徐志善，孫欽軍，王錫念，包建強，2，3，*

(1.上海海洋大學食品學院，上海201306;2.上海水產品加工及貯藏工程技術研究中心，上海201306;3.農業(yè)部水產品貯藏保鮮質量安全風險評估實驗室(上海)，上海201306)

中華絨螯蟹(Eriocheir sinensis)又名河蟹、大閘蟹、毛腳蟹等，廣泛分布于我國沿海、湖泊地區(qū)［1］。近年來，河蟹養(yǎng)殖規(guī)模迅速擴大，2015年全國蟹類(專指河蟹)產量 82.33萬噸，比 2014年增加了3.36%［2］。河蟹養(yǎng)殖過程中，性早熟問題尤為突出，這種河蟹被稱為早熟蟹，性腺發(fā)育成熟，個體較大(通常 20 g以上)［3］。因其繼續(xù)養(yǎng)殖死亡率高達60%～90%，且體重遠低于成蟹(100～200 g/只)，不具備養(yǎng)殖價值［4］。我國早熟蟹年產量20萬噸左右，占總產量的20%～30%［3］?？梢?，對早熟蟹加工利用，可提高養(yǎng)殖戶的經濟效益，具有巨大的發(fā)展?jié)摿Α?/p>

為了滿足市場需求，延長產品的保質期，對于不能及時加工的早熟蟹通常采用凍藏保藏。秦輝［5］研究發(fā)現(xiàn)，－24℃凍藏可減緩中華絨螯蟹品質劣化，較好地保持蟹肉的品質。凍藏早熟蟹在加工前需先解凍，解凍方式的選擇尤為重要，如果處理不當，將會造成脂肪氧化、蛋白質降解、呈味氨基酸減少等，嚴重影響產品的品質和風味。目前常見的解凍方式有微波解凍、流水解凍、空氣解凍等［6］。曹榮等［7］研究發(fā)現(xiàn)，低溫空氣解凍、室溫空氣解凍、靜水解凍、流水解凍對三疣梭子蟹感官特征和部分理化指標均有顯著影響，靜水解凍適合解凍三疣梭子蟹。姜晴晴等［8］研究了低溫解凍、微波解凍、流水解凍、自然解凍對帶魚蛋白性質及肌肉品質的影響，結果發(fā)現(xiàn)，低溫解凍后帶魚品質較好，適合帶魚的解凍。但是目前關于早熟中華絨螯蟹解凍方式的理論研究較少，尤其是關于解凍方式對早熟蟹蟹肉蛋白生化特性及游離氨基酸等重要指標的理論研究較少。

本研究以性早熟的中華絨螯蟹為實驗材料，探討不同解凍方式對蟹肉品質和滋味的影響，以期找出合適的解凍方式，減少解凍環(huán)節(jié)對樣品的破壞，最大程度地保留蟹肉原有的品質，為今后早熟蟹的加工提供理論指導。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

早熟中華絨螯蟹 興化地區(qū)河蟹養(yǎng)殖基地，選取活力較強的清洗瀝干后，分裝于自封袋中放入－50℃超低溫環(huán)境中快速凍結，凍結完成后取所需實驗原料，貯藏在－18 ℃的冰箱中，備用;5，5－二疏基－2，2－二硝基苯甲酸(DTNB) 源葉生物科技有限公司;Maleat(順丁烯二酸)、Tris(三羥甲基氨基甲烷) 國藥集團化學試劑有限公司;其余試劑 國產分析純。

UV－757型紫外分光光度計 杭州科曉儀器有限公司;SX620型pH測定儀 上海三信儀表廠;H1850R型冷凍離心機 北京北利離心機有限公司;LRH－50CA型低溫恒溫培養(yǎng)箱 恒科儀器有限公司;90－2型數顯恒溫磁力攪拌器 金壇市宏業(yè)實驗儀器廠;BC/D－429H型冰箱 江蘇海爾股份有限公司;L－8800型氨基酸自動分析儀 日立公司;TES－1384型四通道溫度記錄儀 泰仕電子工業(yè)股份有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 早熟蟹蟹肉的解凍 低溫解凍:將溫度傳感器的探頭插入蟹肉中心，早熟蟹放置于不銹鋼鐵盤上，置于培養(yǎng)箱(4±0.5)℃內解凍，記錄早熟蟹中心溫度的變化情況，蟹肉中心溫度達到0℃為解凍終點。

