人類所面臨且必須應(yīng)對(duì)的問(wèn)題之一。

自1979年Wertheimer等［3］首次報(bào)道大電流配電站附近ELF電磁暴露感應(yīng)強(qiáng)度高低與兒童癌癥發(fā)病幾率相關(guān)以來(lái)，ELF電磁暴露對(duì)健康影響問(wèn)題受到了越來(lái)越多的關(guān)注［4-6］。目前，雖然ELF電磁暴露生物效應(yīng)研究已從流行病學(xué)調(diào)查逐步深入到細(xì)胞及分子水平，但對(duì)ELF電磁暴露生物學(xué)效應(yīng)，如量效關(guān)系、效應(yīng)閾值、致傷機(jī)理等方面仍缺乏令人信服的結(jié)論。因此，繼續(xù)深入開(kāi)展ELF電磁暴露生物學(xué)效應(yīng)研究仍具有十分重要的意義。

眾所周知，細(xì)胞是生物體形態(tài)結(jié)構(gòu)和生命活動(dòng)的基本單位，細(xì)胞無(wú)論是在培養(yǎng)中或在肌體內(nèi)，其行為的基本規(guī)律是一樣的，加之實(shí)驗(yàn)過(guò)程在某種程度上是在可控環(huán)境中進(jìn)行且基于細(xì)胞的機(jī)理分析研究對(duì)象又相對(duì)清晰，所以建立在細(xì)胞基礎(chǔ)上的實(shí)驗(yàn)研究、機(jī)理分析仍然是探索ELF電磁生物學(xué)效應(yīng)的重要手段。

細(xì)胞內(nèi)自由鈣離子作為維持細(xì)胞正常新陳代謝和生理機(jī)能的第二信使，控制著細(xì)胞的許多生理、生化過(guò)程，而ELF電磁環(huán)境是包含人類在內(nèi)整個(gè)生物界生存和發(fā)展的一個(gè)重要環(huán)境因素。有研究表明，胞間信號(hào)分子（如胰島素）和胞內(nèi)第二信使（自由鈣離子）等是電磁場(chǎng)與細(xì)胞相互作用的重要場(chǎng)所［7-9］。所以，研究ELF電磁暴露對(duì)細(xì)胞內(nèi)自由鈣離子跨膜遷移的影響及機(jī)理無(wú)疑對(duì)開(kāi)展ELF電磁暴露的防護(hù)、合理開(kāi)發(fā)利用從而促進(jìn)人類健康發(fā)展具有重要意義?；诖耍匀梭w肝癌細(xì)胞為研究對(duì)象，實(shí)驗(yàn)研究ELF電磁暴露對(duì)鈣離子跨膜遷移的影響，在注重細(xì)胞膜離子通道物理、生物特性基礎(chǔ)上探討ELF電磁暴露對(duì)鈣離子跨膜遷移影響的機(jī)理。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 實(shí)驗(yàn)試劑、設(shè)備和方法

1.1.1 試劑 （1）M1640培養(yǎng)基（Gibco Brc公司），小牛血清（杭州四季青生物工程材料研究所），F(xiàn)luo-3（美國(guó)BIO-RAD產(chǎn)品），二甲基亞砜（DMSO），胰蛋白酶（華美生物工程公司）；（2）Hank's液［10］（用國(guó)產(chǎn)分析純和超純水配制）：NaCl 8.00 g/L；KCl 0.40 g/L；MgSO4·7H2O 0.20 g/L；Na2HPO4·12H2O 0.12 g/L；KH2PO40.06 g/L；CaCl20.14 g/L；NaHCO30.35 g/L。

1.1.2 儀器設(shè)備

（1）實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)設(shè)備：YB1561功率信號(hào)函數(shù)發(fā)生器（江蘇揚(yáng)中電子儀器廠）；YB2172交流毫伏表（江蘇揚(yáng)中電子儀器廠）；V-252示波器，電磁暴露小室（西安電子科技大學(xué)電子工程學(xué)院）；SWK-1溫度控制儀；MC數(shù)字溫度計(jì)；50 Ω匹配負(fù)載；（2）LSCM激光掃描共聚焦顯微鏡。

