張紅晨 顧錫冬 謝小紅

乳腺癌發(fā)病率居女性癌癥的首位，且發(fā)病人群有年輕化趨勢[1]。手術、放療、化療、內分泌治療及靶向治療是乳腺癌的主要治療方式，若復發(fā)、轉移或產(chǎn)生耐藥，患者預后往往較差[2]。微小RNA（miRNA）是一類長度約22nt的非編碼單鏈RNA小分子，通過在轉錄或轉錄后水平對其靶基因的表達進行調控，進而參與細胞分化、增殖和凋亡[3]。相關文獻表明，miRNA在腫瘤發(fā)生、發(fā)展及變異過程中發(fā)揮著重要的調控作用[4]。本研究對miRNA-1271在乳腺癌組織中的表達以及對人乳腺癌細胞增殖的影響作一探討，現(xiàn)將結果報道如下。

1 材料和方法

1.1 材料 人乳腺癌細胞株MCF-7和MDA-MB-231來源于中國科學院上海生命科學研究院；SPF級健康雌性裸鼠（4～6周）購于中國科學院上海實驗動物中心，體重（20.0±3.0）g。改良杜氏伊格爾（DMEM）培養(yǎng)基購于美國Gibico公司；FBS購自杭州四季青生物技術有限公司；轉染過程中使用的LipofectamineTM2000試劑盒及Trizol試劑均購自美國Invitrogen公司；miRNA檢測試劑盒購于德國Qiagen公司；凋亡檢測試劑盒及結晶紫染液均購于美國Sigma公司。CCK-8試劑盒購于美國BD Biosciences公司。80例乳腺癌組織及其癌旁正常組織標本來源于本院2017年1月至2018年1月經(jīng)術后病理學證實的原發(fā)性乳腺癌患者，所有患者術前未接受過放化療，年齡 28～75（39，66）歲，均簽署知情同意書。

1.2 RT-PCR法檢測乳腺癌組織及癌旁正常組織miRNA-1271表達 將乳腺癌及癌旁正常組織標本制備成勻漿，離心除去碎片物質，取上清液，加入裂解液1ml，依次用氯仿、異丙醇抽提，乙醇洗滌，通過紫外分光光度計檢測樣品中RNA濃度。miRNA-1271引物為5′-CUUGGCACCUAGCAAGCACUCA-3′。 以 95℃ 5min、95℃ 15s、60℃ 30s、72℃ 30s共 40 個循環(huán)進行 RT-PCR檢測。miRNA反轉錄反應后，利用TaqMan miRNA檢測并量化miRNA-1271在乳腺癌及癌旁正常組織中的相對表達量。

1.3 細胞培養(yǎng)及轉染 將人乳腺癌細胞株MCF-7和MDA-MB-231分別置于添加10%FBS的DMEM培養(yǎng)基中，在37℃恒溫、5%CO2培養(yǎng)箱內培養(yǎng)。在細胞對數(shù)生長期，使用乙二胺四乙酸消化。為研究miRNA-1271對乳腺癌細胞增殖能力的影響，筆者對MCF-7和MDA-MB-231細胞進行質粒轉染，以增加miRNA-1271的表達。轉染前取培養(yǎng)好的細胞接種于6孔培養(yǎng)板，轉染時將培養(yǎng)液更換為無血清無雙抗的培養(yǎng)液，按照LipofectamineTM2000轉染試劑盒說明書，將miRNA-1271模擬物或陰性對照（空載質粒）與脂質體試劑混勻，室溫靜置20min，轉染后6～8h，更換為正常的完全培養(yǎng)基。RT-PCR法檢測實驗組及對照組miRNA-1271相對表達量。轉染miRNA-1271模擬物質粒的乳腺癌細胞為實驗組；轉染空載質粒的乳腺癌細胞為對照組。

1.4 miRNA-1271對乳腺癌細胞體外增殖的影響 采用CCK-8實驗。收集穩(wěn)定轉染后的MCF-7和MDAMB-231細胞，分別制成單細胞懸液并在顯微鏡下計數(shù)。在96孔培養(yǎng)板中每孔接種細胞1×103個，每孔加入培養(yǎng)液100μl，復孔數(shù)設置為6個。連續(xù)4d在固定時間點每孔加入CCK-8試劑10μl，搖勻后避光培養(yǎng)3h。利用多功能酶標儀檢測（波長490nm處）測定吸光度（OD）值，并繪制細胞生長曲線。

