強(qiáng)曉楠 李鑫 陳佳 廖紅東 于峰

（湖南大學(xué)生物學(xué)院，長(zhǎng)沙 410082）

小肽可作為植物生長(zhǎng)發(fā)育與逆境適應(yīng)性等細(xì)胞活動(dòng)的調(diào)控信號(hào)，賦予植物適應(yīng)復(fù)雜多變環(huán)境的能力［1］?？焖賶A化因子（Rapid alkalinization factor，RALF）首先在煙草中發(fā)現(xiàn)并被鑒定為一類5kD左右的小肽分子［2］。部分RALF可使細(xì)胞外圍環(huán)境快速發(fā)生堿化反應(yīng)［3-4］。在模式植物擬南芥、水稻、楊樹和玉米等生物體內(nèi)，針對(duì)RALF同源基因的克隆與功能分析顯示，RALF在主根中都抑制細(xì)胞生長(zhǎng)，并提出RALF主要是通過使細(xì)胞壁堿化，從而抑制細(xì)胞生長(zhǎng)［5］。RALF蛋白前體通常具有80-120 aa［2，6］。通過某種蛋白酶，如 S1P 蛋白酶［7］，切割獲得RALF成熟多肽（約50 aa），成熟RALF小肽富含半胱氨酸，并在N末端存在一段保守的-YISY序列，推測(cè)其對(duì)于識(shí)別RALF對(duì)應(yīng)的受體蛋白起重要作用，若將這段序列中的異亮氨酸突變成丙氨酸，則顯著抑制RALF功能［8-9］。在擬南芥中，至少具有35個(gè)組織特異性表達(dá)的RALF成員［10］。RALF4和RALF19在花粉管中高表達(dá)，RALF4/19能抑制花粉管的破裂［11-12］，但RALF4對(duì)根長(zhǎng)和下胚軸并沒有抑制作用［4］。這些結(jié)果暗示，RALF不同成員的功能可能具有組織特異性和多樣性。

受體激酶FERONIA（FER）是 RALF1信號(hào)分子的受體。RALF1與位于細(xì)胞膜表面的FER受體激酶結(jié)合并促進(jìn)FER的磷酸化，抑制氫泵AHA2的活性，導(dǎo)致細(xì)胞壁堿化，從而抑制主根的生長(zhǎng)［13］。本課題組的工作進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)FER通過與受體激酶RIPK相互作用響應(yīng)RALF1信號(hào)，并抑制主根細(xì)胞生長(zhǎng)［14］。同時(shí)，RALF1-FER/RIPK信號(hào)通路也在逆境響應(yīng)中發(fā)揮重要作用。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)FER能夠抑制逆境激素脫落酸（Abscisic acid，ABA）的響應(yīng)，并介導(dǎo)RALF1與ABA在主根生長(zhǎng)調(diào)節(jié)中的交叉會(huì)話［15］。在生物免疫方面，以絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）磷酸化分析及活性氧迸發(fā)（Reactive oxygen species，ROS）作為檢測(cè)指標(biāo)［16-19］。RALF23作為配體小分子，與受體FER相互作用，抑制免疫方面相關(guān)的受體復(fù)合物（EFR/BAK1/FLS2）的形成，負(fù)調(diào)控免疫信號(hào)的應(yīng)答。在擬南芥中，過表達(dá)RALF23可以抑制flg22誘導(dǎo)的ROS產(chǎn)生，并且 對(duì)PtoDC3000（Pseudomonas syringaepv. tomato DC3000）的敏感性增加，相反，其突變體可以促進(jìn)flg22誘導(dǎo)的ROS的產(chǎn)生，并且對(duì)PtoDC3000的敏感性降低［10］，以上研究表明RALF23作為負(fù)調(diào)節(jié)因子，通過FER參與到由病原體分子模式引起的植物細(xì)胞免疫。綜上可知，RALF的活性分析具有以下幾類主要測(cè)定指標(biāo)：（1）對(duì)根長(zhǎng)等組織細(xì)胞生長(zhǎng)的影響；（2）對(duì)flg22誘導(dǎo)的ROS產(chǎn)生和（3）對(duì)MAPK磷酸化的影響。

