徐國(guó)云，翟 妞，劉萍萍，張 慧，陳千思，鄭慶霞，金立鋒，陳 霞，曹培健，周會(huì)娜

中國(guó)煙草總公司鄭州煙草研究院，鄭州高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)開發(fā)區(qū)楓楊街2號(hào) 450001

煙草質(zhì)體色素是煙草重要致香成分的前體物，不僅影響煙葉的外觀質(zhì)量，而且對(duì)香味品質(zhì)的形成也具有重要作用［1］。煙草色素含量的提高可作為栽培技術(shù)改進(jìn)和引種遺傳改良的方向之一［2］。煙草質(zhì)體色素主要包括葉綠素和類胡蘿卜素，其總量隨煙草品種、類型、發(fā)育階段、加工調(diào)制等的不同而變化［3-4］。在生長(zhǎng)成熟階段，隨煙草的不斷成熟，所有質(zhì)體色素含量均逐漸下降，但下降速率與葉片、葉位等存在一定的聯(lián)系［5］。在實(shí)際生產(chǎn)中，可以通過施加肥料、噴施激素、調(diào)整種植密度等農(nóng)藝措施來改善煙葉質(zhì)體色素含量。韓錦峰等［6］提出在煙草生長(zhǎng)期間1∶1配施芝麻餅肥和化肥可增加葉綠素含量。煙草葉面噴施多胺能夠明顯提高類胡蘿卜素含量，并對(duì)煙葉中其他致香物質(zhì)含量也有顯著影響［7］。趙銘欽等［8］研究發(fā)現(xiàn)煙苗移栽時(shí)灌溉豆?jié){發(fā)酵物可大幅度提高類胡蘿卜素和葉綠素含量。同時(shí)，還提出15 500株/hm2的種植密度可提高烤后煙葉中質(zhì)體色素及其降解產(chǎn)物的含量［9］。另外，利用基因工程手段也能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)質(zhì)體色素含量的調(diào)控。將擬南芥PSY基因在種子中特異表達(dá)后，能大幅提高種子中類胡蘿卜素的含量，其中β-胡蘿卜素的含量提高了40倍［10］。在油菜和番茄種子中過量表達(dá)與噬夏孢歐文氏菌PSY同源的基因CrtB，也能顯著提高轉(zhuǎn)基因種子中類胡蘿卜素的含量［11-12］。ε-Ohase編碼一個(gè)位于ε-LCY下游的CYP97-P450單加氧酶，該基因突變后能引起植物紫黃質(zhì)和玉米黃質(zhì)含量的增加［13］。ε-LCY的突變可造成植物體內(nèi)β-胡蘿卜素、紫黃質(zhì)、玉米黃質(zhì)等含量的增加［14-15］。

FERONIA（FER）是近年來植物細(xì)胞信號(hào)領(lǐng)域中的明星蛋白，屬于CrRLK1-L受體蛋白激酶亞家族。FER在植物界中高度保守，是植物生長(zhǎng)信號(hào)的一個(gè)重要“接收器”。研究人員最先發(fā)現(xiàn)FER在植物受精過程中發(fā)揮著重要作用，隨后越來越多的研究表明，F(xiàn)ER不僅調(diào)控植物的營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)、根毛伸長(zhǎng)及種子發(fā)育，還調(diào)控植物對(duì)干旱、溫度、金屬離子毒害等非生物脅迫以及真菌、細(xì)菌、病毒等生物脅迫的應(yīng)答［16-26］。雖然FER參與了許多生物學(xué)過程，但FER及FER-like相關(guān)基因調(diào)控質(zhì)體色素的含量鮮有報(bào)道。為此，利用生物信息學(xué)和VIGS基因沉默技術(shù)，分析了煙草類受體蛋白激酶NtFERL基因的序列特征以及沉默NtFERL后煙株的表型與質(zhì)體色素含量，旨在為深入研究NtFERL的生物學(xué)功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑和儀器

1.1.1 材料

供試材料：本氏煙草（Nicotiana benthamiana L.）和栽培煙草 K326（Nicotiana tabacum L.）均種植在人工氣候室，溫度為26~28℃，相對(duì)濕度60%，光周期為16 h光照/8 h黑暗。K326生長(zhǎng)至4葉期時(shí)，采集葉片迅速放入液氮中，充分研磨后裝入盛有TRIzol試劑的1.5 mL離心管中，-80℃保存，用于RNA的提取。在VIGS實(shí)驗(yàn)中，對(duì)正常條件下生長(zhǎng)5~6片葉（約3~4周）的本氏煙草進(jìn)行葉片注射。在沉默八氫番茄紅素脫氫酶基因（PDS）煙株出現(xiàn)漂白表型（2~3周）后進(jìn)行取材，樣品經(jīng)液氮速凍后于-80℃保存。用于VIGS實(shí)驗(yàn)的TRV1空白載體、TRV2空白載體、陽性對(duì)照TRV2-PDS載體均由本實(shí)驗(yàn)室保存。DH5α大腸桿菌感受態(tài)和GV3101農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞均購于北京天根生化科技有限公司。