1.5 miRNA-1271對乳腺癌細胞克隆形成的影響 采用集落形成實驗。細胞轉染24h后，用胰蛋白酶消化細胞，制成細胞懸液。細胞計數(shù)后鋪于6孔板中，細胞密度為300個/孔。每組設3個復孔，反復吹打并搖勻，防止細胞成團。培養(yǎng)2周后，用4%多聚甲醛固定細胞，0.1%結晶紫染色，在顯微鏡下計數(shù)并分析集落形成數(shù)。

1.6 miRNA-1271對乳腺癌細胞凋亡的影響 采用流式細胞術。取穩(wěn)定轉染24h后實驗組和對照組乳腺癌細胞，冰PBS洗滌，冰乙醇固定細胞，4℃過夜。離心5min后收集細胞，加入5μl異硫氰酸熒光素并輕輕混勻，3min后再加入10μl碘化丙啶，37℃水箱中避光反應15min；離心后重懸于0.5ml預冷的緩沖液中，混勻后用流式細胞儀檢測細胞凋亡情況。

1.7 miRNA-1271對MCF-7乳腺癌細胞體內增殖的影響 采用動物實驗。取實驗組（穩(wěn)定過表達miRNA-1271）和對照組MCF-7細胞，分別配置成1×107個/ml細胞懸液，接種于裸鼠右腋皮下。在無病原體環(huán)境下飼養(yǎng)裸鼠。細胞接種4周后，處死小鼠，取出移植瘤組織并稱重。

1.8 統(tǒng)計學處理 應用SPSS 19.0和GraphPad Prism 5.0統(tǒng)計軟件。計量資料用 表示，組間比較采用兩獨立樣本t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 乳腺癌組織與癌旁正常組織中miRNA-1271相對表達量比較 乳腺癌組織中miRNA-1271相對表達量為0.55±0.02，明顯低于癌旁正常組織中的1.50±0.03，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見圖1。

圖1 乳腺癌組織與癌旁正常組織中miRNA-1271相對表達量比較（*P＜0.05）

2.2 miRNA-1271對乳腺癌細胞體外增殖的影響 與對照組比較，實驗組MCF-7和MDA-MB-231細胞中miRNA-1271相對表達量均明顯升高（均P＜0.05），即轉染成功，見圖2。與對照組比較，上調miRNA-1271表達后的MCF-7和MDA-MB-231乳腺癌細胞OD值明顯低于對照組（均P＜0.05），見圖3。這表明上調miRNA-1271表達后，MCF-7和MDA-MB-231乳腺癌細胞的體外增殖能力受到明顯抑制。

2.3 miRNA-1271對乳腺癌細胞克隆形成的影響 與對照組比較，miRNA-1271過表達后的 MCF-7和MDA-MB-231乳腺癌細胞形成克隆體積更小、數(shù)目更少，實驗組與對照組集落形成數(shù)比較差異有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05），見圖4。這表明miRNA-1271能抑制MCF-7和MDA-MB-231乳腺癌細胞的克隆形成能力。

圖2 乳腺癌細胞中miRNA-1271的轉染效率（a：MCF-7細胞；b：MDA-MB-231細胞；與對照組比較，*P＜0.05）

圖3 miRNA-1271對乳腺癌細胞體外增殖的影響（a：MCF-7細胞；b：MDA-MB-231細胞；與對照組比較，*P＜0.05）

2.4 miRNA-1271對乳腺癌細胞凋亡的影響 與對照組比較，轉染miRNA-1271的MCF-7和MDA-MB-231乳腺癌細胞凋亡率明顯升高（均P＜0.05），見圖5。這表明miRNA-1271能促進MCF-7和MDA-MB-231乳腺癌細胞凋亡。

圖4 miRNA-1271對乳腺癌細胞克隆形成的影響（a：MCF-7細胞；b：MDA-MB-231細胞；與對照組比較，*P＜0.05）

圖5 miRNA-1271對乳腺癌細胞凋亡的影響（a：MCF-7細胞；b：MDA-MB-231細胞；與對照組比較，*P＜0.05）

2.5 miRNA-1271對MCF-7乳腺癌細胞體內增殖的影響 與對照組比較，實驗組裸鼠移植瘤體積明顯較小，質量明顯較低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見圖6。這表明上調miRNA-1271表達后，MCF-7乳腺癌細胞的體內增殖能力受到明顯抑制。

