趙俊杰，王開方，陳旭升，毛忠貴

(江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，工業(yè)生物技術(shù)教育部重點實驗室，江蘇 無錫 214122)

ε-聚賴氨酸(ε-Poly-L-lysine，ε-PL)作為一種多肽類物質(zhì)，可以和甘油酯、魚精蛋白以及茶多酚等混合使用作為食品防腐劑，食用后被降解為必需氨基酸，繼續(xù)用于蛋白質(zhì)的合成，無任何毒性，是一種營養(yǎng)型防腐劑[1]。除此之外，ε-PL還可以用作多種藥物的載體，作為多肽藥物在醫(yī)療和制藥方面被廣泛應(yīng)用。ε-PL在市場上的需求量日益增加，但目前國內(nèi)的工業(yè)化水平仍較低，該多肽物質(zhì)的研究仍處于實驗室階段。ε-PL主要通過微生物的好氧發(fā)酵獲得，產(chǎn)生菌大多為鏈霉菌，通過菌種選育提高其發(fā)酵水平是目前較為可行且高效的途徑。Ochi[2]定義了一種新的育種方法——“核糖體工程”，即在固體平板中添加抗生素作為篩子，通過菌株的自然突變篩選目的突變菌株，通過該方法可以定向得到代謝物產(chǎn)量提升的目的菌株，且在該過程中微生物會獲得抗性突變[3]。Wang等[4]在Streptomycescoelicolor中引入巴龍霉素抗性，顯著提高了十一烷基靈菌紅素和放線菌紫紅素的產(chǎn)量，同時菌株的抗性水平增強(qiáng)了近20倍，該方法簡單、易操作，且效果顯著。Zhang等[5]率先提出基因組重排技術(shù)，該技術(shù)具有省時、工作量減少、目的明確等優(yōu)勢。徐波等[6]利用該技術(shù)獲得一株高產(chǎn)菌株，相比于出發(fā)菌株產(chǎn)量提高了約65%。綜上可知，這兩種方法在菌種選育方面均具有各自獨特的優(yōu)勢，適合用于育種實驗。

本文以小白鏈霉菌S.albulusM-Z18為出發(fā)菌株，通過抗性篩選和基因組重排技術(shù)獲得高產(chǎn)多肽類物質(zhì)ε-PL的菌株。首先引入巴龍霉素抗性到出發(fā)菌株上，篩選并獲得高產(chǎn)突變菌株；然后考察突變菌株是否具有作為基因組重排親本菌株的優(yōu)良性狀，并根據(jù)基因組重排的原理，將親本菌株的優(yōu)良性狀累加到目的菌株上，最終獲得ε-PL高產(chǎn)融合子，從而提高ε-PL的合成。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 菌種

出發(fā)菌株S.albulusM-Z18，保藏于本實驗室，ε-PL搖瓶產(chǎn)量為1.60 g/L。

1.1.2 培養(yǎng)基

固體培養(yǎng)基：葡萄糖10 g/L，魚粉蛋白胨2 g/L，酵母粉1 g/L，瓊脂20 g/L，pH 7.50，115℃高壓蒸汽滅菌15 min。

優(yōu)化培養(yǎng)基：甘油60 g/L，酵母粉8 g/L，硫酸銨5 g/L，七水合硫酸鎂0.50 g/L，磷酸二氫鉀2 g/L，七水合硫酸鋅0.04 g/L，七水合硫酸亞鐵0.03 g/L，pH 7.50，115℃高壓蒸汽滅菌15 min。

再生培養(yǎng)基：蔗糖120 g/L，六水合氯化鎂10 g/L，葡萄糖15 g/L，蛋白胨3 g/L，酵母粉2 g/L，微量元素溶液2 mL，TES溶液10 mL，瓊脂20 g/L，115℃高壓蒸汽滅菌20 min。再加入無菌的磷酸二氫鉀溶液10 mL，氯化鈣溶液8 mL，蒸餾水定容至1 L，并用1 mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)整pH約為7。

軟瓊脂培養(yǎng)基：瓊脂5 g/L，其余成分均與再生培養(yǎng)基相同。

PB高滲液：蔗糖120 g/L，硫酸鉀0.25 g/L，六水合氯化鎂2 g/L，微量元素溶液2 mL，用蒸餾水定容至880 mL，115℃高壓蒸汽滅菌20 min。再加入磷酸二氫鉀溶液10 mL，氯化鈣溶液10 mL，TES溶液100 mL。