目前的研究結(jié)論表明，RALF1作為FER的配體的遺傳學(xué)證據(jù)只在根中成立，多項(xiàng)研究都認(rèn)為RALF抑制根和葉片組織細(xì)胞的生長(zhǎng)，而FER在不同組織中對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)起到不同甚至完全相反的作用，比如FER和RALF1都在根中抑制細(xì)胞生長(zhǎng)，但是FER在葉片中促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)［20-21］，這與RALF1功能相反。為解釋以上悖論，目前推測(cè)認(rèn)為不同RALF多肽成員在不同組織存在功能差異，甚至存在完全相反的功能，而這些功能相反的成員在不同的組織中與特異的受體結(jié)合，從而在不同組織起到差異甚至相反的遺傳學(xué)功能。為了驗(yàn)證該推測(cè)，本研究克隆并分析了19種RALF小肽，系統(tǒng)性地研究不同RALF對(duì)根生長(zhǎng)及下胚軸伸長(zhǎng)的影響，發(fā)現(xiàn)并不是所有RALF都會(huì)對(duì)下胚軸伸長(zhǎng)有抑制作用，RALF10會(huì)明顯促進(jìn)下胚軸的伸長(zhǎng)。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明不同RALF確實(shí)存在功能性的差異，甚至出現(xiàn)相反的功能。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑 限制性核酸內(nèi)切酶BamH 1（貨號(hào)：00455366）和EcoR I（貨號(hào)：00466339）、高保真酶（貨號(hào)：P505-d1-AA）、T4 DNA連接酶（貨號(hào)：00524509）為Thermo Fisher Scientific公司產(chǎn)品。氯化鈉（貨號(hào)：7647-14-5）、蛋白胨（貨號(hào)：73049-73-7）、酵母粉（貨號(hào)：8013-01-2）、Tris-堿（貨號(hào)：77-86-1）、異丙基 -β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）（貨號(hào)：367-93-1）、咪唑（貨號(hào)：288-32-4）、卡那霉素（貨號(hào)：70560-51-9）以及氨芐霉素（貨號(hào)：69-52-3）均購(gòu)于生工生物工程上海（股份）有限公司。載體與菌株：菌株E.coliDH5α，E.coliBL21由本實(shí)驗(yàn)室保存，質(zhì)粒pET-32a由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 主要材料 擬南芥Col-0（哥倫比亞背景），將消毒好的Col-0點(diǎn)種于1/2 MS固體培養(yǎng)基上，垂直置于長(zhǎng)日照培養(yǎng)箱里（16 h光照，8 h黑暗），溫度為22±4℃，4-5 d后取材進(jìn)行根長(zhǎng)處理及下胚軸處理實(shí)驗(yàn)，7 d后取材進(jìn)行MAPK磷酸化分析實(shí)驗(yàn)。移苗于營(yíng)養(yǎng)土中的Col-0在擬南芥生長(zhǎng)室生長(zhǎng)4-5周后取材進(jìn)行ROS含量測(cè)定實(shí)驗(yàn)。

1.2 方法

1.2.1 生物信息學(xué)分析 從Tair網(wǎng)站上獲得（https：//www.arabidopsis.org/）RALF多肽氨基酸一級(jí)序列。使用帶有默認(rèn)參數(shù)的ClustalW軟件對(duì)成熟的RALF多肽序列進(jìn)行多序列比對(duì)。進(jìn)化樹分析采用鄰近-連接方法，使用MEGA7.0軟件（參數(shù)為1 000 bootstrap 和 Poisson correction model）對(duì)多序列比對(duì)后的RALF多肽進(jìn)行進(jìn)化樹分析。

