黃 巍， 殷海成， 王 樂

（河南工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院，河南鄭州 450001）

黃曲霉毒素B1（AFB1）主要由兩大類絲狀真菌：黃曲霉和寄生曲霉產(chǎn)生的次級(jí)代謝產(chǎn)物，屬于一種二呋喃香豆素（二氫呋喃氧雜萘鄰?fù)┑难苌铮ˋbrar等，2013）。因其在紫外照射下會(huì)產(chǎn)生藍(lán)色熒光而得名。AFB1是目前為止發(fā)現(xiàn)的真菌毒素中毒性最強(qiáng)、最穩(wěn)定的毒素，其基本毒性單位為二呋喃環(huán)，尤其是氧雜萘鄰?fù)慕Y(jié)構(gòu)具有極強(qiáng)的致畸和致癌作用，常規(guī)的高溫和強(qiáng)酸條件難以將其降解，只有在溫度為268～269℃、pH 1.0～3.0時(shí)少量降解，但對(duì)于堿性溶液抵抗力較弱，pH 9.0～10.0條件下迅速分解。此外，AFB1易溶于甲醇、氯仿、乙腈、丙酮等，但不溶于水。

黃曲霉對(duì)農(nóng)作物如玉米、花生、小麥等具有很強(qiáng)的侵染性，可以發(fā)生在作物的生長、收獲以及果實(shí)儲(chǔ)藏、運(yùn)輸?shù)冗^程。這些被黃曲霉侵染的作物果實(shí)如被加工成動(dòng)物飼料，不僅不能被消除，反而還會(huì)被放大，甚至進(jìn)一步對(duì)動(dòng)物及其產(chǎn)品造成二次污染（Oruc 等，2006）。可見，AFB1的污染不僅是食品、飼料工業(yè)而且是動(dòng)物產(chǎn)品加工行業(yè)亟待解決的重要問題。所以必須采取有效的防控措施降解或消除AFB1帶來的食品安全問題。

目前，常用的降解AFB1方法有物理法、化學(xué)法和生物法，其目的是將AFB1脫除或轉(zhuǎn)化為無毒化合物（戴軍，2015）。如表1所示，這三種脫毒方法在一定程度上可以降低或者消除部分AFB1的毒性。但采用理化法脫毒，不論是單獨(dú)使用或者聯(lián)合使用都難以達(dá)預(yù)期的安全、高效、低成本和不破壞營養(yǎng)成分等效果；而采用生物法降解AFB1具備高效、清潔、低成本、穩(wěn)定、作用范圍廣泛、解毒徹底等優(yōu)點(diǎn)，表現(xiàn)出獨(dú)有的優(yōu)勢(shì)和廣闊的研究前景。

表1 黃曲霉毒素B1脫除方法比較

1 生物法降解AFB1的方式

生物法降解AFB1已經(jīng)逐漸成熟，大多數(shù)研究者擬先通過高通量篩選出解毒效率高的優(yōu)勢(shì)菌株，或者在原有菌種的基礎(chǔ)上進(jìn)行物理化學(xué)誘變、定向進(jìn)化和基因工程改造等方法提高原始菌株的解毒效率；其次通過分離純化具有降解AFB1的微生物分泌的酶等物質(zhì)，并通過分析經(jīng)微生物降解后的產(chǎn)物化學(xué)結(jié)構(gòu)，從而探討微生物降解AFB1過程和機(jī)制。

