劉 暢 王學(xué)軍 支 勇 呂 艷 曹式麗

天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院 天津 300193

膜性腎?。∕N）是臨床腎病綜合征中常見病理類型，以腎小球基底膜的增厚為典型病理表現(xiàn)。基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP）是具有降解細(xì)胞外基質(zhì)作用的酶類，其中MMP-9主要降解Ⅳ型膠原蛋白，而腎小球基底膜中的主要成分是Ⅳ型膠原蛋白。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用MMP-9基因敲除小鼠，建立陽離子化牛血清白蛋白誘導(dǎo)膜性腎病模型，觀察辛通暢絡(luò)中藥復(fù)方腎絡(luò)寧的療效，并探討其作用機(jī)理。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：遠(yuǎn)交系健康雄性Balb/c小鼠（8周齡），SPF級(jí)，由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供(許可證號(hào)：SCXK京2016-0002)，其中MMP-9基因敲除小鼠由上海吉?jiǎng)P基因公司制備。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑：陽離子化牛血清白蛋白（Chondrex公司）；弗氏不完全佐劑（Sigma公司）；MMP-9（武漢博士德生物工程有限公司）；尿蛋白試劑盒（Bio-Rad公司）；總蛋白、白蛋白試劑盒（德賽診斷系統(tǒng)上海有限公司）；膽固醇、甘油三酯試劑盒（上海復(fù)星長征有限公司）。

1.3 實(shí)驗(yàn)藥物：腎絡(luò)寧：由柴胡、黃芩、黃芪、當(dāng)歸、女貞子、澤蘭、水蛭、細(xì)辛組成，方藥經(jīng)煎煮濃縮成100ml汁液(含生藥1.05g/ml)。藥物購自天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，由天津中醫(yī)藥大學(xué)藥廠加工完成。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 動(dòng)物分組：實(shí)驗(yàn)小鼠共40只（其中MMP-9基因敲除10只）適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，非基因敲除小鼠按體重分層隨機(jī)分為腎絡(luò)寧組、模型組、正常組各10只。腎絡(luò)寧組、模型組、基因敲除組均制備膜性腎病模型。

2.2 模型復(fù)制：采用陽離子化牛血清白蛋白（C-BSA）制備heymann膜性腎病小鼠模型[1]。預(yù)免疫：C-BSA 1mg，加入0.5ml PBS中，再同等量的弗氏不完全佐劑混勻配制成懸濁液，在小鼠雙側(cè)腋下、腹股溝作多點(diǎn)皮下注射。正式免疫：預(yù)免疫1周后，每只小鼠尾靜脈注射CBSA 2.5mg(溶于lml PBS中)，每周2次，共2周。

2.3 給藥方法：腎絡(luò)寧組，自造模第1天起灌服腎絡(luò)寧(13.65g/kg)；基因敲除組、模型組、對(duì)照組以等量生理鹽水灌胃。實(shí)驗(yàn)共進(jìn)行6周。

2.4 檢測指標(biāo)與方法：于給藥后0周、第6周末檢測尿蛋白濃度；于給藥第0周自小鼠眶后靜脈竇取血，第6周末小鼠股動(dòng)脈取血，進(jìn)行血清總蛋白（TP）、白蛋白（ALB）、膽固醇（CHO）、甘油三酯（TG）等指標(biāo)檢測。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：應(yīng)用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)軟件，各組實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用單因素方差分析進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

3 結(jié)果

3.1 一般狀況：正常組動(dòng)物活動(dòng)、飲食、生長均正常，造模組動(dòng)物自實(shí)驗(yàn)開始逐漸出現(xiàn)進(jìn)食減少，消瘦，以模型組表現(xiàn)明顯，基因敲除組和腎絡(luò)寧組則相對(duì)較輕。

3.2 尿蛋白的變化：實(shí)驗(yàn)前各組小鼠尿蛋白比較，無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05），第6周末模型組、腎絡(luò)寧組與基因敲除組尿蛋白均有不同程度明顯增加，腎絡(luò)寧組、基因敲除組尿蛋白明顯低于模型組（P＜0.05），而腎絡(luò)寧組、基因敲除組間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。見表1。

表1 實(shí)驗(yàn)前后各組小鼠尿蛋白的變化（±s，mg/L）

表1 實(shí)驗(yàn)前后各組小鼠尿蛋白的變化（±s，mg/L）

注：與正常組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05。

6周569.77±117.30 1288.55±149.25**916.51±82.18*#824.74±94.62*#組別正常組模型組基因敲除組腎絡(luò)寧組例數(shù)10 10 10 10 0周371.87±48.84 359.08±16.60 327.44±27.08 366.24±81.00

3.3 生化指標(biāo)的變化：實(shí)驗(yàn)前各組小鼠血清蛋白、血脂等指標(biāo)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。實(shí)驗(yàn)6周末，模型組、腎絡(luò)寧組、基因敲除組TP、ALB較正常組降低，而腎絡(luò)寧組、基因敲除組TP、ALB高于模型組（P＜0.05）；實(shí)驗(yàn)6周末，模型組、腎絡(luò)寧組、基因敲除組TC、TG較正常組升高，其中基因敲除組TC低于模型組及腎絡(luò)寧組（P＜0.05），基因敲除組TG高于模型組與腎絡(luò)寧組（P＜0.05），模型組與腎絡(luò)寧組TG無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。見表2。

