徐良向 劉耀 廖小淼 王義 M.J.N. Rajaofera 何其光 劉文波林春花 繆衛(wèi)國

（海南大學(xué)熱帶農(nóng)林學(xué)院 熱帶農(nóng)林生物災(zāi)害綠色防控教育部重點實驗室，海口 570228）

橡膠是我國的重要戰(zhàn)略資源，也是我國亞熱帶地區(qū)的重要經(jīng)濟(jì)產(chǎn)業(yè)。橡膠樹白粉病是由橡膠樹白粉菌（Oidium heveae）侵染引起的世界橡膠樹重要病害之一［1］。該病具有蔓延速度快、危害嚴(yán)重、防治難度大等特點，病重時對橡膠樹的生長和膠產(chǎn)量均有顯著的影響，造成較大的經(jīng)濟(jì)損失［2-3］。

啟動子是通過調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合進(jìn)而募集RNA聚合酶來控制基因表達(dá)，是影響基因能否轉(zhuǎn)錄的重要功能單位之一［4］。因此，mRNA翻譯成蛋白質(zhì)與啟動子活性直接相關(guān)。真核生物的DNA中只有約5%的序列片段是基因，而從DNA中找到基因是從DNA來認(rèn)識生命的關(guān)鍵，基因前面一般會出現(xiàn)一段叫啟動子的調(diào)控序列，用來幫助基因進(jìn)行表達(dá)，如果能從DNA中定位出啟動子，就能找到基因，同時可以幫助確定轉(zhuǎn)錄起始位點的位置，因此啟動子的識別是基因研究中的重要一環(huán)［5］。此外，大多數(shù)基因工程菌都在使用花椰菜花葉病毒35S（Cauliflower mosaic virus35S，CaMV35S）啟動子作為調(diào)控目的基因表達(dá)的啟動子，隨著研究的深入，研究者已經(jīng)發(fā)現(xiàn)該型啟動子在更廣范圍的應(yīng)用上越來越凸顯出它的不足，如陶彥彬等［6］通過將JcUEP啟動子與CaMV35S啟動子的活性比較，發(fā)現(xiàn)其具有比CaMV35S啟動子更強(qiáng)的活性，可作為CaMV35S啟動子的替代品。因而，篩選尋找到具有廣泛應(yīng)用價值的啟動子、豐富啟動子資源仍然是一項很有意義的工作。

橡膠樹白粉菌是一種活體寄生病原真菌。由于其具有無法離體培養(yǎng)及未發(fā)現(xiàn)有性世代，導(dǎo)致關(guān)于橡膠樹白粉菌分子生物學(xué)方面的研究仍處于技術(shù)摸索階段［7］。本項目組已經(jīng)完成了橡膠樹白粉菌基因組的研究，發(fā)現(xiàn)其基因組數(shù)據(jù)的復(fù)雜且獨特性為啟動子的篩選研究提供了資源保障。橡膠樹白粉菌的基因功能研究尚未建立成熟的研究體系，通過研究啟動子的結(jié)構(gòu)和功能，與報告基因融合檢測進(jìn)而分析目標(biāo)基因的表達(dá)模式不失為一種很好的基因研究模式。賈嬌等［8］通過對灰葡萄孢鈣調(diào)磷酸酶基因啟動子的克隆研究，明確了該基因與灰葡萄病菌的致病性的關(guān)系，并對葡萄灰霉病的防治提供了具有實用性的方法。故而從啟動子著手探索橡膠樹白粉菌重要致病因子，研究病原菌致病性生理生化機(jī)制，結(jié)合現(xiàn)代生物技術(shù)，進(jìn)行橡膠樹抗病性鑒定和抗病育種方面研究是橡膠樹白粉病防治的一種新思路。目前對啟動子的識別僅依靠生物信息學(xué)研究遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠，所得到的假陽性啟動子較多，還需實驗來加以驗證其啟動活性?；趯ο鹉z樹白粉菌基因的搜尋和功能的探索，啟動子的篩選研究工作變得尤為重要。

本研究構(gòu)建適用于橡膠樹白粉菌啟動子活性篩選和檢測的探針載體pUC19-K，利用該載體比較HO-73中LY1、LY2、LY3、LY4四個預(yù)測的啟動子活性，篩選得到高水平轉(zhuǎn)錄報告基因的啟動子LY2、LY3，旨為橡膠樹白粉菌啟動子的發(fā)現(xiàn)、優(yōu)化改造和利用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

橡膠樹白粉菌菌株HO-73由本實驗室篩選并保存；大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；質(zhì)粒pBI121由本實驗室保存；質(zhì)粒pUC19、限制性內(nèi)切酶、T4DNA連接酶為TaKaRa公司產(chǎn)品；普通DNA產(chǎn)物回收試劑盒、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、普通質(zhì)粒小提試劑盒購自O(shè)mega Bio-Tek公司；卡那霉素、氨芐青霉素購自上海生物工程有限公司。