1.1 微生物對(duì)黃曲霉毒素B1的吸附作用 自然界有許多微生物可通過非共價(jià)方式與AFB1結(jié)合，形成菌體-AFB1復(fù)合體，形成的復(fù)合體中微生物吸附性能減弱，整體趨于穩(wěn)定，不易被動(dòng)物機(jī)體吸收而排出體外，從而降低AFB1對(duì)動(dòng)物的危害（Lee 等，2003）。 劉暢等（2010）利用釀酒酵母 Y1（Y1）高效吸附AFB1，其吸附率高達(dá)81.16%。楊玉紅（2009）對(duì)AFB1進(jìn)行乳酸菌吸附時(shí)發(fā)現(xiàn)，干酪乳桿菌干酪亞種CGMCC 1.539（L.casei CGMCC 1.539）對(duì)AFB1具有較好的吸附作用，吸附效果為49%。酵母菌和乳酸菌吸附AFB1被認(rèn)為是具有開發(fā)利用價(jià)值的微生物。酵母菌和乳酸菌的細(xì)胞壁上存在與AFB1結(jié)合位點(diǎn)。例如，酵母菌的細(xì)胞壁上的葡聚糖成分在吸附AFB1的過程中起到關(guān)鍵的作用，主要在于葡聚糖的螺旋狀分子結(jié)構(gòu)與AFB1的特異性互補(bǔ)結(jié)合（楊乃歡等，2009）；此外酵母細(xì)胞表面的甘露聚糖和幾丁質(zhì)等也提升其吸附能力。張秀江等（2016）將酵母菌、酵母細(xì)胞壁和水和鋁硅酸鹽結(jié)合，制備酵母霉菌毒素降解劑，探討其對(duì)飼料中AFB1的脫毒效果。研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)加入濃度為0.25mg/mL的降解劑時(shí)，對(duì)AFB1的吸附率最高，為98.21%。錢潘攀等（2017）采用麝香草酚誘導(dǎo)酵母細(xì)胞裂解，使β-葡聚糖的含量增加51.5%，提升對(duì)AFB1的吸附效果，其吸附能力達(dá)2.5μg/mg。乳酸菌細(xì)胞壁表面的肽聚糖也具有極強(qiáng)的吸附AFB1作用。姜富貴等（2018）和Moretti等（2018）利用植物乳桿菌（L.plantarum）對(duì) AFB1進(jìn)行吸附研究，前者發(fā)現(xiàn)L.plantarum對(duì)AFB1的吸附強(qiáng)度為18.02%，后者發(fā)現(xiàn)L.plantarum CIDCA 83114能夠去除 20%左右的AFB1。Hernandez-Mendoza 等（2009）將 L.casei L30 用于吸附 AFB1，發(fā)現(xiàn)L.casei L30對(duì)AFB1的吸附穩(wěn)定性較好，并在隨后的研究中證實(shí)磷壁酸在結(jié)合AFB1的機(jī)制中起到關(guān)鍵作用（Hernandez-Mendoza 等，2009）。 此外，Hamidi等（2013）測(cè)試了兩種乳酸菌L.pentosus和L.beveris的磷壁酸分別以17.4%和34.7%的結(jié)合率吸附AFB1。雖然有多種微生物能夠?qū)FB1產(chǎn)生吸附性能，但這些吸附作用大多數(shù)是不穩(wěn)定的，存在可逆反應(yīng)，不能將AFB1徹底的消除。因此，研究微生物對(duì)AFB1的降解作用至關(guān)重要。

1.2 微生物對(duì)黃曲霉毒素B1的降解作用 AFB1的生物法降解過程主要是通過微生物所產(chǎn)的胞外、胞內(nèi)酶破壞AFB1的分子結(jié)構(gòu)，將毒素分子降解成為無毒產(chǎn)物的過程。