TES溶液：三羥甲基氨基甲烷1.6 g/L，乙二胺四乙酸二鈉0.5 g/L，十二烷基硫酸鈉0.1 g/L，蒸餾水500 mL，用鹽酸調(diào)整pH至7.20，121℃高壓蒸汽滅菌20 min。

磷酸二氫鉀溶液：磷酸二氫鉀0.5 g/L，溶于100 mL蒸餾水，121℃高壓蒸汽滅菌20 min。

氯化鈣溶液：二水合氯化鈣37 g/L，溶于100 mL蒸餾水，121℃高壓蒸汽滅菌20 min。

微量元素溶液：氯化鋅40 mg/L，六水合氯化鐵200 mg/L，二水合氯化鈣10 mg/L，四水合氯化錳10 mg/L，十水合硼酸鈉10 mg/L，四水合鉬酸銨10 mg/L，蒸餾水定容至1 L，121℃高壓蒸汽滅菌20 min。

1.2 實驗方法

1.2.1 單孢子懸浮液的制備

取保藏于-80℃冰箱的甘油管，解凍后涂布到固體平板，30℃培養(yǎng)8 d。參照文獻(xiàn)[7]制備單孢子懸浮液，調(diào)整孢子濃度約109CFU/mL。

1.2.2 選育基因組重排的親本菌株[8]

取S.albulusM-Z18的孢子懸浮液，進(jìn)行適當(dāng)?shù)南♂?，使孢子濃度約為106CFU/mL，涂布到抗性平板，察看菌落生長狀況，并記下沒有菌落生長的臨界濃度，即抗生素對該菌株的最小抑菌濃度(MIC)。然后再將M-Z18的孢子涂布到含1～2MIC巴龍霉素的平板上，30℃培養(yǎng)8～10 d。挑選直徑較大且孢子濃密的單菌落進(jìn)行擴(kuò)培，30℃培養(yǎng)8 d后，搖瓶發(fā)酵檢測ε-PL產(chǎn)量。然后對高產(chǎn)菌株的性狀進(jìn)行考察，選擇合適的菌株作為基因組重排的親本菌株。

1.2.3 原生質(zhì)體的制備

參考Macneil等[9]的方法，略微改動。取培養(yǎng)至一定時間的菌液4 500g離心10 min，收集菌體，用PB高滲液洗滌后離心，重復(fù)兩遍。向收集的菌體中加入一定濃度的酶液，30℃恒溫水浴酶解一定的時間。酶解結(jié)束，1 500g離心2 min，除去細(xì)胞壁等雜質(zhì)，取上清，4 500g離心5～10 min，保留沉淀，加入適量PB高滲液，得到制備的原生質(zhì)體懸液。原生質(zhì)體制備率按式(1)計算：

(1)

式中：A為未酶解的菌液，涂布于再生培養(yǎng)基，長出的菌落數(shù)；B為酶解后的菌液，無菌水稀釋后涂布于再生培養(yǎng)基，未去除細(xì)胞壁的原生質(zhì)體，平板上長出的菌落數(shù)[10]。

1.2.4 原生質(zhì)體的滅活

熱滅活：取原生質(zhì)體懸液于70℃下恒溫處理一定的時間。

紫外線滅活：取等量的原生質(zhì)體懸液放置于紫外燈正下方10 cm位置照射一定的時間。

(2)

式中：A為酶解后的菌液，涂布于再生培養(yǎng)基，長出的菌落數(shù)；B為滅活處理后的原生質(zhì)體，涂布于再生培養(yǎng)基，長出的菌落數(shù)。

1.2.5 原生質(zhì)體的融合

取熱滅活和紫外線滅活處理后的原生質(zhì)體各5 mL于無菌離心管中，離心去除上清，再加入10 mL 40%的聚乙二醇(PEG) 6000，搖動混勻。38℃恒溫處理一定的時間，并設(shè)置實驗對照組，將未滅活的原生質(zhì)體涂布于再生培養(yǎng)基。

(3)

式中：A為原生質(zhì)體滅活后融合，長出的融合子數(shù)；B為原生質(zhì)體未滅活涂布于再生培養(yǎng)基，長出的菌落數(shù)。

1.2.6 原生質(zhì)體的再生

將融合后的原生質(zhì)體均勻涂布于再生培養(yǎng)基，于30℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，再生培養(yǎng)基上長出的新的菌

株即為融合子。

(4)