LB培養(yǎng)基：1%（W/V）Tryptone，0.5% Yeast Extract，1%NaCl，調(diào)節(jié) pH 7.0，121℃滅菌 20 min。（固體培養(yǎng)基添加1.6%瓊脂粉）

1.2 方法

PCR超保真擴(kuò)增目的基因片段、電泳、膠回收、酶切、連接、轉(zhuǎn)化等操作按文獻(xiàn)［9］方法進(jìn)行。

1.2.1 啟動子探針載體pUC19-K的構(gòu)建及功能驗證 以質(zhì)粒pBI121為模板，用Primer Premier5.0設(shè)計引物KanF/R、35SF/R（表1）分別擴(kuò)增卡那霉素抗性基因Kan的編碼區(qū)序列和CaMV35S啟動子序列。PCR擴(kuò)增條件：95℃預(yù)變性5 min；95℃ 50 s，56℃40 s，72℃ 50 s共35個循環(huán)；72℃ 5 min。將擴(kuò)增得到的大小一致的目的片段用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒純化回收。用BamHI和HindIII雙酶切純化產(chǎn)物Kan和質(zhì)粒pUC19，再用DNA產(chǎn)物純化試劑盒分別回收雙酶切的目的片段和質(zhì)粒片段，在T4DNA連接酶的作用下16℃進(jìn)行連接，構(gòu)建pUC19-K質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化克隆菌株大腸桿菌DH5α，通過菌液PCR和酶切驗證篩選陽性克隆并進(jìn)行測序。

測序正確后，用BamHI和EcoRI雙酶切純化產(chǎn)物CaMV35S和質(zhì)粒pUC19-K，再用普通DNA產(chǎn)物純化試劑盒分別回收目的片段和雙酶切的質(zhì)粒片段，并用T4DNA連接酶連接，構(gòu)建了pUC19-35S-K載體，轉(zhuǎn)化克隆菌株大腸桿菌DH5α，通過菌液PCR和酶切驗證篩選陽性克隆并進(jìn)行測序。

表1 Primer Premier5.0設(shè)計的引物序列

1.2.2 利用啟動子探針載體對橡膠樹白粉菌HO-73啟動子的篩選 設(shè)計引物L(fēng)Y1F/R、LY2F/R、LY3F/R、LY4F/R（表1）從橡膠樹白粉菌基因組DNA中擴(kuò)增4種不同的啟動子。PCR擴(kuò)增條件：95℃預(yù)變性 5 min；95℃ 40 s，59℃ 40 s，72℃ 40 s共35個循環(huán)；72℃ 5 min。將擴(kuò)增得到的片段大小一致的產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒純化回收。用BamHI和EcoRI雙酶切純化產(chǎn)物和質(zhì)粒pUC19-K，再用普通DNA產(chǎn)物純化試劑盒分別回收目的片段和雙酶切的質(zhì)粒片段，并用T4DNA連接酶連接，分別構(gòu)建了pUC19-LY1-K、pUC19-LY2-K、pUC19-LY3-K、pUC19-LY4-K等4個質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，用菌液PCR及酶切驗證篩選陽性克隆并進(jìn)行測序。

1.2.3 含不同啟動子重組載體菌株的卡那霉素耐受性實驗 將保存于-80℃冰箱中的含有pUC19-K、pUC19-35S-K、pUC19-LY1-K、pUC19-LY2-K、pUC19-LY3-K、pUC19-LY4-K重組質(zhì)粒的DH5α甘油菌取出置于冰盒中，待甘油菌融化后吸取100 μL菌液，在LB（含卡那霉素和氨芐青霉素）液體培養(yǎng)基中于37℃恒溫培養(yǎng)箱中振蕩復(fù)蘇培養(yǎng)12 h，再蘸取少量復(fù)蘇培養(yǎng)菌液，在LB（含卡那霉素和氨芐青霉素）平板上采用三段劃線法進(jìn)行劃線。后置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)12 h。挑取平板上長出的單菌落，接種于5 mL的LB（含卡那霉素）液體培養(yǎng)基中，將試管傾斜放置于37℃恒溫?fù)u床中，150 r/min振蕩培養(yǎng)8 h。取200 μL已搖好的種子液，加入到96孔酶標(biāo)板中，用酶標(biāo)儀測定OD600吸光值。根據(jù)測得的OD600值計算各個不同重組子的接種量（表2）。