1.2 細(xì)胞樣品制備與熒光負(fù)載

1.2.1 細(xì)胞樣品制備 將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期人體肝癌細(xì)胞株（7721）經(jīng)胰蛋白酶制成單層懸液，并用苔盼藍(lán)染液計(jì)數(shù)檢驗(yàn)細(xì)胞成活率，當(dāng)成活率達(dá)95%以上時(shí)，將該單層懸液接種于特制的50 mm培養(yǎng)皿（培養(yǎng)皿下底部中央開(kāi)一個(gè)直經(jīng)約為10 mm小孔，從下方粘貼一個(gè)蓋玻片）底部的載玻片上，加入1640培養(yǎng)液（含10%小牛血清）置于含5%二氧化碳，溫度37℃培養(yǎng)箱中孵育24 h。

1.2.2 熒光負(fù)載 將一支50μg的Fluo-3熒光探針加入到50μL的二甲基亞砜中，待熒光探針溶化后將其均勻分裝在10個(gè)小瓶并存儲(chǔ)于-20℃環(huán)境，取一小瓶并將其注入500μL Hank's液后搖勻用于細(xì)胞熒光負(fù)載。細(xì)胞熒光負(fù)載時(shí)首先在24～35℃避光條件下用純Hank's液（pH值為7.0±0.1）洗滌樣本細(xì)胞2～3次，再將洗滌后的樣本細(xì)胞同上述制備的含有Fluo-3的Hank's液一起孵育30 min（待細(xì)胞內(nèi)聚集足夠高濃度的熒光探針），再用純Hank's液沖洗細(xì)胞樣本多次以便徹底洗掉細(xì)胞外熒光探針，至此制備完成細(xì)胞樣品熒光負(fù)載。

1.3 實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)搭建及數(shù)據(jù)獲得

1.3.1 實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)搭建 為了觀察ELF電磁暴露對(duì)鈣離子跨膜遷移的影響，需將熒光負(fù)載后的細(xì)胞樣品置于ELF電磁環(huán)境中暴露一定時(shí)間，同時(shí)考慮實(shí)驗(yàn)盡可能不污染環(huán)境及屏蔽外來(lái)電磁的干擾。本文采用第1.1.2節(jié)中所示儀器搭建實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)的原理圖如圖1所示，其中溫控設(shè)備一方面是為了滿足生物樣品的生理需求，另一方面是確保實(shí)驗(yàn)產(chǎn)生的非熱生物效應(yīng)不因溫度原因而淹沒(méi)。整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程溫度保持在（35.0±0.2）℃，磁場(chǎng)強(qiáng)度為1.78×10-7T。

1.3.2 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)獲得 待細(xì)胞樣品熒光負(fù)載后即刻用激光共聚焦掃描顯微鏡對(duì)細(xì)胞樣品胞漿中的熒光強(qiáng)度和本底熒光強(qiáng)度（培養(yǎng)皿內(nèi)細(xì)胞外培養(yǎng)基中殘留的熒光強(qiáng)度）進(jìn)行測(cè)量，被測(cè)細(xì)胞胞漿內(nèi)熒光強(qiáng)度減去本底熒光強(qiáng)度便是對(duì)照組樣品熒光強(qiáng)度數(shù)據(jù)，然后即刻將樣品置入預(yù)設(shè)ELF電磁參數(shù)暴露小室內(nèi)暴露20 min，再用激光共聚焦掃描顯微鏡樣品細(xì)胞胞漿內(nèi)熒光強(qiáng)度和本底熒光強(qiáng)度進(jìn)行檢測(cè)，被測(cè)細(xì)胞胞漿內(nèi)熒光強(qiáng)度減去本底熒光強(qiáng)度便是暴露組樣品熒光強(qiáng)度數(shù)據(jù)。在足夠多樣本上獲得對(duì)照組和暴露組數(shù)據(jù)后，將暴露組和對(duì)照組數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理便得到實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果