1.2.2 蛋白表達(dá)載體的構(gòu)建 本研究中所選的表達(dá)載體為pET-32a，首先利用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)特異性引物，以野生型擬南芥cDNA為模板，進(jìn)行PCR克隆擴(kuò)增，獲得目的基因片段，設(shè)計(jì)的引物見表1。PCR 程序?yàn)?95℃ 3 min；95℃ 15 s，58℃ 15 s，72℃ 40 s，共36個(gè)循環(huán)；72℃ 5 min，22℃ ∞。然后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳回收目的條帶，以BamH I和EcoR I為酶切位點(diǎn)，對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物和載體進(jìn)行雙酶切（37℃，2 h）。然后用T4連接酶 4℃連接12 h后進(jìn)行熱激轉(zhuǎn)化（42℃，90 s），涂布于含有氨芐霉素（Amp+）抗性的LB固體培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)12 h，然后挑取單菌落進(jìn)行菌落PCR檢測(cè)，挑取陽(yáng)性菌落進(jìn)行搖菌（37℃，12 h），提取質(zhì)粒并測(cè)序。

1.2.3 蛋白誘導(dǎo) 將測(cè)序正確的重組質(zhì)粒經(jīng)過熱激轉(zhuǎn)化至宿主菌BL21中，涂布于含100 mg/mL氨芐霉素的LB固體篩選培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)12-16 h后，挑取單菌落接種于6 mL含100 mg/mL的氨芐霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃，220 r/min，活化10 h。次日將活化的菌液按1∶100的比例接種于100 mL 含100 mg/mL的氨芐霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃，220 r/min振蕩培養(yǎng)2-3 h，至OD600=0.8，加入0.5 mmol/L的IPTG，28℃誘導(dǎo)6 h，離心收集菌體（5 000 r/min，22℃，5 min）。

1.2.4 蛋白純化 將菌體重懸于10 mL裂解緩沖液（50 mmol/L Tris-HCl（pH8），150 mmol/L NaCl，10 mmol/L imidazole，1 mmol/L PMSF），置于冰上，20 kH，5 min，超聲破碎，離心（5 000 r/min，4℃，5 min）收集上清，加入 500 μL Ni-NTA Agarose，4℃孵育12 h。離心（800 r/min，4℃，1 min）去上清，加入清洗緩沖液（50 mmol/L Tris-HCl，300 mmol/L NaCl，20 mmol/L imidazole），4℃孵育 10 min，重復(fù)清洗兩遍后去上清，加入洗脫緩沖液（50 mmol/L Tris-HCl，250 mmol/L imidazole），4℃孵育 1 h。收集上清（800 r/min，4℃，1 min），得到RALF蛋白。取少量純化重組蛋白，11% SDS-PAGE凝膠電泳，考馬斯亮藍(lán)染色觀察。

1.2.5 根長(zhǎng)抑制及下胚軸抑制實(shí)驗(yàn) 將擬南芥Col-0種子在75%酒精里消毒 1 min，無菌水沖洗兩次，然后加入15%的次氯酸鈉消毒 3 min，無菌水沖洗3次，將消毒好的種子置于4℃，春化2 d。根長(zhǎng)抑制實(shí)驗(yàn)，將消毒好的種子點(diǎn)種于1/2 MS固體培養(yǎng)基上，放置在22℃長(zhǎng)日照培養(yǎng)箱中，使其生長(zhǎng)4 d，然后將苗子移放到含有RALF小肽（1 μmol/L）的液體1/2 MS液體培養(yǎng)基中，正常生長(zhǎng)3 d后進(jìn)行根長(zhǎng)觀察和統(tǒng)計(jì)。下胚軸抑制實(shí)驗(yàn)，將春化后的種子點(diǎn)種于1/2 MS固體培養(yǎng)基上，使其生長(zhǎng)4 d，然后將苗子移放到含有RALF小肽（1 μmol/L）的液體1/2 MS液體培養(yǎng)基中，放在黑暗條件下培養(yǎng)，4 d后進(jìn)行下胚軸觀察和統(tǒng)計(jì)（對(duì)照組平均值-實(shí)驗(yàn)組平均值/對(duì)照組平均值）。對(duì)照組植物與實(shí)驗(yàn)組植物處于相同的生長(zhǎng)條件。使用Image J軟件分別統(tǒng)計(jì)根長(zhǎng)及下胚軸數(shù)據(jù)。