1.2.1 真菌降解黃曲霉毒素B1運(yùn)用真菌降解AFB1已有很多研究。Detroy和 Hesseltine（1969）發(fā)現(xiàn)AFB1環(huán)戊烷環(huán)上的酮羰基可被樹狀指孢霉（Dactylium dendroide）降解。Doyle 和 Marth（1979）報(bào)道寄生曲霉（Aspergillus parasiticus）產(chǎn)生的乳過氧化物酶與黃曲霉毒素的降解呈正相關(guān)。Shantha（1999）利用莖點(diǎn)霉（Phoma sp.）培養(yǎng)基中的提取物降解AFB1，證實(shí)所提取的產(chǎn)物為一種胞外蛋白酶，具有熱穩(wěn)定性。很多關(guān)于糙皮側(cè)耳（Pleurotus ostreatus）對(duì) AFB1解毒的報(bào)道，如 Das等 （2014） 將P.ostreatus GHBBF10和P.ostreatus MTCC142與黃曲霉在稻草中共培養(yǎng)，這兩種糙皮側(cè)耳均能抑制黃曲霉的生長，并能有效地降解AFB1，最高降解率可達(dá) 89.41%；周露等（2014）發(fā)現(xiàn)優(yōu)化后的P.ostreatus P1對(duì)AFB1的降解高達(dá)82.43%；Motomura等（2003）從 P.ostreatus分泌的產(chǎn)物中分離純化出一種胞外酶，對(duì)這種酶的酶促反應(yīng)的最佳環(huán)境條件進(jìn)行了研究，通過對(duì)降解產(chǎn)物進(jìn)行熒光檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)這種胞外酶能夠減弱AFB1的熒光強(qiáng)度，推測(cè)酶的作用位點(diǎn)為AFB1的內(nèi)酯環(huán)。 Wang 等（2011）對(duì)白腐菌（Trametes versicolor）進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)該菌分泌一種錳過氧化物酶（MnP）可以將 AFB1氧化為 AFB1-8，9-環(huán)氧化物，接著再被轉(zhuǎn)化為 AFB1-8，9-二氫二醇來降低AFB1。 Liu 等（1998）發(fā)現(xiàn)假蜜環(huán)菌（Armillariella tabescens）對(duì)AFB1具有降解作用，對(duì)假蜜環(huán)菌胞內(nèi)多酶復(fù)合體進(jìn)行了提取，證明其可以作用于AFB1雙呋喃環(huán)的烯醚鍵，生成AFB1的環(huán)氧化物，進(jìn)一步水解為AFB1-8，9-二氫二醇。利用黑曲霉（Aspergillus niger）降解AFB1的報(bào)道也有很多。Zhang等（2014）研究了 A.niger ND-1 對(duì) AFB1的去除效果，表明優(yōu)化處理后的ND-1可以在24 h后除去58.2%的AFB1，并證實(shí)ND-1降解AFB1是利用其分泌的酶；陳儀本等（1998）獲得了A.niger菌絲體的提取物（BDA），通過對(duì)溫度、pH、時(shí)間以及水分進(jìn)行研究BDA表明，BDA對(duì)AFB1的解毒過程是酶促的。通過真菌對(duì)AFB1的研究，發(fā)現(xiàn)其能夠?qū)FB1起到不同程度的降解作用，但大多數(shù)真菌存在對(duì)AFB1解毒耗時(shí)長、操作過程繁瑣和毒素降解不徹底的問題，限制了其在工業(yè)上的實(shí)際應(yīng)用。