表2 種子液OD600值及接種量的計算

設(shè)置7個卡那霉素梯度濃度分別為0、100、200、400、600、800、1 000 μg/mL。根據(jù)上一步計算出的接種量進(jìn)行接種，將接好的試管放入到37℃恒溫?fù)u床中以150 r/min的轉(zhuǎn)速振蕩培養(yǎng)。為了消除試管在培養(yǎng)過程中由于試管傾斜角度等的不同而造成的系統(tǒng)誤差，在振蕩培養(yǎng)時，把所有試管插入到試管架中，試管架水平放置，以盡量使結(jié)果具有可比性。在培養(yǎng)至12 h時取樣，測定樣品在600 nm處的吸光值。本次實驗重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1 啟動子探針載體的構(gòu)建

啟動子探針載體的構(gòu)建流程如圖1。以pBI121載體為模板，KanF/R為引物，擴(kuò)增得到Kan（798 bp）片段（圖2）。擴(kuò)增片段經(jīng)BamHI/HindIII雙酶切，克隆入質(zhì)粒pUC19相應(yīng)的酶切位點，得到pUC19-K重組質(zhì)粒。質(zhì)粒構(gòu)建完成后進(jìn)行雙酶切驗證，結(jié)果與預(yù)期一致（圖3）。

2.2 探針載體功能檢測

圖1 啟動子探針載體構(gòu)建過程

圖2 卡那霉素抗性基因PCR擴(kuò)增圖譜

圖3 pUC19-K的雙酶切驗證圖譜

以pBI121載體為模板，根據(jù)CaMV35S啟動子的序列設(shè)計引物，擴(kuò)增出CaMV35S片段，連入到啟動子探針載體pUC19-K中，測序驗證得到正確的轉(zhuǎn)化子。觀察在含卡那霉素和氨芐青霉素的LB板上兩菌株的生長狀況，可發(fā)現(xiàn)pUC19-35S-K菌株可以在含有卡那霉素的平板上生長，而pUC19-K菌株則不生長（圖4）。

圖4 探針載體pUC19-K功能檢測圖

2.3 橡膠樹白粉菌啟動子的篩選和活性鑒定

以HO-73基因組為模板，根據(jù)Promoter Scan預(yù)測的4個啟動子序列設(shè)計引物，分別擴(kuò)增出4個啟動子片段（圖5）。連入到啟動子探針載體pUC19-K中，獲得正確的轉(zhuǎn)化菌株。在只含氨芐青霉素的LB平 板 上 pUC19、pUC19-K、pUC19-35S-K、pUC19-LYx-K都可以生長，在含氨芐青霉素和卡那霉素的LB平板上只有pUC19-35S-K、pUC19-LYx-K能生長。檢測篩選得到正確的轉(zhuǎn)化子pUC19-LY1-K、pUC19-LY2-K、pUC19-LY3-K、pUC19-LY4-K（圖 6）。

圖5 五種啟動子的PCR擴(kuò)增圖譜

圖6 啟動子活性初步驗證

以pUC19-K為對照對挑選的正確轉(zhuǎn)化子pUC19-LY1-K、pUC19-LY2-K、pUC19-LY3-K、pUC19-LY4-K、pUC19-35S-K等5株菌的啟動子活性進(jìn)行了比較，從卡那霉素耐受性結(jié)果（表3），可以看出含LY3、LY4啟動子片段轉(zhuǎn)化子在卡那霉素濃度為1 000 μg/mL培養(yǎng)下OD600值仍然高，相對于含CaMV35S啟動子片段的菌株，三者對卡那霉素的耐受性存在顯著差異，菌液濃度相比高達(dá)50倍左右，故從對卡那霉素耐受性實驗結(jié)果表明供試啟動子的起始轉(zhuǎn)錄活性由強(qiáng)到弱依次為LY2≈LY3＞LY1＞LY4＞CaMV35S（圖 7）。

3 討論

啟動子是基因表達(dá)調(diào)控的重要元件，深入研究啟動子的結(jié)構(gòu)和功能，通過與報告基因融合來檢測目標(biāo)基因的表達(dá)模式是近年來功能基因組學(xué)研究廣泛采用的一種方法［10-11］。目前對啟動子的研究主要有兩種方式，計算機(jī)軟件預(yù)測和實驗篩選。常用的預(yù)測啟動子的軟件有PromoterScan［12］和Promoter2.0［13-14］。目前，常通過對實驗材料的基因組酶切，將片段整合到報告基因前，構(gòu)建啟動子探針載體，通過報告基因是否表達(dá)來篩選啟動子片段。常用的報告基因有LacZ基因［15］、卡那霉素抗性基因［16］、GUS基因［17］、GFP基因［18］等。計算機(jī)軟件預(yù)測雖然是一種簡單快捷的方法，但預(yù)測的啟動子假陽性較多［19］，因而預(yù)測的啟動子活性強(qiáng)度和功能研究必須要有實驗證據(jù)。本研究通過軟件預(yù)測與實驗篩選相結(jié)合實現(xiàn)了對啟動子的更精準(zhǔn)定位