1.2.6 flg22誘導(dǎo)的ROS實(shí)驗(yàn) 剪取未抽薹的野生型（Col-0）葉片（第七、八片對(duì)生葉），將葉片切成直徑為0.4×0.4 cm的正方形小塊，分別轉(zhuǎn)入每孔含有100 μL雙蒸水（pH5.8）的96孔板，用錫箔紙遮蓋，避光，過夜反應(yīng)（8-12 h），消耗因機(jī)械損傷引起的ROS，并恢復(fù)葉片生理狀態(tài)。第2天，吸去雙蒸水，加入反應(yīng)液 17 μg/mL luminol（Sigma，貨號(hào) CAS ：521-31-3），10 μg/mL HRP（Sigma），0.1 μmol/L flg22（Sigma），1 μmol/L RALF，陽(yáng)性對(duì)照加入 flg22，實(shí)驗(yàn)組加入flg22及相應(yīng)的1 μmol/L RALF小肽，然后迅速放入儀器Fluoroskan Ascent FL（Thermo Scientific），檢測(cè)。

1.2.7 MAPK磷酸化水平分析實(shí)驗(yàn) 每組稱取0.1 g生長(zhǎng)了7 d的擬南芥幼苗，置于含有1/2 MS液體培養(yǎng)基的1.5 mL EP管中（實(shí)驗(yàn)組含2 μmol/L RALF小肽），置于光照培養(yǎng)箱處理5 min，15 min，30 min，去除反應(yīng)液進(jìn)行蛋白提取，蛋白提取試劑為（150 mmol/L NaCl，10 mmol/L MgCl2，50 mmol/L HEPES（pH7.5），10 mmol/L KCl，5 mmol/L EDTA，1%Tritonx-100，10% glycerol，1% PMSF，1% Cocktail），Western 檢測(cè)。用 β-actin（CMC，貨號(hào)：AT0004）檢測(cè)上樣平衡，使用p-MAPK（Cell Signaling，貨號(hào)：#4370）抗體檢測(cè)MAPK磷酸化水平。WB灰度值使用image J 軟件進(jìn)行測(cè)定。

表1 RALFs引物

2 結(jié)果

2.1 重組His-RALF的純化

在擬南芥中，RALF家族至少含有35個(gè)成員，并有著不同的分布與功能，為系統(tǒng)性研究這些RALF的功能，首先根據(jù)其蛋白一級(jí)結(jié)構(gòu)序列上的相似性，將其分為四大類并分別命名為I、II、III和IV。

本研究中，我們選擇具有代表性的19個(gè)RALF進(jìn)行后續(xù)的研究，研究的RALF蛋白當(dāng)中，以RALF1為代表的第I類共8個(gè)成員中我們選取其中6個(gè)成員進(jìn)行研究；以RALF34為代表的第II類共9個(gè)成員中我們選取其中7個(gè)成員進(jìn)行研究；以RALF17為代表的第III類共14個(gè)成員中我們選取其中3個(gè)成員進(jìn)行研究；以RALF18為代表的第IV類共4個(gè)成員中我們選取其中3個(gè)成員進(jìn)行研究（圖1-A）。

首先對(duì)這19個(gè)RALF進(jìn)行目的片段的PCR克隆，亞克隆進(jìn)入原核蛋白表達(dá)載體并轉(zhuǎn)入BL21大腸桿菌中進(jìn)行原核表達(dá)和誘導(dǎo)，純化并獲得原核表達(dá)的重組蛋白。通過考馬斯亮藍(lán)染色分析，發(fā)現(xiàn)RALF目的蛋白是純化后蛋白的主要成分，分子量與預(yù)測(cè)大小吻合，表明RALF純化成功（圖1-B）。