式中：A為未酶解的菌液，涂布于再生培養(yǎng)基，長出的菌落數(shù)；B為酶解后的菌液，無菌水稀釋后涂布于再生培養(yǎng)基，未去除細(xì)胞壁的原生質(zhì)體，平板上長出的菌落數(shù)；C為酶解后的菌液，用PB高滲液稀釋，涂布于再生培養(yǎng)基，再生的是沒有去除細(xì)胞壁的菌體以及原生質(zhì)體，為總菌落數(shù)。

1.2.7 融合子的發(fā)酵

挑選融合子的單菌落擴(kuò)培至固體培養(yǎng)基上，30℃下培養(yǎng)8 d后，用接種環(huán)刮取兩環(huán)孢子接種至優(yōu)化培養(yǎng)基，30℃、200 r/min發(fā)酵96 h。

1.2.8ε-PL檢測

參照Itzhaki[11]的測定方法。ε-PL標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=-0.347 3x+0.198 5,R2=0.999 5。

2 結(jié)果與討論

2.1 選育抗性突變菌株

圖1為S.albulusM-Z18(孢子濃度約為106CFU/mL)在含有不同質(zhì)量濃度巴龍霉素的固體培養(yǎng)基上的菌落生長情況。

注：A.0 mg/L；B.6 mg/L；C.9 mg/L；D.10 mg/L。

圖1S.albulusM-Z18在不同質(zhì)量濃度巴龍霉素的固體培養(yǎng)基上的生長情況

由圖1可見，在不加抗生素的平板上，孢子較為濃密(圖1A)；當(dāng)抗生素質(zhì)量濃度為6 mg/L時(圖1B)，平板上呈現(xiàn)出稀疏的菌落且不長孢子，說明M-Z18的生長受到了抗生素的強(qiáng)烈抑制；繼續(xù)增加抗生素的質(zhì)量濃度至9 mg/L，固體培養(yǎng)基上基本沒有菌落生長(圖1C)，因此確定巴龍霉素對S.albulusM-Z18的最小抑菌濃度為9 mg/L，即1MIC。

將S.albulusM-Z18的孢子濃度提高(107～108CFU/mL)，涂布在含1～2MIC巴龍霉素的抗性平板上，30℃培養(yǎng)8～10 d，挑選直徑較大呈梅花狀或形狀明顯不同于出發(fā)菌株的單菌落，擴(kuò)培至固體培養(yǎng)基上，培養(yǎng)8 d，通過搖瓶發(fā)酵檢測ε-PL產(chǎn)量，獲得兩株突變菌株S.albulusP-1和S.albulusP-2，產(chǎn)量分別為2.20 g/L和2.16 g/L。

2.2 基因組重排親本菌株考察

作為工業(yè)微生物，菌株穩(wěn)定的發(fā)酵性能以及單位菌體ε-PL合成能力是其重要的優(yōu)良性狀。因此，對突變菌株S.albulusP-1和S.albulusP-2進(jìn)行傳代培養(yǎng)，結(jié)果如表1所示。

表1 傳代穩(wěn)定性和單位菌體ε-PL合成能力

從表1可以看出，傳代5次，S.albulusP-1和S.albulusP-2的單位菌體ε-PL合成能力分別為0.39 g/g(平均值)和0.37 g/g(平均值)，高于M-Z18 的0.32 g/g。此外，傳代5次，ε-PL產(chǎn)量略微下降，兩個突變菌株的ε-PL產(chǎn)量分別為2.10 g/L(平均值)和1.99 g/L(平均值)，與出發(fā)菌株M-Z18產(chǎn)量1.60 g/L相比，一直持續(xù)高產(chǎn)。這兩項指標(biāo)也說明通過引入巴龍霉素抗性篩選突變菌株是一種有效途徑，且菌株的遺傳穩(wěn)定性較好。

鑒于突變菌株S.albulusP-1和S.albulusP-2良好的遺傳穩(wěn)定性，優(yōu)良的發(fā)酵性能以及單位菌體ε-PL合成能力，可以作為基因組重排的親本菌株。

2.3 基因組重排親本菌株的菌齡選擇

微生物的生長時間是影響原生質(zhì)體制備的關(guān)鍵因素。菌株培養(yǎng)時間較長，微生物的細(xì)胞壁已經(jīng)變厚，不利于破壁，制備率很低；當(dāng)培養(yǎng)時間過短時，菌絲易斷裂，獲得的原生質(zhì)體數(shù)目很小。處于對數(shù)生長期的細(xì)胞，制備率和再生率比較高。

取菌株S.albulusP-1孢子2～3環(huán)接種至優(yōu)化培養(yǎng)基中，每隔5 h取樣，設(shè)置2組平行，離心后取菌體于已烘至恒重并稱重的濾紙上，105℃過夜烘干，測定菌體干重，繪制生長曲線，如圖2所示。