樣品細(xì)胞經(jīng)ELF電磁暴露前后鈣離子跨膜遷移量統(tǒng)計(jì)如表1所示。從表1所列7組數(shù)據(jù)可以看出，f=16 Hz且EP=53 V m、f=45 Hz且EP=53 V m以及f=16 Hz且EP=80 V m的ELF電磁暴露可使暴露組樣品鈣離子遷移量顯著高于對(duì)照組（P＜0.001，P＜0.005,P＜0.001）；而f=32 Hz且EP=53 V m、f=60 Hz且EP=53 V m、f=16 Hz且EP=26 V m以及f=16 Hz且EP=87 V m的ELF電磁暴露未使暴露組樣品鈣離子遷移量顯著高于對(duì)照組（P＞0.10,P＞0.05,P＞0.01,P＞0.10）。

表1 ELF電磁暴露對(duì)鈣離子跨膜遷移的影響Tab.1 Effects of ELF electromagnetic exposure on calcium ion transmembrane migration

3 討論

當(dāng)暴露組數(shù)據(jù)與對(duì)照組數(shù)據(jù)存在顯著性差異時(shí)，才認(rèn)為該組ELF電磁暴露可顯著影響鈣離子跨膜遷移率，否則認(rèn)為該組ELF電磁暴露未影響細(xì)胞內(nèi)自由鈣離子跨膜遷移率。

從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知并非實(shí)驗(yàn)所用ELF電磁暴露均能顯著影響鈣離子跨膜遷移，另外由于ELF電磁暴露攜帶能量很低（幾乎淹沒(méi)于分子的熱運(yùn)動(dòng)），鈣離子是如何獲得ELF電磁暴露所提供的能量實(shí)現(xiàn)跨膜遷移？科研工作者雖已從不同角度提出多種理論進(jìn)行闡釋，但至今仍缺乏令人信服的結(jié)論［11］。

有研究表明細(xì)胞內(nèi)、外離子遷移是通過(guò)跨接在細(xì)胞膜兩端由α-螺旋蛋白質(zhì)分子構(gòu)成的離子通道來(lái)完成，而離子通道存在一定勢(shì)壘，且其勢(shì)壘呈現(xiàn)出兩端較高，中間沿軸線呈周期性分布的特點(diǎn)［12］。對(duì)于本文而言，影響鈣離子跨膜遷移的因子只有ELF電磁環(huán)境，由于其攜帶的能量很低（幾乎淹沒(méi)于分子的熱運(yùn)動(dòng)），那么細(xì)胞內(nèi)帶電粒子是如何克服離子通道內(nèi)勢(shì)壘阻礙產(chǎn)生顯著遷移？有研究表明細(xì)胞里的各種“細(xì)胞器”均包裹在由磷脂形成的雙分子膜里，它既非液體、亦非固體，而更接近液體晶體［13］；生物組織是以細(xì)胞為基元吸收電磁能量的［14-15］；細(xì)胞膜是ELF電磁作用的初始靶點(diǎn)［16］。當(dāng)作用于介質(zhì)的外部場(chǎng)強(qiáng)達(dá)107V/m量級(jí)時(shí)，介質(zhì)就會(huì)表現(xiàn)出明顯的非線性特征［17］。對(duì)跨接在細(xì)胞膜兩端由α-螺旋蛋白質(zhì)分子構(gòu)成的離子通道而言，其內(nèi)部場(chǎng)強(qiáng)卻已達(dá)到這個(gè)數(shù)量級(jí)（這是因?yàn)檎Ｐ玛惔x細(xì)胞膜內(nèi)外存在102mV靜息膜電位，而細(xì)胞膜厚度為10 nm量級(jí)），因此細(xì)胞膜離子通道的非線性極化特性就不容忽視。細(xì)胞膜離子通道的非線性特性可使入射電磁能量聚焦在一定區(qū)域內(nèi)，從而使該區(qū)域的帶電粒子獲得遠(yuǎn)大于入射電磁能量的能量，從而實(shí)現(xiàn)跨越一個(gè)或多個(gè)勢(shì)壘做軸向運(yùn)動(dòng)，當(dāng)在運(yùn)動(dòng)后的位置上再次獲得能量時(shí)，便可再次跨越一個(gè)或多個(gè)勢(shì)壘，此過(guò)程周而復(fù)始直至離子穿出離子通道。但是根據(jù)表1看到，并非所有高于某個(gè)閾值的電磁能量都可引起生物學(xué)效應(yīng)，這又是什么原因？離子通道內(nèi)沿軸線周期性勢(shì)壘分布意味著帶電粒子要沿著軸向運(yùn)動(dòng)所需能量是某一基本能量單元的整數(shù)倍，而這個(gè)基本能量單元W0與勢(shì)壘高度U的關(guān)系為：