橡膠樹白粉菌是一類專性活體寄生真菌［20］，本項目組已經(jīng)完成了橡膠樹白粉菌基因組的研究，發(fā)現(xiàn)該病菌的基因組數(shù)據(jù)復(fù)雜且獨特，初步分析并篩選獲得了90余個啟動子，可為分離活性較強(qiáng)的啟動子提供可靠的研究材料。同時，橡膠樹白粉菌致病基因功能研究尚未建立成熟的研究體系，通過研究啟動子的結(jié)構(gòu)和功能，與報告基因融合檢測進(jìn)而分析目標(biāo)基因的表達(dá)模式不失為一種很好的致病基因研究模式。此外，近年來大量誘導(dǎo)型、特異性啟動子被克隆和功能分析，并已廣泛應(yīng)用于基因工程中，然而在應(yīng)用過程中也暴露出一些問題，例如CaMV35S啟動子在黑暗條件下具有弱啟動活性［21-22］，篩選的特異性啟動子調(diào)控表達(dá)水平不高［23］，不能滿足人們的多種應(yīng)用需求等急需解決的問題。因而從橡膠樹白粉菌HO-73中篩選強(qiáng)啟動子是一項很有意義的工作。

表3 37℃ 120 r/min培養(yǎng)12 h后不同Kanamycin濃度培養(yǎng)菌液OD600值

圖7 37℃120 rpm培養(yǎng)12 h后不同卡那霉素濃度培養(yǎng)菌液OD600值折線圖

本研究通過篩選克隆橡膠樹白粉菌啟動子區(qū)域，對其表達(dá)特征進(jìn)行初步探究，并與CaMV35S啟動子強(qiáng)弱進(jìn)行比較分析。構(gòu)建的啟動子活性檢測載體pUC19-K含Amp、ori、MCS、Kan等 元 件，Kan可編碼一種氨基糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶［24］，這種酶在細(xì)胞中合成且可分泌到外周質(zhì)腔，使卡那霉素磷酸化，從而干擾了它們向細(xì)胞內(nèi)的主動轉(zhuǎn)移，進(jìn)而保護(hù)宿主不受這些抗生素的影響［25］。Kan是啟動子檢測的報告基因，能夠定性定量地表明其上游啟動子活性的強(qiáng)弱，其方向與質(zhì)粒本身的啟動子相反，這樣可以避免質(zhì)粒本身對啟動子帶來的影響。通過檢測4種啟動子的卡那霉素耐受性，我們發(fā)現(xiàn)LY2、LY3的活性相對較強(qiáng)，因此推斷在受到卡那霉素脅迫下，LY2、LY3調(diào)控卡那霉素抗性基因大量編碼可分泌到外周質(zhì)腔的氨基糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶，以保護(hù)宿主不受卡那霉素的影響。由此可見，該啟動子探針載體可以分析出所預(yù)測啟動子的活性和強(qiáng)度，具備了啟動子探針載體的主要功能。利用此啟動子探針載體，可以有效地在大腸桿菌DH5α中進(jìn)行Oidium heveaeHO-73強(qiáng)啟動子篩選和啟動子活性測定。

通過分析各啟動子的活性區(qū)別，我們推斷可能是各啟動子序列結(jié)構(gòu)存在著區(qū)別以及啟動子區(qū)域上順式作用元件距離轉(zhuǎn)錄起始位點的遠(yuǎn)近導(dǎo)致的差異。同時，啟動子區(qū)的重要順式作用元件拷貝數(shù)可能參與了調(diào)控下游基因表達(dá)的強(qiáng)度及模式，但是關(guān)于其影響下游基因表達(dá)的分子機(jī)制還不清楚，在今后的研究中仍需進(jìn)一步實驗驗證。

4 結(jié)論

本研究構(gòu)建的啟動子活性檢測載體能靈敏地快速反映啟動子活性的差異。此啟動子探針載體能夠作為橡膠樹白粉菌HO-73中篩選強(qiáng)啟動子和啟動子活性檢測的有效工具。所驗證正確的啟動子可以作為增加內(nèi)源基因轉(zhuǎn)錄和表達(dá)及進(jìn)行啟動子改造的候選啟動子。由于此啟動子探針載體也能在大腸桿菌等其他革蘭氏陰性細(xì)菌中進(jìn)行復(fù)制，因此也可用于其他細(xì)菌或真菌強(qiáng)啟動子的篩選和啟動子活性檢測。