圖6 miRNA-1271對乳腺癌細胞體內增殖的影響（a：兩組移植瘤體積比較；b：兩組移植瘤質量比較，*P＜0.05）

3 討論

在女性惡性腫瘤中，乳腺癌發(fā)病率及病死率均居首位，嚴重威脅著女性健康[5]。miRNA是一組進化保守且具有調控功能的非編碼RNA，通過與靶基因mRNA的3′-非翻譯區(qū)互補配對結合，導致miRNA降解或抑制其翻譯表達[6]。許多miRNA發(fā)揮著類似于癌基因或抑癌基因的作用，是腫瘤的潛在治療靶點和預后指標[7]。miRNA-1271是在人類胚胎干細胞中的ARL10基因第2內含子區(qū)域被識別，是miRNA-96的同源類似物[8]。最近研究發(fā)現(xiàn)，miRNA-1271 在肝癌[9]、肺癌[10]、結腸癌[11]、前列腺癌[12]和胃癌[13]中均呈低表達。在肺癌中，miRNA-1271表達降低；外源性上調其表達后，miRNA-1271通過調控mTOR基因可抑制癌細胞的增殖[10]。在胃癌中，miRNA-1271因甲基化而表達降低，通過靶向調控MEK1/ERK/MAPK信號轉導途徑在胃癌細胞生長、侵襲和遷移過程中發(fā)揮著重要作用[13]。然而，miRNA-1271在乳腺癌中的研究報道尚少，其生物學功能尚待闡明。

本研究對80例乳腺癌及癌旁正常組織中miRNA-1271表達進行檢測，結果發(fā)現(xiàn)miRNA-1271在乳腺癌組織中呈低表達，說明miRNA-1271可能在乳腺癌中發(fā)揮抑癌基因的作用。于是，筆者對MCF-7和MDA-MB-231乳腺癌細胞穩(wěn)定轉染miRNA-1271模擬物，以探究上調miRNA-1271對乳腺癌細胞生物學功能的影響。CCK-8實驗結果發(fā)現(xiàn)，miRNA-1271的表達水平升高后，乳腺癌細胞的體外增殖能力受到明顯抑制；集落形成實驗發(fā)現(xiàn)，miRNA-1271能明顯減弱腫瘤細胞的成瘤能力。裸鼠成瘤實驗結果證實，miRNA-1271在體內亦能抑制乳腺癌細胞的增殖。細胞凋亡，即細胞的程序性死亡，是由基因控制的細胞自主的有序的死亡[14]。凋亡是多基因多步驟嚴格控制的過程，而凋亡調控的失衡是腫瘤發(fā)生、發(fā)展的重要過程。本實驗利用流式細胞術檢測細胞凋亡情況，結果發(fā)現(xiàn)miRNA-1271能通過促進凋亡的發(fā)生來抑制乳腺癌細胞的增殖能力。Qin等[15]實驗結果與之相似，在肝癌中低表達的miRNA-1271，通過靶向作用于FOXQ1基因，促進肝癌細胞凋亡比例增加，從而抑制肝癌細胞的增殖。關于乳腺癌的研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)OXQ1是TGF-β信號通路中的一個重要靶點，miRNA-1271促進乳腺癌細胞凋亡的機制可能與FOXQ1相關[16]。Du等[17]近期研究發(fā)現(xiàn)，miRNA-1271在乳腺癌組織及細胞中的表達明顯降低，并通過靶向調控SPIN1基因表達來抑制乳腺癌細胞增殖、侵襲和遷移能力，呈現(xiàn)出抑癌基因的活性。

綜上所述，miRNA-1271在乳腺癌組織中低表達；上調miRNA-1271表達，能抑制乳腺癌細胞的增殖，促進凋亡的發(fā)生，具有抑癌作用。本研究為乳腺癌的治療提供了一個新思路，為后續(xù)深入探討miRNA-1271在乳腺癌中的作用機制提供了前期實驗基礎。