1.1.2 試劑

高保真DNA聚合酶PrimeSTAR GXL DNA Polymerase、DNA凝膠回收試劑盒、質(zhì)粒DNA小量純化試劑盒、限制性內(nèi)切酶均購于大連寶生物工程有限公司；In-Fusion HD Cloning Plus試劑盒購于美國(guó)Clontech公司；cDNA合成試劑盒Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit購自瑞士Roche公司；引物合成和DNA片段測(cè)序由上海生工生物工程有限公司完成。

乙腈、異丙醇（色譜純）購于美國(guó)Fisher公司；丙酮（分析純，≥99.0%）購于天津北方化學(xué)試劑有限公司；乙酰丁香酮（Acetosyringone，AS）購于上海生工生物工程有限公司；氯化鎂、2-（N-嗎啉代）甲磺酸（Methyl ester sulfonate，MES）均購于美國(guó)Sigma公司；TRIzol試劑購于美國(guó)Invitrogen公司；標(biāo)準(zhǔn)樣品（新黃質(zhì)、紫黃質(zhì)、葉黃素、葉綠素a、葉綠素b、β-類胡蘿卜素）購于美國(guó)Chromadex公司。

1.1.3 儀器

Agilent 1100高效液相色譜儀（配備紫外檢測(cè)器和控溫單元，美國(guó)Agilent公司）；BRASON8510超聲波發(fā)生器（美國(guó)Branson公司）；LGJ-12臺(tái)式冷凍干燥機(jī)（北京松源華興科技發(fā)展有限公司）；Milli-Q超純水處理儀（美國(guó)Millipore公司）；PCR儀、移液器、離心機(jī)（德國(guó)Eppendorf公司）；ME204T/02電子天平（感量0.01 mg，瑞士梅特勒-托利多公司）；凝膠電泳儀器及成像系統(tǒng)（美國(guó)ProteinSimple公司）；Nanodrop 2000分光光度計(jì)（美國(guó)Thermo Fisher公司）。

1.2 方法

1.2.1 NtFERL基因片段擴(kuò)增及VIGS載體構(gòu)建

根據(jù)中國(guó)煙草基因組數(shù)據(jù)庫中的NtFERL基因序列，利用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)擴(kuò)增NtFERL基因3'端的特異性引物，并在引物的5'端添加載體接頭序列。NtFERL-F：5'-TCGACGACAAGACCCTG CAGTCTGATTTCGGGTTGTCTAA-3'，NtFERL-R：5'-TGAGGAGAAGAGCCCTGCAGAGGTTCCAAA GCACATCTCC-3'（下劃線為載體接頭序列）。PCR反應(yīng)體系：5×PrimerSTAR GXL Buffer 10 μL，dNTP Mixture（2.5 mmol/L）4 μL，上下游引物（10 μmol/L）各 4 μL，PrimerSTAR GXL DNA Polymerase 2 μL，cDNA 模板（100 ng/μL）1 μL，補(bǔ)充 ddH2O 至 50 μL。PCR反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性5 min；94℃ 10 s，55℃ 15 s，72℃ 30 s，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離后，切取目的條帶進(jìn)行DNA片段回收。

利用限制性內(nèi)切酶Pst I將TRV2空白載體切成線性片段，然后加入In-Fusion酶和回收的NtFERL基因片段，混合均勻后，55℃反應(yīng)15 min。反應(yīng)體系：TRV2空白載體2 μL，基因片段6 μL，5×In-Fusion酶 2 μL。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化 DH5α大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，37℃培養(yǎng)12~16 h。陽性單克隆送北京六合華大基因科技有限公司測(cè)序。將構(gòu)建成功的載體命名為TRV2-NtFERL。

