付應(yīng)霄 廖亞平 陳昌杰

(蚌埠醫(yī)學(xué)院生物科學(xué)系 安徽蚌埠 233030)

細(xì)胞培養(yǎng)(cell culture)是指將生物體的部分器官、組織或者細(xì)胞等模擬機(jī)體內(nèi)生理條件，進(jìn)行離體培養(yǎng)，實現(xiàn)細(xì)胞的生長與增殖，進(jìn)而獲取大量的細(xì)胞克隆，以進(jìn)行體外研究的過程[1-3]。該技術(shù)幾乎可以運用于生物和醫(yī)學(xué)研究的各個領(lǐng)域，如研究藥物的細(xì)胞毒性機(jī)制及細(xì)胞的分化、衰老、凋亡機(jī)制等。在醫(yī)學(xué)院校，以細(xì)胞為工具所開展的基礎(chǔ)研究占比較高，以某醫(yī)學(xué)院校為例，筆者對近三年省級以上自然科學(xué)類在研課題進(jìn)行了統(tǒng)計。結(jié)果表明，連續(xù)三年(2017年87.40%、2016年85.95%、2015年87.64%)，以細(xì)胞培養(yǎng)為基礎(chǔ)所開展的課題占比均超過85%，如圖1所示。而研究生是各課題組的主力軍，因此在醫(yī)學(xué)院校為研究生開設(shè)《細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)》課程，以強(qiáng)化其基本實驗操作技能則顯得尤為重要。

1 課程培養(yǎng)目標(biāo)

圖1 某醫(yī)學(xué)院校2017、2016、2015年省級以上在研自然科學(xué)類科研課題統(tǒng)計。

通過理論講授，使得研究生能夠了解細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的研究進(jìn)展，了解體外細(xì)胞培養(yǎng)的基本原理、過程、注意事項以及細(xì)胞分離與純化等實驗技術(shù)；通過實驗訓(xùn)練，為研究生提供動手操作機(jī)會，使他們掌握細(xì)胞培養(yǎng)的基本方法，并能夠?qū)⒃擁椉夹g(shù)熟練運用于在讀期間科研課題的開展，以及未來的科研工作中。

2 課程教學(xué)保障

該課程共有6位授課教師，全部為高級職稱。其中教授2人、副教授4人，具有博士學(xué)位3人，具有碩士學(xué)位3人。教師隊伍中1人有海外博士后工作經(jīng)歷，另有1人目前在某高校從事博士后研究工作。主講教師年齡結(jié)構(gòu)合理，以中青年教師為主。所有教師均具備熟練的細(xì)胞培養(yǎng)操作技能，長期從事以細(xì)胞培養(yǎng)為基礎(chǔ)的科學(xué)研究工作。

授課前，師資團(tuán)隊定期進(jìn)行集體備課，主講教師在自主備課的基礎(chǔ)上，向其他授課教師展示相應(yīng)章節(jié)的教學(xué)課件、教學(xué)內(nèi)容、教學(xué)安排、教學(xué)目的、教學(xué)重點、教學(xué)難點、教學(xué)方法等。其他授課教師則結(jié)合實際情況，提出科學(xué)合理的建議，集思廣益，以促進(jìn)教學(xué)過程的不斷完善。

因研究生自主學(xué)習(xí)能力較強(qiáng)，在課堂教學(xué)中，根據(jù)課程教學(xué)大綱和教學(xué)計劃，在遵循教學(xué)基本原則的基礎(chǔ)上，突出開放式教學(xué)。采用提問式、討論式、引導(dǎo)自學(xué)式、知識應(yīng)用式等全新的教學(xué)方式和多媒體授課。

《細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)》實驗課程教學(xué)主要在該醫(yī)學(xué)院?！吧镝t(yī)學(xué)實驗教學(xué)中心”平臺開展，該“中心”現(xiàn)開放實驗室面積達(dá)1 500 平方米。包括該課程教學(xué)所需的實驗準(zhǔn)備室，凈化工作室(也稱無菌室)。同時配備電熱干燥箱、濕熱高壓滅菌器、純水蒸餾器、超聲波清洗儀、酸缸、紫外燈、除菌濾器、潔凈層流罩、超凈工作臺、CO2培養(yǎng)箱、超低溫冰箱、倒置顯微鏡、高速離心機(jī)等儀器設(shè)備，還有凍存細(xì)胞所需液氮罐。上述條件完全能夠滿足該門課程的教學(xué)需求。