微波解凍:將早熟蟹放入燒杯中，置于微波爐內，解凍功率設為150 MHz，蟹肉中心溫度達到0℃為解凍終點。

自然解凍:將早熟蟹從－18℃冰箱中取出，放在不銹鋼拖盤中，在恒溫箱(15±0.5)℃內解凍，以螃蟹蟹肉中心溫度達到0℃為解凍終點。

流水解凍:將樣品從－18℃冰箱中取出，封裝于自封袋內，放入塑料盆中，打開實驗室水龍頭，流水解凍，水流流速100 mL/s，水溫(15±0.5)℃，解凍過程中水流完全沒過自封袋，蟹肉中心溫度達到0℃為解凍終點。

1.2.2 指標測定

1.2.2.1 解凍損失率的測定 參照常海軍等［9］的方法，解凍前蟹肉質量記為m1，解凍后打開蟹殼吸干蟹表面水分，質量記為m2，按照解凍損失率公式(1)計算:

1.2.2.2 蒸煮損失率的測定 參照孫天利等［10］的方法，將早熟蟹去殼去內臟取肉，準確稱取5 g蟹肉(m1)密封于蒸煮袋中，在75℃水浴鍋內保溫30 min，取出后流水冷卻，吸干蟹肉表面水分，稱重，質量記為(m2)，按公式(2)計算:

1.2.2.3 p H的測定 參照Li等［11］方法，煮沸一定量的去離子水，密封冷卻后，取45 mL加入到5 g蟹肉中，16000 r/min均質30s。均質后的樣品在4℃、10000 r/min條件下離心20 min，測定上清液的p H，試驗重復3次，取平均值。

1.2.2.4 TBA值的測定 參照Siu等［12］的方法，略加修改，稱取10 g蟹肉，加入50 mL三氯乙酸(7.5 g/100 mL，0.1 g/100 mL 乙二胺四乙酸)，均質5 min，磁力攪拌20 min后雙層濾紙過濾兩次。取一定量的上清液加入0.02 mol/L的2－硫代巴比妥酸，按體積比1∶1混勻，混勻后樣品在沸水水浴中保溫0.5 h，取出冷卻。冷卻后的樣品中加入10 mL三氯甲烷，混勻，靜置分層。取有機相在532、600 nm波長下測定吸光度值，分別記為A532nm和A600nm，按公式(3)計算:

式中，TBA值以每100 g早熟蟹蟹肉中所含丙二醛的毫克數來表示。

1.2.2.5 TVB－N值的測定 參考宋雪等［13］的研究方法，使用凱氏定氮儀測定樣品TVB－N值，實驗結果以每100 g肌肉中含氮毫克數來表示。

1.2.2.6 肌原纖維蛋白含量的測定 肌原纖維蛋白的提取:參照Yarnpakdee等［14］方法并適當修改。精確稱取5 g蟹肉，依次加入緩沖液 A(0.16 mol/L KCl，1% 曲拉通 X－100，40 mmol/L Tris－ Maleat，pH7.5)和緩沖液 B(0.16 mol/L KCl，40 mmol/L Tris－Maleat，p H7.5)各20 mL，均質 2 min。均質后的溶液在4℃、10000 r/min離心10 min，去上清液收集沉淀。沉淀中加入40 mL緩沖液B，均質、離心(4℃，10000 r/min，10 min)收集沉淀，上述步驟重復兩次。在沉淀中加入 40 mL溶液 C(0.1 mol/L NaCl，pH7.2)，經過均質、離心(4 ℃，10000 r/min，10 min)、收集沉淀。沉淀加入15 mL磷酸緩沖液(50 mmol/L，pH7.2)，均質、離心(4 ℃，10000 r/min，10 min)，收集上清液，沉淀重復上述步驟再提取一次，合并兩次收集的上清液，上清液即為肌原纖維蛋白溶液。