1.2.2 VIGS載體的煙草轉(zhuǎn)化

利用熱激轉(zhuǎn)化法將TRV2-NtFERL、TRV2空白載體、TRV1空白載體及陽性對(duì)照TRV2-PDS質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到GV3101農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞中。將1 μg質(zhì)粒加入到農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞，輕輕混勻后冰浴30 min，在液氮中放置5 min，然后37℃水浴10 min。加入1 mL LB液體培養(yǎng)基，在28℃搖床上孵育3~4 h（180 r/min）。取 200 μL 菌液均勻涂布在含有卡那霉素和利福平的LB固體培養(yǎng)基上，于28℃培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)。得到的陽性單克隆保存于-80℃冰箱。

將保存的陽性單克隆在添加卡那霉素（50 mg/L）和利福平（25 mg/L）的LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)2 d（28 ℃）后，6 000 r/min離心15 min，棄上清并用10 mL緩沖液（10 mmol/L MES，10 mmol/L MgCl2，250 μmol/L AS）重懸菌體，使用 Nanodrop 2000 測(cè)量菌液OD600值，使菌液最終OD600≈1.0。將菌液在室溫條件下放置3~6 h后，將TRV1菌液分別與TRV2-NtFERL、TRV2、TRV2-PDS菌液等比例混合，用1 mL醫(yī)用注射器對(duì)本氏煙草葉片背部進(jìn)行注射，每批注射20株，避光生長(zhǎng)2 d后，恢復(fù)正常生長(zhǎng)條件。

當(dāng)注射TRV2-PDS的煙株出現(xiàn)漂白表型后，采集注射TRV2-NtFERL煙株的新生葉片，用液氮研磨成粉后進(jìn)行RNA提取及cDNA合成。使用TRIzol試劑進(jìn)行總RNA的提取，提取步驟參照TRIzol試劑說明書。將保存在-80℃的樣品室溫解凍后，加入200 μL氯仿，振蕩混勻離心后，取上層水相，轉(zhuǎn)入另一離心管中。加500 μL異丙醇，沉淀、離心得到RNA，再經(jīng)75%酒精洗滌，室溫微干后，用適當(dāng)?shù)腞Nase free水充分溶解。cDNA合成的具體步驟參照Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit說明書進(jìn)行。

1.2.3 實(shí)時(shí)定量PCR

NtFERL的實(shí)時(shí)定量PCR引物為qNtFERL-F：5'-CTCACAGACAAATCTGATG-3'，qNtFERL-R：5'-CCTTTCAGATATGGATCA-3'。煙草26S rRNA為內(nèi)參基因，引物26S-F：5'-GAAGAAGGTCCCAA GGGTTC-3'，26S-R：5'-TCTCCCTTTAACACCAA CGG-3'。實(shí)時(shí)定量 PCR 的反應(yīng)體系：10 μL 2×SYBR I Master，上下游引物各0.5 μL，50 ng cDNA，ddH2O 補(bǔ)至20 μL。反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性 30 s；94 ℃變性 5 s，60 ℃退火10 s，72 ℃延伸10 s，45個(gè)循環(huán)。根據(jù)循環(huán)閾值（CT值），用 2－ΔΔCT方法［27］計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。每個(gè)反應(yīng)進(jìn)行3次技術(shù)重復(fù)和3次生物學(xué)重復(fù)。

1.2.4 表型分析

當(dāng)陽性對(duì)照TRV2-PDS煙株出現(xiàn)漂白表型時(shí)，對(duì)TRV2-NtFERL煙株進(jìn)行表型分析，統(tǒng)計(jì)TRV2-NtFERL煙株新生葉片的泛黃率。

泛黃率=（新生葉片泛黃棵數(shù)/VIGS注射煙草總棵數(shù)）×100%

1.2.5 質(zhì)體色素含量測(cè)定

參照標(biāo)準(zhǔn) YC/T 382—2010［28］測(cè)定煙葉中質(zhì)體色素的含量。稱取0.2 g凍干后的煙葉并置于50 mL三角瓶?jī)?nèi)，加入25 mL萃取劑（90%丙酮）后在冰浴條件下超聲萃取20 min；取適量萃取液經(jīng)過濾器（0.45 μm）過濾，濾液保存于棕色色譜瓶?jī)?nèi)，用于高效液相色譜（High performance liquid chromatography，HPLC）分析。

分析條件：Waters Nova-Pak-C18色譜柱（3.9×150 mm，4 μm）；柱溫30 ℃；流速0.5 mL/min；進(jìn)樣量10 μm；流動(dòng)相A：異丙醇；流動(dòng)相B：80%(體積分?jǐn)?shù))乙腈水溶液；平衡時(shí)間6 min。梯度洗脫條件見表1。檢測(cè)波長(zhǎng)：葉綠素b檢測(cè)波長(zhǎng)為428 nm，其他質(zhì)體色素檢測(cè)波長(zhǎng)為448 nm。采用保留時(shí)間結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)樣品的吸收光譜進(jìn)行定性，外標(biāo)法定量。