表2 實(shí)驗(yàn)前后各組小鼠生化指標(biāo)的變化（±s）

表2 實(shí)驗(yàn)前后各組小鼠生化指標(biāo)的變化（±s）

注：與正常組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05；與基因敲除組比較，&P＜0.05。

組別 例數(shù) 時(shí)間(周)正常組10模型組10基因敲除組10腎絡(luò)寧組10 0 6 0 6 0 6 0 6 TP(g/L)38.74±5.48 36.26±5.89 37.48±2.90 20.68±2.48**37.49±2.96 27.86±4.28*#38.50±1.34 28.95±3.51*#ALB(g/L)29.10±2.41 28.46±3.68 31.30±1.75 17.39±1.86**29.40±1.05 22.00±2.22*#31.94±1.74 22.84±1.37*#TC(mmol/L)3.73±0.67 3.92±0.68 3.48±0.65 5.24±0.25*3.00±0.95 4.32±0.37*3.75±0.45 5.02±0.53*TG(mmol/L)1.59±0.75 1.88±0.43 1.33±0.24 2.52±0.40*1.18±0.33 3.58±0.68**#1.40±0.23 2.72±0.66*&

3.4 血清MMP-9的表達(dá)：實(shí)驗(yàn)前正常組、模型組及腎絡(luò)寧組小鼠MMP-9表達(dá)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05），而基因敲除組MMP-9表達(dá)明顯降低（P＜0.01）；第6周末基因敲除組MMP-9表達(dá)無明顯變化，模型組、腎絡(luò)寧組MMP-9表達(dá)均有不同程度增加，明顯高于基因敲除組（P＜0.01），而腎絡(luò)寧組低于模型組（P＜0.05）。見表3。

表3 實(shí)驗(yàn)前后各組小鼠MMP-9的變化（±s，ng/ml）

表3 實(shí)驗(yàn)前后各組小鼠MMP-9的變化（±s，ng/ml）

注：與正常組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01；與腎絡(luò)寧組比較，&&P＜0.01。

6周3.02±0.95 4.98±0.91 3.88±0.04#0.86±0.13**##&&組別正常組模型組腎絡(luò)寧組基因敲除組例數(shù)10 10 10 10 0周3.16±0.71 2.89±0.69 2.67±0.56 0.84±0.05**##&&

4 討論

MN病理主要是腎小球基底膜（GBM）增厚，腎小球?yàn)V過膜屏障的完整性受到破壞，從而出現(xiàn)大量尿蛋白。我們依據(jù)中醫(yī)少陽主樞和腎絡(luò)氣血運(yùn)行理論，結(jié)合MN證候表現(xiàn)，認(rèn)為三焦樞機(jī)不利是病理基礎(chǔ)，腎絡(luò)郁滯為病機(jī)關(guān)鍵，并在長期臨床基礎(chǔ)上制定了以“疏利少陽、辛通暢絡(luò)”為法的腎絡(luò)寧中藥制劑，方中柴胡、黃芩疏利少陽，樞轉(zhuǎn)氣機(jī)；黃芪、當(dāng)歸、女貞子補(bǔ)益脾腎，扶正理虛；澤蘭、細(xì)辛、水蛭辛通暢絡(luò)，化瘀消滯。諸藥協(xié)同，疏導(dǎo)調(diào)節(jié)，養(yǎng)臟和絡(luò)，促進(jìn)腎絡(luò)氣血調(diào)暢。MMP-9是膠原酶，主要降解基膜膠原(Ⅳ型膠原)，而Ⅳ型膠原是構(gòu)成GBM最基本的骨架，MMP-9是導(dǎo)致基底膜Ⅳ型膠原的結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生改變，出現(xiàn)腎小球?yàn)V過屏障功能障礙，產(chǎn)生尿蛋白的重要病理因素[2]，如MMP-9參與了Heymann腎炎GBM中Ⅳ型膠原的降解，導(dǎo)致GBM的破壞，且MMP-9的活性與GBM損傷程度相平行[3]，臨床研究[4]亦證實(shí)原發(fā)性膜性腎病患者腎組織MMP-9的表達(dá)明顯增強(qiáng)，提示MMP-9活性增加導(dǎo)致GBM中Ⅳ型膠原過度降解，促進(jìn)GBM結(jié)構(gòu)破壞。因此目前認(rèn)為MMP-9表達(dá)增加是引起MN腎小球基底膜膠原降解、通透性增加，導(dǎo)致蛋白尿產(chǎn)生的重要致病因素[5]。在MN病理過程中，尿蛋白不僅是病變的重要標(biāo)志，而且作為一個(gè)病理因素參與MN病變過程，對(duì)腎小球GBM有進(jìn)行性損傷作用，因此減少尿蛋白排泄，改善腎小球GBM病變具有重要意義。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示腎絡(luò)寧能有效減少M(fèi)N小鼠尿蛋白排泄，提高血清TP、ALB蛋白水平。同時(shí)MN中代償性高脂血癥可加重腎小球?yàn)V過膜的損害，促進(jìn)尿蛋白增加。腎絡(luò)寧組CHO、TG明顯降低，表明腎絡(luò)寧具有調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝作用。結(jié)果顯示模型組MMP-9表達(dá)升高，而腎絡(luò)寧組和MMP-9基因敲除組MMP-9表達(dá)降低，因此腎絡(luò)寧減少M(fèi)N小鼠尿蛋白排泄，改善脂質(zhì)代謝的作用，可能與通過抑制MMP-9表達(dá)，減輕腎小球GBM結(jié)構(gòu)和功能的損害相關(guān)。