2.2 RALF抑制主根生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)的分析

RALF對(duì)主根生長(zhǎng)的調(diào)控是其活性的主要體現(xiàn)指標(biāo)之一。已有研究報(bào)道發(fā)現(xiàn)RALF1處理能夠有效的抑制主根的生長(zhǎng)，后續(xù)的研究發(fā)現(xiàn)RALF23同樣也能夠有效的抑制主根的生長(zhǎng)。為了驗(yàn)證除RALF1和RALF23外的其他17種RALF是否都具有抑制根長(zhǎng)的作用，我們用1 μmol/L RALF處理擬南芥野生型Col-0（WT）幼苗，發(fā)現(xiàn)所有RALF均能不同程度地對(duì)根的生長(zhǎng)產(chǎn)生抑制（圖 2）。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果來看，不同的RALF對(duì)根長(zhǎng)的抑制效果存在一定的差異，RALF1/23均能對(duì)根的生長(zhǎng)產(chǎn)生抑制，其抑制率分別為26.42%和18.56%（圖 2），該結(jié)論與前期研究報(bào)道的實(shí)驗(yàn)結(jié)論一致。

RALF27對(duì)根生長(zhǎng)的抑制作用相對(duì)于其它RALF最低，只有7.46%的相對(duì)抑制率。而RALF34的相對(duì)抑制率達(dá)到了26.63%，對(duì)根的抑制作用最明顯。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，這19種RALF均能對(duì)根的生長(zhǎng)產(chǎn)生抑制，不同的RALF對(duì)根的抑制作用存在一定的差異。

圖1 RALF家族成員進(jìn)化分析及蛋白純化

同時(shí)，進(jìn)一步探究在fer-4背景下，不同RALF處理對(duì)根生長(zhǎng)的抑制作用。fer-4為T-DNA插入到FER胞外域后得到的突變體植株，相比于野生型，其植株矮小，根毛缺失，表皮毛減少，并且結(jié)實(shí)率顯著降低，fer-4突變體根長(zhǎng)生長(zhǎng)對(duì)RALF1和RALF23不敏感。fer-4實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在fer-4背景下，RALF對(duì)根生長(zhǎng)的抑制與WT存在差異。與前期研究的結(jié)論一致，RALF1和RALF23在fer-4背景下，和WT相比對(duì)根生長(zhǎng)的抑制不敏感，RALF1抑制率為9.65%，RALF23抑制率為7.63%（圖 2），表明這些RALF對(duì)根生長(zhǎng)的抑制可能由FER介導(dǎo)。

而RALF34抑制率為25.82%，RALF10抑制率為25.34%，和對(duì)照WT的抑制率大體類似，表明這些RALF介導(dǎo)的對(duì)根生長(zhǎng)的抑制可能由其它受體激酶介導(dǎo)。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，RALF可能與其特異特定受體蛋白結(jié)合介導(dǎo)對(duì)主根生長(zhǎng)的抑制。

圖2 RALF對(duì)Col-0及fer-4主根生長(zhǎng)的抑制

2.3 RALF誘導(dǎo)MAPK磷酸化的分析

RALF對(duì)絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）磷酸化水平的調(diào)控是其生物活性的另外一個(gè)體現(xiàn)指標(biāo)?；钚匝醣虐l(fā)（ROS burst）和MAPK磷酸化是病原體觸發(fā)的植物細(xì)胞免疫（PTI）引起的兩個(gè)早期事件。為研究RALF是否也參與到植物細(xì)胞免疫的信號(hào)通路，我們以MAPK磷酸化變化來驗(yàn)證RALF在植物細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)中的作用。前期的研究表明，真菌內(nèi)分泌的RALF類似小肽可激活MPK3/6的磷酸化。