1.2.2 細(xì)菌對(duì)黃曲霉毒素B1降解作用 Cieglar等（1966）發(fā)現(xiàn)橙黃桿菌（Flavobaterium aurantiacum）能夠不可逆的從溶液中去除黃曲霉毒素。Zhao 等（2011）提取黏細(xì)菌（Myxococcus fulvus）的上清液能夠降解71.89%的AFB1，并分離出一種酶，命名為黏細(xì)菌黃曲霉毒素降解酶（MADE），并證明鎂離子能夠提升MADE的活性。Teniola等（2005）報(bào)道，分支桿菌（Mycobacterium fluoranthenivorans）利用其胞外分泌物與AFB1作用4 h后，降解率高達(dá)90%以上，作用8 h后毒素?zé)o殘留；Hormisch等 （2004）篩選出一株能降解AFB1的M.fluoranthenivorans，并證實(shí)M.fluoranthenivorans是利用其合成的酶來分解AFB1。Alberts等（2006）檢測(cè)了紅平紅球菌（Rhodococcus erythropolis）對(duì)AFB1的降解能力，發(fā)現(xiàn)了R.erythropolis的上清液對(duì)AFB1的解毒效果遠(yuǎn)大于細(xì)胞內(nèi)液或者細(xì)胞本身的解毒效果。Gao等（2011）發(fā)現(xiàn)枯草芽孢桿菌 ANSB060（Bacillus subtilis ANSB060）對(duì)于AFB1降解率達(dá)81.5%。Guan等（2008）篩選得到的嗜麥芽窄食單胞菌 （Stenotrophomonasmaltophilia）對(duì)AFB1最高降解率為84.8%，還表明S.maltophilia的上清液解毒能力最強(qiáng)，Zn2+和蛋白酶K的處理使解毒能力減弱，推測(cè)S.maltophilia對(duì)AFB1的降解具有酶促性。Samuel等（2014）研究了惡臭假單胞菌（Pseudomonas putida）對(duì)AFB1的解毒，P.putida在與AFB1作用24 h后完全解毒，通過氣相色譜-質(zhì)譜（GC-MS）和傅里葉變換紅外光譜 （FTIR）分析降解產(chǎn)物發(fā)現(xiàn)，AFB1分別轉(zhuǎn)化為AFD1、AFD2和 AFD3，降解產(chǎn)物的毒性遠(yuǎn)低于AFB1。王雪妍等（2017）發(fā)現(xiàn)了一株具有AFB1降解功能的食醚紅球菌 （Rhodococcus aetherivorans），通過TLC及ELISA檢測(cè)顯示其對(duì)AFB1有降解活性，并推測(cè)其含有的FDR家族還原酶可能與降解活性有關(guān)。Adebo等 （2016）對(duì)假單胞菌VGF1（Pseudomonas anguilliseptica VGF1），熒光假單胞菌 （P.fluorescens）和葡萄球菌 VDF2（Staphylococcus sp.VGF2）的胞內(nèi)液進(jìn)行提取并用于AFB1解毒發(fā)現(xiàn)，當(dāng)加入蛋白酶抑制劑時(shí)，這三種細(xì)菌的胞內(nèi)液與AFB1作用6 h后的降解率分別達(dá)到66.5%、63%和100%。趙春霞等（2017）利用外淘汰法獲得了一種復(fù)合菌系FBAD-2，這種復(fù)合菌系能夠在短時(shí)間內(nèi)降解高濃度的AFB1，在120 h內(nèi)能夠?qū)?μg/mL的AFB1完全降解，并且該復(fù)合菌系能夠在70℃范圍內(nèi)保持高活性，通過對(duì)復(fù)合菌系FBAD-2的基因組進(jìn)行測(cè)序表明，其主要成分為梭菌（Clostridium）、土芽孢桿菌（Geobacillus）、嗜熱小桿菌 （Symbiobacterium thermopilum）等構(gòu)成。Wang等（2017）獲得了一種新型嗜熱復(fù)合菌系TADC7，TADC7 由 Geobacillus、Clostridium 等細(xì)菌構(gòu)成，TADC7同樣能夠在高溫下降解高濃度的AFB1，在120 h內(nèi)將0.5μg/mL的AFB1徹底降解，并表示TADC7的上清液起主要解毒作用。這種耐高溫，耐高濃度AFB1的微生物聚生體具有更廣闊的應(yīng)用前景。細(xì)菌及其產(chǎn)物能夠?qū)FB1分解成毒性較低的產(chǎn)物甚至完全消除，大多研究僅表明細(xì)菌的上清液或胞內(nèi)液中具有酶性質(zhì)的成分，并沒有徹底證實(shí)具體是哪一種成分起的作用，所以仍需進(jìn)一步研究解毒酶的結(jié)構(gòu)以及酶的解毒過程。