3 課程進(jìn)度與實施

課程教學(xué)分為理論講授與實驗操作兩部分。理論教學(xué)第一講內(nèi)容為細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)概論和基礎(chǔ)知識介紹，具體包括：細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的概述、細(xì)胞原代培養(yǎng)、細(xì)胞傳代培養(yǎng)、克隆等概念；細(xì)胞培養(yǎng)使用的儀器設(shè)備、無菌條件、細(xì)胞生長條件、細(xì)胞檢測條件、細(xì)胞保存條件等；培養(yǎng)細(xì)胞生長的條件；細(xì)胞培養(yǎng)用液的配制；培養(yǎng)器皿的清洗、包裝與消毒。第二講內(nèi)容為動物細(xì)胞培養(yǎng)基本方法，具體包括：細(xì)胞培養(yǎng)的基本知識，體外培養(yǎng)技術(shù)的類別，體外培養(yǎng)細(xì)胞的生物學(xué)特點，原代培養(yǎng)細(xì)胞的特點，傳代培養(yǎng)細(xì)胞特點；原代培養(yǎng)過程，消化分離細(xì)胞培養(yǎng)實驗步驟；傳代培養(yǎng)的過程，貼壁細(xì)胞的傳代過程，細(xì)胞計數(shù)與活力檢測；細(xì)胞的凍存與復(fù)蘇；培養(yǎng)細(xì)胞觀察；常見細(xì)胞污染的類別和檢測；細(xì)胞培養(yǎng)過程中應(yīng)注意的細(xì)節(jié)問題。授課前制作講義發(fā)放給學(xué)生，課件多呈現(xiàn)視頻、圖片、實例，有助于學(xué)生理解和掌握具體技術(shù)要點，提高授課效率。

實驗一內(nèi)容為胎鼠細(xì)胞的原代培養(yǎng)：選擇ICR孕15日齡鼠，處死并分離胎鼠，剪除頭、尾以及四肢，僅保留軀干部，剪碎，并用Hanks液洗滌。胰酶消化后加入新鮮培養(yǎng)液吹打懸浮細(xì)胞分散組織塊。按血細(xì)胞計數(shù)法進(jìn)行計數(shù)，稀釋后接種培養(yǎng)，定期觀察細(xì)胞生長狀況。實驗二內(nèi)容為Hela細(xì)胞傳代培養(yǎng)：在無菌條件下，取生長狀態(tài)良好細(xì)胞，棄去原有的培養(yǎng)液，PBS輕洗，胰酶消化后加入新鮮培養(yǎng)液吹打懸浮細(xì)胞。稀釋后進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)并接種至新細(xì)胞培養(yǎng)瓶，放入CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，定期觀察細(xì)胞生長狀況。為提高教學(xué)質(zhì)量，保證教學(xué)效果，為研究生提供盡可能多的實踐機(jī)會，實驗操作分小組進(jìn)行，每小組進(jìn)入一個凈化工作室，每組4人。組內(nèi)進(jìn)行明確分工，具體工作包括實驗動物前處理(處死和75%酒精體表滅菌)，操作臺滅菌，耗材、試劑供給，主操作的完成，實驗結(jié)束后的整理等。教師全程指導(dǎo)或示教，如實驗前準(zhǔn)備，具體操作方法，實驗后器械、耗材整理和清洗等。實驗完成后，要求學(xué)生跟蹤細(xì)胞培養(yǎng)狀況，通過圖像采集系統(tǒng)拍照，提交實驗報告，并對實驗過程進(jìn)行總結(jié)和討論。