基于此，本研究分別從每一大類中選取3個(gè)RALF進(jìn)行MAPK磷酸化水平分析實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果（圖3）表明，RALF9/10/14/18/23/30/32/33/34處理Col-0幼苗5 min后，MPK3/6的磷酸化顯著增強(qiáng)，RALF1/3在處理15 min后，MPK3/6的磷酸化顯著增強(qiáng)，然而，隨著處理時(shí)間的增加，MAPK磷酸化顯著下降，表明RALF1/3/9/10/14/18/23/30/32/33/34可能參與到了由MAPK介導(dǎo)的植物細(xì)胞免疫，這種由RALF1/3/9/10/14/18/23/30/32/33/34參與引起的MAPK磷酸化是一種快速的響應(yīng)機(jī)制。而RALF17對(duì)MPK3/6的磷酸化沒有顯著性的影響（圖3-B）。

圖3 RALF對(duì)MAPK磷酸化的影響

2.4 RALF對(duì)flg22誘導(dǎo)的ROS生成影響分析

RALF可以通過調(diào)節(jié)flg22誘導(dǎo)的ROS來調(diào)控植物的免疫系統(tǒng)，是RALF活性的一個(gè)重要指標(biāo)。ROS，作為一種第二信使分子，參與到對(duì)植物細(xì)胞免疫的響應(yīng)，病原體分子模式誘導(dǎo)植物細(xì)胞內(nèi)ROS的釋放。

圖4 RALF調(diào)控flg22觸發(fā)的ROS釋放

基于此，本研究想進(jìn)一步探索不同的RALF對(duì)病原體分子模式引起的ROS的釋放的影響。在含有flg22的反應(yīng)體系中添加不同RALF，探索RALF對(duì)flg22誘發(fā)的ROS釋放的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果（圖 4）表明，分析的16種RALF（RALF1/9/10/12/14/18/22/23/24/25/26/27/30/31/33/34）均不同程度地抑制由flg22誘導(dǎo)的ROS的釋放。表明其可能在植物細(xì)胞免疫中起負(fù)調(diào)控作用。

2.5 RALF對(duì)下胚軸伸長(zhǎng)的影響分析

FER突變后，在黑暗生長(zhǎng)情況下，下胚軸變短，這暗示RALF可能參與下胚軸細(xì)胞的伸長(zhǎng)調(diào)控過程，但是目前尚未有相關(guān)研究報(bào)道RALF對(duì)下胚軸伸長(zhǎng)的作用?；诖耍狙芯肯胙芯窟@19個(gè)不同的RALF對(duì)下胚軸伸長(zhǎng)的影響。分別用1 μmol/L不同的RALF處理擬南芥幼苗，置于黑暗培養(yǎng)箱培養(yǎng)4 d后觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果，實(shí)驗(yàn)結(jié)果（圖 5）表明，不同的RALF對(duì)下胚軸的抑制存在極大的差異，與對(duì)照組相比，RALF3和RALF9的抑制作用相對(duì)不明顯，抑制率分別為12.86%和11.51%。RALF10則是促進(jìn)下胚軸的伸長(zhǎng)，其促進(jìn)伸長(zhǎng)的百分比為41.99%，其它RALF則均能顯著的抑制下胚軸的伸長(zhǎng)。

該實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，不同的RALF參與對(duì)下胚軸伸長(zhǎng)抑制存在功能性的差異，大部分的RALF能夠顯著抑制下胚軸伸長(zhǎng)，但也有少部分的RALF則能促進(jìn)下胚軸的伸長(zhǎng)，這暗示不同RALF的功能存在組織差異性。