肌原纖維蛋白含量的測定:參考劉琴等［15］方法，取2 mL蛋白溶液加入等量的雙縮脲試劑，常溫反應30 min，測定540 nm下的吸光值，從標準曲線中計算蛋白含量。

1.2.2.7 肌原纖維蛋白總巰基和活性巰基含量的測定 總巰基含量測定:參考盧涵［16］方法適當修改。將肌原纖維蛋白濃度調節(jié)至4 mg/mL，取0.5 mL加入4.5 mL溶液A(8 mol/L尿素，1%SDS，3 mmol/L乙二胺四乙酸，0.2 mol/L Tris－HCl，pH8.0)，混勻后加0.5 mL 溶液 B(10 mmol/L DTNB，0.2 mol/L Tris－HCl，p H8.0)，40 ℃水浴 25 min，冷卻后在 412 nm 處測定吸光度值，空白為50 mmol/L磷酸緩沖液，試驗重復3次，取平均值。

活性巰基含量測定:溶液A替換為溶液C(1%SDS，3 mmol/L EDTA，0.2 mol/L Tris－HCl，pH8.0)，其它步驟同總巰基含量測定，試驗重復3次，取平均。

式中:A412是樣品在412 nm處的吸光值;n為稀釋倍數;ρ為蛋白質量濃度(mg/mL);ε為摩爾吸光系數 13600 mol－1·cm－1·L。

1.2.2.8 肌原纖維蛋白表面疏水性的測定 參考馬紀兵等［17］方法將肌原纖維蛋白稀釋至2 mg/mL，取2 mL加入200 μL溴酚藍(1 mg/mL)，振蕩10 min，離心15 min(4℃、4000 r/min)。取上清液稀釋10倍，在595 nm條件下測定樣品吸光度值。對照組為20 mmol/L磷酸緩沖液，空白選用磷酸緩沖液，試驗重復3次，取平均值。上清液吸光度對應于游離溴酚藍，溴酚藍結合量即表面疏水性指數為總溴酚藍與游離溴酚藍之差。表面疏水性按計算公式(5)計算:

式中:A對照為對照組樣品的吸光值，A樣品為樣品組吸光值。

1.2.2.9 游離氨基酸含量的測定 參考張娜［18］的游離氨基酸測定方法稍作改動，取1 g蟹肉加入5%三氯乙酸溶液15 mL，16000 r/min均質2 min，超聲處理15 min。處理樣在4℃的恒溫箱中放置24 h后離心10 min(4℃、16000 r/min)，取上清液5 mL，將其p H調節(jié)至2.0后定容到10 mL，用0.22μm水相濾膜過濾后裝入進樣瓶，使用氨基酸自動分析儀進行測定。

1.3 數據處理

使用SPSS 17.0軟件，對實驗數據進行單因素方差分析、相關性分析，結果采用平均值±標準偏差(mean±SD)表示，作圖使用Origin 8.5軟件。

2 結果與分析

2.1 不同解凍方式對早熟蟹解凍時間的影響

如圖1所示，采用四種解凍方式，樣品到達解凍終點所消耗的時間不同。微波解凍僅為5 min，通過最大冰晶帶時間最短。但是微波加熱速度較快，早熟蟹組織結構差異大，蟹腳細小，蟹腳部分變紅，樣品出現(xiàn)熟化現(xiàn)象。低溫解凍時間長達675 min，耗時最長，早熟蟹在解凍后有異味，蟹殼松散，腮絲淺棕色，肉質彈性較差。自然解凍為135 min耗時中等，解凍后有異味，肉質淺灰，彈性不足。流水解凍時間為52 min，樣品無異味，肉質白色有彈性。