其中，q為帶電粒子的電量，U為周期性分布勢(shì)壘的振幅。如果要能夠跨越一個(gè)或幾個(gè)勢(shì)壘，則帶電粒子所獲得的能量就應(yīng)為基本能量單元的一倍或幾倍，即：

這就要求為帶電粒子提供能量的聚焦于局部區(qū)域電磁場(chǎng)能量應(yīng)是以勢(shì)壘高度為基本能量單元的整數(shù)倍。在離子通道自身聚焦特性確定條件下，聚焦于局部電磁能量與入射電磁能量有確定性關(guān)系，而電磁場(chǎng)能量又與電場(chǎng)強(qiáng)度平方成正比例，故要求入射電磁場(chǎng)電場(chǎng)強(qiáng)度也要滿足一定比例關(guān)系時(shí)（即具有量子化特征）才能顯著影響帶電粒子跨膜遷移（即只有特定電場(chǎng)強(qiáng)度的ELF電磁暴露才能顯著影響帶電粒子跨膜遷移）。

另外從表1還可看出要產(chǎn)生生物學(xué)效應(yīng)，除了電場(chǎng)強(qiáng)度滿足上述條件外，入射電磁場(chǎng)頻率也要滿足一定要求。由于細(xì)胞膜離子通道具有單向通透性，因此在ELF電磁的一個(gè)周期內(nèi)，只有半個(gè)周期電場(chǎng)方向是沿場(chǎng)方向才能對(duì)帶電粒子施加沿場(chǎng)方向運(yùn)動(dòng)的力促使其跨膜遷移。故帶電粒子沿場(chǎng)方向跨越一個(gè)勢(shì)壘所用時(shí)間τ與ELF電磁周期T間必須滿足以下關(guān)系：

其中，n為半個(gè)周期內(nèi)跨越勢(shì)壘個(gè)數(shù)。式（3）表明只有ELF電磁半個(gè)周期正好等于跨越一個(gè)勢(shì)壘所需時(shí)間τ的整數(shù)倍時(shí)，才有助于帶電粒子跨越整數(shù)倍個(gè)勢(shì)壘。這意味ELF電磁的周期也需滿足一定的要求，由于頻率和周期成倒數(shù)關(guān)系［即f=1T(ω=2πT)］，結(jié)合式（3）可得：

式（4）表明：（1）能使帶電粒子跨越勢(shì)壘的ELF電磁頻率是一組離散的特定頻率；（2）該組離散頻率中有一閾值fc，其它頻率是該閾值的整數(shù)倍。這與實(shí)驗(yàn)結(jié)果相一致（f=16 Hz、f=45 Hz能促進(jìn)離子跨膜遷移，而f=60 Hz不可以）。

本文研究ELF電磁暴露對(duì)鈣離子跨膜遷移的影響，并在注重細(xì)胞膜離子通道物理、生物特性基礎(chǔ)上探討ELF電磁暴露對(duì)鈣離子跨膜遷移的影響機(jī)理，這可為ELF電磁暴露風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估及其合理開(kāi)發(fā)利用提供具有一定參考價(jià)值的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)和理論依據(jù)。