圖2 菌株生長曲線

從圖2可以看出，10～40 h菌株處于對數(shù)生長期，考察處于對數(shù)生長期的菌株的生長狀態(tài)對制備率和再生率的影響，選出合適的菌齡。選取菌株的培養(yǎng)時間分別為15、20、25、30 h，菌株S.albulusP-1培養(yǎng)不同的時間后，用一定質(zhì)量濃度的溶菌酶30℃酶解1.5 h，涂于再生培養(yǎng)基，30℃培養(yǎng)6～8 d后，計算制備率和再生率，結(jié)果如圖3所示。

從圖3可以看出，當(dāng)菌體生長時間長于20 h，制備率呈現(xiàn)下降趨勢，可能是因為此時細(xì)胞壁形成，不利于原生質(zhì)體的制備。雖然培養(yǎng)25 h時對應(yīng)的再生率最高，但培養(yǎng)20 h的菌株制備率最高，且此時再生率僅僅略小于培養(yǎng)25 h的菌株，綜合考慮選擇菌齡為20 h。

圖3 原生質(zhì)體制備率與再生率

2.4 原生質(zhì)體制備條件的確定

2.4.1 酶類別及酶質(zhì)量濃度的確定

基因組重排的親本菌株為小白鏈霉菌，屬放線菌屬，放線菌的細(xì)胞壁成分與細(xì)菌細(xì)胞壁成分很相近，所以選擇溶菌酶進(jìn)行酶解實驗。對溶菌酶質(zhì)量濃度進(jìn)行優(yōu)化，梯度設(shè)置為30、40、50、60 mg/mL，酶解時間1.5 h，結(jié)果見圖4。

圖4 不同溶菌酶質(zhì)量濃度下原生質(zhì)體制備率與再生率的變化

從圖4可以看出，酶質(zhì)量濃度為30 mg/mL或更高時，原生質(zhì)體制備率從75.82%逐漸升高至96.51%。但再生率不會隨著酶質(zhì)量濃度的增加持續(xù)升高，當(dāng)酶質(zhì)量濃度由50 mg/mL增加至60 mg/mL時，再生率迅速由25.72%降為8.19%，可能是溶菌酶質(zhì)量濃度過高對原生質(zhì)體產(chǎn)生一定的毒害作用。綜合考慮，確定溶菌酶質(zhì)量濃度為50 mg/mL。

2.4.2 酶解時間確定

選用質(zhì)量濃度為50 mg/mL的溶菌酶進(jìn)行酶解，酶解時間分別為1、1.5、2、2.5 h，結(jié)果見圖5。

圖5 不同酶解時間下原生質(zhì)體制備率與再生率的變化

從圖5可以看出，原生質(zhì)體的制備率隨酶解時間的延長而升高，最高制備率達(dá)到97.42%。在1～2 h之間，原生質(zhì)體再生率也逐漸升高，但2.5 h時，再生率迅速下降為10.17%。出現(xiàn)這種現(xiàn)象的原因可能是，過長時間的酶解導(dǎo)致細(xì)胞壁被完全酶解，使再生過程缺乏骨架，且溶菌酶對原生質(zhì)體有一定程度的毒害作用。綜合考慮，選擇酶解時間為2 h。

2.5 原生質(zhì)體滅活時間的確定

2.5.1 熱滅活致死率

在70℃高溫下進(jìn)行熱滅活，滅活時間分別為10、20、30、40、50 min，結(jié)果如圖6所示。

圖6 熱滅活致死率曲線

從圖6可以看出，在0～10 min內(nèi)，熱滅活的致死率迅速升高至86.13%，20 min時已達(dá)到99.52%。為保證熱滅活處理后達(dá)到完全致死的狀態(tài)，選擇熱滅活時間為30 min。

2.5.2 紫外線滅活致死率

將原生質(zhì)體懸液放置于紫外燈正下方約10 cm處照射，每隔20 min取樣，結(jié)果如圖7所示。

圖7 紫外滅活致死率曲線

從圖7可以看出，在0～100 min之間，致死率直線上升。當(dāng)紫外滅活120 min時，細(xì)胞被完全殺死。因此，選擇紫外滅活時間為120 min。