表1 流動(dòng)相的淋洗梯度Tab.1 Gradient distribution of mobile phase

2 結(jié)果與討論

2.1 NtFERL的生物信息學(xué)分析

NtFERL基因位于煙草第7號(hào)染色體，無內(nèi)含子，編碼序列長(zhǎng)2 670 bp，編碼889個(gè)氨基酸，預(yù)測(cè)蛋白分子量為96.67 kD，等電點(diǎn)為6.32。將NtFERL的核苷酸、氨基酸序列在NCBI數(shù)據(jù)庫進(jìn)行Blast分析，發(fā)現(xiàn)該基因與擬南芥FERONIA基因（AtFER）高度同源［23］。NtFERL與AtFER在核苷酸和氨基酸水平上的序列一致性分別為68.8%和71.1%，說明二者在功能方面可能具有較高的保守性。經(jīng)氨基酸序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)（圖1），NtFERL與AtFER在N端Malectin domain區(qū)域（位于胞外，與感知外界信號(hào)功能有關(guān)）的同源性較低［29］，推測(cè)二者在感知外界信號(hào)的方式上可能存在差異；而在C端Protein kinase domain區(qū)域（位于胞內(nèi)，與信號(hào)傳導(dǎo)有關(guān)）的同源性較高［30］，說明在感知外界信號(hào)后，二者可能以相似的分子機(jī)制將信號(hào)向下游傳遞。

圖1 NtFERL與AtFER的氨基酸序列比對(duì)Fig.1 Amino acid sequence alignment of NtFERL with AtFER

2.2 煙草NtFERL基因的VIGS載體構(gòu)建

設(shè)計(jì)NtFERL基因3'端的特異引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，擴(kuò)增產(chǎn)物在300~400 bp之間（圖2），與目的片段（389 bp）大小相符。將PCR產(chǎn)物連接到TRV2空載體后，測(cè)序正確的克隆用于煙草VIGS實(shí)驗(yàn)。

2.3 NtFERL沉默效果及表型分析

實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果（圖3）表明，與對(duì)照（TRV2空載體）相比，在TRV2-NtFERL煙株中，NtFERL的表達(dá)量顯著下降，僅為對(duì)照的24.5%。表型方面，與對(duì)照相比，TRV2-NtFERL煙株的葉色變淺、泛黃（圖4），推測(cè)NtFERL基因可能參與調(diào)控?zé)煵葙|(zhì)體色素的合成圖3、4。

2.4 NtFERL沉默煙株葉片的質(zhì)體色素含量分析

圖2 NtFERL基因片段的電泳結(jié)果Fig.2 Electrophoretogram of NtFERL fragment

圖3 NtFERL沉默后的表達(dá)量分析Fig.3 Expression analysis of NtFERL after silencing

圖4 NtFERL沉默后的表型分析Fig.4 Phenotypic analysis of tobacco plants of NtFERL silencing

圖5 NtFERL沉默煙株的質(zhì)體色素含量Fig.5 Plastid pigment contents in tobacco plants of NtFERL silencing

由圖5可知，與對(duì)照（TRV2空載體）煙株相比，在TRV2-NtFERL煙株中，葉綠素a、葉綠素b、葉黃素、β-胡蘿卜素的含量顯著降低。這表明沉默NtFERL后，葉色泛黃是由質(zhì)體色素含量降低所引起。與TRV2-NtFERL的表型相似，在擬南芥CRTISO基因突變體中，其葉片中的葉黃素、β-胡蘿卜素、紫黃質(zhì)、葉綠素a和葉綠素b含量均明顯下降［31］?，F(xiàn)有研究表明，F(xiàn)ERL主要通過磷酸化的方式來調(diào)控信號(hào)傳導(dǎo)，并未參與質(zhì)體色素的合成［16，21-24］。本研究中，首次發(fā)現(xiàn)NtFERL基因參與了質(zhì)體色素的調(diào)控，在后續(xù)工作中將重點(diǎn)研究NtFERL調(diào)控質(zhì)體色素的分子機(jī)制。

3 結(jié)論

將AtFER在中國(guó)煙草基因組數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行同源比對(duì)，獲得了NtFERL基因的序列信息。NtFERL與AtFER在核苷酸和氨基酸水平上的一致性分別為68.8%和71.1%。下調(diào)NtFERL的表達(dá)量后，煙草色素含量（葉綠素a、葉綠素b、β-胡蘿卜素和葉黃素）顯著降低。