圖1 不同解凍方式早熟中華絨螯蟹蟹肉中心溫度變化Fig.1 Center temperature changes of crab meat of precocious Eriocheir sinensis with different thawing methods注:圖中a、b、c、d分別為微波解凍、流水解凍、自然解凍、低溫解凍。

2.2 不同解凍方式對早熟蟹品質的影響

由表1可以得出，微波解凍損失率最高(2.89%)，這是由于微波解凍速率較快，通過最大冰晶帶時間短，破壞了樣品的細胞膜，導致蛋白質結構發(fā)生變化，汁液損失［19］。低溫解凍損失率最低(1.65%)，這是由于低溫解凍時間最長，細胞膜損傷小，蛋白結構變化小。四種解凍方式中自然解凍蒸煮損失率最高(50.99%)，這是由于解凍過程中蛋白酶活性較高，肌肉蛋白結構發(fā)生變化，持水率下降［7］。低溫解凍蒸煮損失率最低(42.69%)，流水解凍和微波解凍差異不顯著(p＞0.05)。四種解凍方式中，低溫解凍蟹肉的pH最高，為7.23，流水解凍最低，為6.95，微波解凍和自然解凍后的樣品p H無顯著性差異(p＞0.05)。低溫解凍pH最高是由于解凍時間過長，微生物繁殖代謝，樣品pH上升［20］。

表1 不同解凍方式對早熟中華絨螯蟹品質的影響Table 1 Effects of thawing methods on the quality of precocious Eriocheir sinensis

TBA值的大小可以反應脂質氧化水平的高低。樣品的酶促反應和非酶自由基變化越劇烈，TBA值越高，樣品氧化程度越高［21］。從表1可以看出，四種解凍方式中，微波解凍TBA值最高為0.29 mg/100 g，脂質氧化較為嚴重。微波解凍樣品時，加熱不均勻，導致樣品部分熟化。低溫解凍TBA值最小，脂質氧化水平最低。自然解凍和流水解凍脂質氧化程度居中。TVB－N反應蟹肉中揮發(fā)性鹽基總氮含量，蟹肉在解凍過程中微生物大量繁殖代謝，產生大量的氨和胺類，導致TVB－N值變大［22］。從表1可以看出，流水解凍與其它三種解凍方式TVB－N值差異顯著(p＜0.05)，TVB－N值較小為10.60。說明流水解凍過程中微生物繁殖較慢，產生的氨和胺類較少。

綜合上述實驗結果可知，不同解凍方式下的早熟蟹蟹肉品質差異較大，流水解凍對樣品的品質破壞較小，能夠保持樣品原來的品質，微波解凍時間較短，但是樣品氧化情況較為嚴重，自然解凍后的樣品品質一般，低溫解凍耗時最長，解凍效果較差，因此流水解凍效果較好。

2.3 不同解凍方式對蟹肉蛋白生化特性的影響

2.3.1 不同解凍方式對蟹肉肌原纖維蛋白含量的影響 從圖2可以得出，經過低溫解凍、微波解凍、自然解凍、流水解凍后的蟹肉肌原纖維蛋白含量分別為 65.66、63.56、66.49、65.57 mg/g。肌原纖維蛋白可以反應肌肉蛋白的變性程度，是重要的結構與功能蛋白［23］。圖2中四種解凍方式下蟹肉肌原纖維蛋白含量差異不顯著(p＞0.05)，說明這幾種解凍方式對蟹肉肌原纖維蛋白含量影響不大。

圖2 不同解凍方式對蟹肉肌原纖維蛋白含量的影響Fig.2 Effects of different thawing methods on the content of myofibrin in crab meat注:不同字母表示差異顯著(p＜0.05)，下同。