4 課程評定形式

該課程綜合成績由課堂考勤、課程論文、實驗報告以及實驗操作考核四部分構(gòu)成。采用簽到形式確保課堂出勤率；在理論授課結(jié)束時布置研究生完成一篇與細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)相關(guān)的研究綜述并提交，授課教師將根據(jù)綜述的質(zhì)量予以評分，如重復(fù)率、參閱文獻(xiàn)新穎性、格式等指標(biāo)均作為評判依據(jù)。每次實驗操作結(jié)束之后，研究生均需要完成相應(yīng)實驗報告，內(nèi)容包括：實驗?zāi)康摹⒃?、儀器、實驗材料、試劑、步驟、注意事項、結(jié)果(細(xì)胞圖片)、討論等。實驗操作考核，由每個研究生單獨完成培養(yǎng)細(xì)胞換液實驗，該項測試能夠較好地反映學(xué)生的無菌操作意識。測試內(nèi)容涵蓋無菌操作臺紫外燈、風(fēng)機(jī)、酒精燈的使用等。另外，操作時禁止操作者在開蓋的滅菌物品及試劑上方活動；禁止操作者兩手在臺面上交叉取物；禁止操作者將滅菌物品移出超凈臺，吸管或移液器吸頭不能碰到臺面、培養(yǎng)瓶口外壁等，吸管不得混用；操作結(jié)束及時對臺面進(jìn)行清理和滅菌處理。通過一系列強(qiáng)化訓(xùn)練，確保研究生既掌握了該門課程的理論知識，又鍛煉了實驗操作能力，還激發(fā)了探索和創(chuàng)新意識，充分調(diào)動了他們的學(xué)習(xí)積極性。

5 存在問題及解決建議

《細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)》課程周期較長，從前期使用耗材的準(zhǔn)備，試劑的配制、滅菌，到細(xì)胞培養(yǎng)，以及后期的清洗等約需2-3天時間，在學(xué)時安排上很難適應(yīng)全部實驗內(nèi)容的需要，因此，部分內(nèi)容只能由實驗準(zhǔn)備教師完成，而學(xué)生無法全程參與其中。現(xiàn)有凈化工作室房間數(shù)量有限，且受到學(xué)時限制，因此暫時尚未達(dá)到1人1組的實驗條件，無法保證所有研究生均可獨立完成原代與傳代細(xì)胞培養(yǎng)的全部實驗。課程考核方式有待優(yōu)化，現(xiàn)行制度無法全面反映學(xué)生對細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的掌握程度。

針對上述問題，授課教師應(yīng)對課程教學(xué)內(nèi)容與教學(xué)模式等進(jìn)行完善，提高教學(xué)效果，加強(qiáng)學(xué)生的實驗技能訓(xùn)練，以確保實驗課程順利開展。同時，建議在研究生培養(yǎng)方案修訂時增加該課程學(xué)時，以滿足系統(tǒng)性實驗操作之需。

總之，體外培養(yǎng)細(xì)胞是基礎(chǔ)研究的重要工具和載體，在醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域發(fā)揮關(guān)鍵作用。細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)是醫(yī)學(xué)及相關(guān)專業(yè)的研究生和科研人才必備實驗技能。授課教師應(yīng)在有限的教學(xué)學(xué)時內(nèi)，激發(fā)研究生對該技術(shù)的學(xué)習(xí)熱情，掌握技術(shù)要點。筆者對近年教學(xué)經(jīng)驗進(jìn)行總結(jié)，發(fā)現(xiàn)通過該門課程學(xué)習(xí)，醫(yī)學(xué)及相關(guān)專業(yè)的研究生能夠扎實的掌握細(xì)胞培養(yǎng)實驗的基本要領(lǐng)，并提升了學(xué)生的實踐水平，培養(yǎng)了他們科學(xué)的思維方式和科研素養(yǎng)。觀察發(fā)現(xiàn)，在讀、進(jìn)一步深造以及走向工作崗位的研究生均能夠?qū)⑺鶎W(xué)技能進(jìn)一步運用到科研課題的實施過程，提高了其科研工作效率。并且，已有部分研究生申報并獲批了各級別的研究生創(chuàng)新課題，參與發(fā)表了科技論文。