2 黃曲霉毒素B1的生物法脫毒應(yīng)用

應(yīng)用生物法降解食品與飼料中AFB1成為研究的熱點(diǎn)。趙麗紅等（2012）在被AFB1污染的雞飼料中添加B.subtilis MLJ060菌，利用MLJ060菌在雞的胃腸道內(nèi)降解AFB1，緩解了AFB1對(duì)產(chǎn)蛋雞生產(chǎn)能力和蛋品質(zhì)的危害。程偉等（2014）研究了在飼料中添加益生菌和AFB1解毒酶對(duì)雞生長的影響，結(jié)果明顯降低了肉雞的死亡率。胡常英等（2015）將葡萄糖氧化酶和過氧化氫酶復(fù)合，消除飼料中的AFB1，從而減輕AFB1對(duì)蛋雞生長和生產(chǎn)的不良影響。Chen等（2015）發(fā)現(xiàn)嗜熱鏈球菌（Streptococcus thermophilus）和德氏乳酸桿菌亞種（L.delbrueckii subsp） 能夠?qū)FB1轉(zhuǎn)化為AFB2a，將這兩種益生菌與加熱過的花生粕進(jìn)行混合厭氧發(fā)酵，3 d后檢測(cè)，當(dāng)熱處理與厭氧固體發(fā)酵相結(jié)合時(shí)，花生粕中黃曲霉毒素的生物轉(zhuǎn)化率可達(dá)100%，MTT法結(jié)果證實(shí)發(fā)酵花生粕未見明顯毒性。除此之外，熱處理和厭氧固體發(fā)酵不會(huì)改變花生粕中的氨基酸濃度和分布。劉睿杰等（2012）研究了巨大芽孢桿菌（B.megaterium）發(fā)酵花生粕去除AFB1的最優(yōu)條件，在最優(yōu)發(fā)酵條件下，B.megaterium對(duì)AFB1的去除率達(dá)到68%，并且基本不會(huì)降低花生粕營養(yǎng)價(jià)值。張曉雪（2015）將誘變黑曲霉FS-UV1進(jìn)行固定化并處理含AFB1的大鼠飼料，試驗(yàn)結(jié)果證明添加固定化的FS-UV1能夠很好地解除AFB1對(duì)大鼠的肝臟和腎臟的損傷，避免毒素帶來的各種不良影響。由此可見，益生菌和降解酶在AFB1生物法脫毒的應(yīng)用中起到關(guān)鍵的作用，但尚存在一些問題，如酶的活性不高，酶缺乏穩(wěn)定性，酶的解毒機(jī)制沒有徹底闡明等，針對(duì)這些問題仍需深入研究。

3 總結(jié)

生物法脫除AFB1具有安全、環(huán)保、高效的特點(diǎn)，在防治AFB1污染的過程中起到關(guān)鍵的作用。但工業(yè)生產(chǎn)上還存在微生物解毒酶產(chǎn)量低、酶的活性不穩(wěn)定，酶作用條件苛刻等問題。因此，為了更高效的解除AFB1帶來的危害，需要篩選出能夠高效產(chǎn)AFB1解毒酶的菌株，應(yīng)用基因工程改造、定向進(jìn)化等方法提升AFB1解毒菌的解毒能力。對(duì)解毒酶進(jìn)行提取、分離、純化，進(jìn)而獲得高活性成分，在清楚解毒機(jī)理的同時(shí)找到更安全的方法，使微生物解毒酶能夠更高效的發(fā)揮作用，解決酶易失活等問題。在篩選解毒菌株的方法上，可以選擇極端條件下，比如高溫、高寒、高鹽等，這樣篩選出的菌種產(chǎn)生的解毒酶可能會(huì)更加穩(wěn)定。研究AFB1降解的機(jī)理，能使微生物降解過程更具有可控性。還可以通過將AFB1降解酶基因在成熟模式生物中重組表達(dá)，以實(shí)現(xiàn)大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)，從而更好的降解AFB1。