2.3.2 不同解凍方式對蟹肉肌原纖維蛋白總巰基和活性巰基含量的影響 從圖3可以看出，微波解凍后蟹肉的肌原纖維蛋白總巰基和活性巰基含量最低，分別為69.09、64.16 nmol/mg;自然解凍后蟹肉的肌原纖維蛋白總巰基和活性巰基含量分別為73.25、69.68 nmol/mg;流水解凍后肌原纖維蛋白總巰基和活性巰基含量分別為74.41、71.78 nmol/mg;低溫解凍后肌原纖維蛋白總巰基和活性巰基最高，分別為77.51、72.05 nmol/mg。高澤磊等［24－25］提出，巰基含量的降低可能是由于蛋白質的交聯(lián)，二硫鍵的聚集作用導致的，因此，巰基含量越高，說明蛋白氧化程度越低。以上結果表明，低溫解凍后蟹肉蛋白交聯(lián)程度低，二硫鍵聚集程度低，蛋白質氧化程度低，蟹肉品質較好，流水解凍效果僅次之。

圖3 不同解凍方式對蟹肉肌原纖維蛋白巰基含量的影響Fig.3 Effects of different thawing methods on the content of sulfhydryl in myofibrillary protein of crab meat

2.3.3 不同解凍方式對蟹肉肌原纖維蛋白表面疏水性的影響 表面疏水性可以說明蛋白表面疏水性氨基酸的含量，由于蛋白表面疏水基團的相互作用，表面疏水性氨基酸含量越高，生成的溴酚藍結合量越高，蛋白質氧化程度越高［26］。從圖4可以看出，微波解凍樣表面疏水性最高為53.54μg，蛋白變性嚴重。流水解凍后樣品表面疏水性最低為35.29μg。低溫解凍及自然解凍的樣品表面疏水性均較高。綜合比較，可以說明流水解凍對肌原纖維蛋白的破壞最小。

圖4 不同解凍方式對蟹肉肌原纖維蛋白表面疏水性的影響Fig.4 Effects of different thawing methods on surface hydrophobicity of myofibrillar protein in crab meat

2.4 不同解凍方式對早熟蟹蟹肉滋味的影響

蟹肉獨有的滋味是由于其含有特殊的呈味物質，天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、精氨酸等是蟹肉中的主要呈味氨基酸［27］。從表2可以看出，低溫解凍、微波解凍、流水解凍、自然解凍后樣品游離氨基酸含量分別為 9.499、9.745、10.645、9.751 mg/g，流水解凍樣含量最高。流水解凍后蟹肉中甘氨酸、丙氨酸、精氨酸含量分別為2.138、2.207、2.813 mg/g，均大于其呈味閥值，呈味氨基酸總量為7.158 mg/g，占總氨基酸比例最高，為67.24%;自然解凍最低，為61.63%。流水解凍后蟹肉中鮮味氨基酸和甜味氨基酸含量分別為0.320、5.059 mg/g，高于其它三種解凍方式;苦味氨基酸含量為0.468 mg/g，高于微波解凍樣，低于低溫解凍和自然解凍后的樣品。以上結果表明，流水解凍能夠較好地保留蟹肉滋味成分，因此該解凍方式適宜對凍藏早熟蟹進行解凍。

表2 不同解凍方式下的早熟中華絨螯蟹蟹肉中游離氨基酸含量的比較(mg/g)Table 2 Comparison of free amino acids contents in precocious Eriocheir sinensis meat with different thawing methods(mg/g)

3 結論

四種解凍方式中，微波解凍時間最短，為5 min，但脂質氧化嚴重，TBA值高達0.29 mg/100 g，樣品品質下降明顯;低溫解凍蒸煮損失率最低，但長時間的解凍，造成微生物大量繁殖，導致蟹肉品質較差;自然解凍時間適中，但蒸煮損失率最高，解凍樣品品質次于低溫解凍樣。流水解凍后樣品的解凍損失率、蒸煮損失率、p H、TBA值、TVB－N值較低，肌原纖維蛋白性質相對穩(wěn)定，巰基含量較高，表面疏水性低，說明流水解凍過程對樣品品質破壞最小;游離氨基酸中的呈味氨基酸含量最高，為67.24%，說明流水解凍能夠較好地保留樣品原有的滋味。因此，流水解凍適宜作為凍藏早熟蟹的解凍方式。