2.6 原生質(zhì)體融合時間的確定

一般認(rèn)為，帶負(fù)電的PEG可以跟帶正電的Ca2+、Mg2+等細(xì)胞膜表面的分子產(chǎn)生反應(yīng)，引起脂分子的變化，從而使接觸位置的膜發(fā)生小范圍的融合，構(gòu)成小的原生質(zhì)橋，并逐漸擴(kuò)大區(qū)域，直至兩個親本菌株的原生質(zhì)體融合。實驗用40%的PEG 6000作為促融劑，融合時間分別為5、10、15、20 min。已滅活的原生質(zhì)體，一部分涂布再生培養(yǎng)基作為實驗對照組，另一部分在PEG作用下進(jìn)行融合。圖8為融合率隨融合時間的變化趨勢。

圖8 不同融合時間下融合率的變化

從圖8可以看出，融合15 min融合率最高，約為8%。融合20 min，融合率有所下降。這可能是在一定程度上PEG對細(xì)胞產(chǎn)生毒害作用，會使原來僅失去蛋白活性的部分原生質(zhì)體或者僅DNA結(jié)構(gòu)受損的部分原生質(zhì)體完全喪失活性。綜合考慮，確定融合時間為15 min。

2.7 正交實驗

實驗對影響原生質(zhì)體制備的關(guān)鍵條件以及融合時間進(jìn)行了優(yōu)化，實驗結(jié)果為原生質(zhì)體制備率、再生率及融合率的乘積。正交實驗因素水平見表2，正交實驗結(jié)果與分析見表3。

表2 正交實驗因素水平

表3 正交實驗結(jié)果與分析

由表3可以看出，基因組重排實驗中，酶質(zhì)量濃度和酶解時間對實驗結(jié)果影響最大，其次是菌齡和融合時間?？梢源_定最佳組合是A3B3C3D4，即菌齡25 h、酶質(zhì)量濃度50 mg/mL、酶解時間2 h、融合時間20 min。

2.8 高產(chǎn)融合子的篩選

在正交實驗選出的最佳組合條件下進(jìn)行實驗。圖9A為出發(fā)菌株的菌落形態(tài)，圖9B為再生培養(yǎng)基上新長出的融合子的菌落形態(tài)。

圖9 出發(fā)菌株的菌落形態(tài)和融合子的菌落形態(tài)

從圖9可以看出，原生質(zhì)體融合后，菌落形態(tài)發(fā)生了很大變化，融合子的菌落形態(tài)更飽滿，而親本菌株的菌落形態(tài)比較皺，融合子基本呈現(xiàn)為多角形。30℃培養(yǎng)8 d后，挑選菌落直徑較大且孢子濃密的單菌落擴(kuò)培至固體培養(yǎng)基，再繼續(xù)培養(yǎng)8 d，對孢子濃密的菌株進(jìn)行搖瓶發(fā)酵，檢測ε-PL產(chǎn)量，結(jié)果如圖10所示。

注：1～2.親本菌株；3～23.融合子。

圖10融合子和親本菌株的產(chǎn)量對比

從圖10可以看出，挑選的21株融合子，通過搖瓶發(fā)酵檢測ε-PL產(chǎn)量，其中有13株融合子的產(chǎn)量有所提升，產(chǎn)量最高的融合子是S.albulusG12，ε-PL產(chǎn)量為2.73 g/L，與M-Z18相比，產(chǎn)量提升了70.63%，說明引入巴龍霉素抗性獲得原生質(zhì)體融合的親本菌株，再結(jié)合基因組重排技術(shù)篩選高產(chǎn)多肽類物質(zhì)ε-PL的菌株是一種強(qiáng)有效的育種方法。

3 結(jié) 論

本文結(jié)合使用抗性篩選和基因組重排技術(shù)提高ε-聚賴氨酸的產(chǎn)量。首先在M-Z18中引入巴龍霉素抗性，獲得突變菌株S.albulusP-1和S.albulusP-2，再將其作為基因組重排的親本菌株。實驗對原生質(zhì)體制備、滅活與融合再生條件進(jìn)行了優(yōu)化，并運(yùn)用正交實驗分析確定最優(yōu)的條件，即溶菌酶質(zhì)量濃度50 mg/mL、酶解時間2 h、熱滅活時間30 min、紫外線滅活時間120 min、融合時間20 min。共挑選21株融合子，產(chǎn)量最高的融合子是S.albulusG12，ε-聚賴氨酸搖瓶產(chǎn)量2.73 g/L，相比于M-Z18產(chǎn)量提升了70.63%。這說明通過巴龍霉素進(jìn)行抗性篩選再結(jié)合基因組重排技術(shù)，利用發(fā)酵法選育高產(chǎn)多肽類物質(zhì)ε-聚賴氨酸的菌株的可行性。