3 討論

圖5 RALF對(duì)Col-0下胚軸伸長(zhǎng)的影響

RALF小肽最早從煙草中發(fā)現(xiàn)并提取，它可以引起煙草細(xì)胞懸浮液的堿化、并可以激活體內(nèi)的MAPK反應(yīng)、引起Ca2+流的上升。同時(shí)，RALF同源物也從多個(gè)物種中被分離出來，如，雙子葉植物，單子葉植物，裸子植物等［5］。RALF作為進(jìn)化保守的多肽分子，以基因家族形式存在，在植物不同器官的表達(dá)模式存在差異，這暗示RALF不同成員之間功能可能具有功能特異性，可能影響特定的信號(hào)通路。本研究的實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不同的RALF對(duì)下胚軸細(xì)胞的伸長(zhǎng)過程起到截然相反的作用，RALF1，23等抑制下胚軸細(xì)胞伸長(zhǎng)，而RALF10則促進(jìn)下胚軸細(xì)胞伸長(zhǎng)。最近的研究發(fā)現(xiàn)，RALF 4和RALF19作為BUP1/2和AUX1/2的配體，在維持花粉管的穩(wěn)定中起著非常重要的作用，當(dāng)花粉管靠近珠孔時(shí)，從雌配子體釋放的RALF34與RALF4/19競(jìng)爭(zhēng)BUP1/2和ANXUR1/2受體而干擾其信號(hào)，從而導(dǎo)致花粉管的破裂，釋放精細(xì)胞完成雙受精［12］。這讓我們猜想到，F(xiàn)ER在不同組織中其功能存在差異是否也涉及類似具有不同功能的RALF成員之間的競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合，最終產(chǎn)生截然相反的功能?；谝陨系难芯?，我們有理由猜測(cè)FER在不同部位具有相反功能的原因之一可能是由于FER與不同的RALF小肽結(jié)合從而引起下游不同的生物學(xué)響應(yīng)。

基于蛋白一級(jí)結(jié)構(gòu)序列進(jìn)行分類的RALF成員在參與到相同的信號(hào)響應(yīng)過程中存在很大差異，這表明，對(duì)RALF多肽的生物學(xué)功能研究從一級(jí)結(jié)構(gòu)層面進(jìn)行研究的策略還需要調(diào)整，如需要更多結(jié)構(gòu)學(xué)研究來系統(tǒng)闡述一級(jí)序列相似，而功能不同的RALF成員是否具有結(jié)構(gòu)差異性。此外，RALF多肽具有生物學(xué)活性需要其從前體肽切割釋放出成熟的功能性多肽，而這種從前體肽到成熟肽的加工過程需要特異的蛋白酶的參與和介導(dǎo)，是否存在除了S1P之外的的蛋白酶對(duì)不同的RALF前體肽進(jìn)行切割，從而產(chǎn)生相應(yīng)的生物學(xué)功能，這可能是今后需要關(guān)注和研究的方向。為了更為具體的研究不同RALF多肽的生物學(xué)功能，建議可以從基因敲除的層面入手，對(duì)特定的RALF進(jìn)行特定的研究，從而從遺傳學(xué)的角度探明不同RALF的生物學(xué)功能。目前我們的工作還不完善，更多更深入的研究還需要開展，同時(shí)需要把重點(diǎn)落實(shí)到遺傳學(xué)層面，從而確認(rèn)不同RALF的生物學(xué)功能和生物學(xué)意義。此外，關(guān)于不同RALF調(diào)控不同信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的研究也是今后的研究方向和重點(diǎn)。

4 結(jié)論

本研究以模式生物擬南芥為研究材料，分別克隆出了19個(gè)RALF多肽，發(fā)現(xiàn)19個(gè)RALF均能抑制擬南芥主根的生長(zhǎng)；RALF1/3/9/10/14/18/23/30/32/33/34影響MAPK的磷酸化變化；RALF1/9/10/12/14/18/22/23/24/25/26/27/30/31/33/34抑制由flg22引起的ROS的釋放。下胚軸伸長(zhǎng)抑制實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)RALF10促進(jìn)下胚軸的伸長(zhǎng)，推測(cè)RALF10可能通過不同于其他RALF的信號(hào)通路參與到對(duì)下胚軸伸長(zhǎng)的調(diào)控。