馬 鵬，常秋燕，李林杰，郭富城，李凌浩，張德榮，馬忠仁*，馬曉霞*

(1.西北民族大學(xué) 甘肅省動(dòng)物細(xì)胞工程技術(shù)研究中心，甘肅 蘭州 730030；2.西北民族大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州730030)

細(xì)胞自噬(Autophage)，是細(xì)胞在自噬相關(guān)基因(Autophagy-related gene，ATG)的調(diào)控下利用溶酶體降解自身受損的細(xì)胞器和大分子物質(zhì)的過程[1]。細(xì)胞自噬與細(xì)胞凋亡、細(xì)胞衰老相似，是十分重要的生物學(xué)現(xiàn)象，參與生物的發(fā)育、生長(zhǎng)等多種生命過程[2]。自噬的發(fā)生依賴于自噬相關(guān)基因(Autophage-related gene，ATG)編碼的自噬相關(guān)蛋白，已知的有36種ATG蛋白參與自噬及其相關(guān)過程，根據(jù)參與自噬的不同階段，它們被劃分為不同的功能結(jié)構(gòu)域，如表1所示。如ULK復(fù)合體，是由ULK1激酶、ATG13、FIP200以及ATG101這幾種蛋白組成，位于信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)的末端，可正向或負(fù)向調(diào)控自噬反應(yīng)[3]。

表1 ATG蛋白復(fù)合體組成[4]Table 1 The structure of ATG complex[4]

長(zhǎng)期以來，研究人員認(rèn)為ATG蛋白的主要功能是參與自噬，是自噬過程中不可缺少的因素，所以大量的研究集中于此。然而最新的研究表明，這些蛋白單獨(dú)或共同參與除自噬外的其他重要的細(xì)胞生理過程，如基因調(diào)控、蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)、凋亡及免疫應(yīng)答等過程[5-7]，如表2所示。本文綜述了幾種重要的ATG蛋白在調(diào)控天然免疫應(yīng)答在病毒感染后的作用，為研究動(dòng)物抗病源侵染的重要生理功能提供理論依據(jù)。

1 ATG蛋白調(diào)控抗病毒天然免疫信號(hào)通路

1.1 ATG蛋白調(diào)控RLRs信號(hào)通路ATG12及ATG5可參與除自噬之外的信號(hào)途徑。許多RNA病毒感染哺乳動(dòng)物細(xì)胞后產(chǎn)生病毒來源的免疫刺激RNA片段(isRNA)。當(dāng)細(xì)胞被新城疫病毒、流感病毒、日本乙腦病毒等RNA病毒感染后，病毒增殖過程中會(huì)產(chǎn)生能被胞質(zhì)中的RNA解旋酶RIG1識(shí)別的5'三磷酸化的RNA片段。其它的病毒如腦心肌炎病毒產(chǎn)生的雙鏈RNA可被另一種RNA解旋酶MDA5識(shí)別。這兩種解旋酶N端都具有caspase活化和招募的結(jié)構(gòu)域(CARD)，可以與其它具有CARD區(qū)域的蛋白，如信號(hào)分子IFN-b啟動(dòng)子激活因子(IPS1)結(jié)合。IPS1的CARD與RIG1或MDA5的CARD結(jié)合對(duì)于下游信號(hào)的傳遞至關(guān)重要，最終 NF-κb，IRF3，IRF7入核并激活I(lǐng)FN及相關(guān)細(xì)胞因子的轉(zhuǎn)錄與翻譯。分泌型的IFN-I可通過自分泌或旁分泌的方式激活RNA酶L降解病毒RNA或通過抑制真核翻譯起始因子2(eIF2)的活性來阻遏病毒蛋白合成[9-11]。

表2 ATG蛋白非依賴自噬功能[8]Table 2 The function of ATG protein independence autophagy[8]

ATG12-ATG5復(fù)合物反向調(diào)控isRNA引起IFN的合成。ATG12-ATG5復(fù)合物通過結(jié)合RNA解旋酶RIG1和MDA5來調(diào)節(jié)二者結(jié)合IPS1的能力，從而阻斷IFN的合成。研究表明，在ATG5敲除的纖維原細(xì)胞感染水泡性口炎病毒后，IFN-I的產(chǎn)生增加，病毒復(fù)制減少。在293細(xì)胞中過表達(dá)ATG5或ATG12則促進(jìn)ATG12-ATG5復(fù)合物的生成并抑制RIG1或MDA5介導(dǎo)的信號(hào)通路，最終導(dǎo)致IFN-I產(chǎn)生減少。此外，ATG7敲除的纖維原細(xì)胞中ATG12-ATG5復(fù)合物的形成受阻，進(jìn)而對(duì)isRNA的刺激更敏感。研究顯示，ATG5或ATG16L1能夠負(fù)調(diào)控 RIG-I樣受體介導(dǎo)的信號(hào)通路，缺失自噬體的小鼠胚胎成纖維細(xì)胞和普通樹突狀細(xì)胞在RNA病毒的侵染下，MAVS結(jié)合的線粒體喪失其正常功能從而誘導(dǎo)產(chǎn)生大量活性氧(Reactive oxygen species，ROS)，ROS的釋放能夠繼續(xù)激活I(lǐng)FN-I 的表達(dá)[12-13]。

1.2 調(diào)節(jié)STING介導(dǎo)的天然免疫應(yīng)答ATG蛋白也參與了細(xì)胞內(nèi)DNA信號(hào)激活STING介導(dǎo)的天然免疫應(yīng)答，在此過程中，ATG蛋白可以干擾信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，所以它們發(fā)揮了調(diào)節(jié)因子而非效應(yīng)因子作用。細(xì)胞質(zhì)中的Toll樣或者RIG-I樣受體識(shí)別雙鏈寡核苷酸后激活天然免疫炎癥反應(yīng)[14]。一種途徑是通過炎癥小體復(fù)合物以及活化的caspase-1介導(dǎo)產(chǎn)生炎癥因子IL-1β及IL-18。另一種途徑是STING激活后磷酸化IRF3及STAT6，二者最終入核起始IFN基因的翻譯[15-16]。

STING激活的具體機(jī)制還不清楚，然而，目前發(fā)現(xiàn)dsDNA被受體識(shí)別后，STING這個(gè)跨膜蛋白從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中轉(zhuǎn)移到高爾基體中，隨后與TANK結(jié)合激酶(TBK1)結(jié)合并在細(xì)胞質(zhì)中形成聚點(diǎn)，而TBK1參與調(diào)解自噬蛋白及自噬受體蛋白 P62，LC3及 ATG9a也在此定位，但 ULK1、ATG5及ATG14L并未出現(xiàn)，表明ATG蛋白參與調(diào)節(jié)STING信號(hào)通路，且此過程獨(dú)立于自噬作用[17]。此外，當(dāng)雙鏈DNA刺激ATG7及ATG16/1敲除的細(xì)胞時(shí)，細(xì)胞膜上STING的運(yùn)輸及IFN-β的分泌均表現(xiàn)異常。而當(dāng)雙鏈DNA刺激ATG9A敲除的細(xì)胞時(shí)，細(xì)胞質(zhì)中TBK-STING聚點(diǎn)會(huì)大量增加，同時(shí)IRF3磷酸化作用增強(qiáng)并促進(jìn)IFN-β，IL-6及CXCL10的分泌[18]。以上現(xiàn)象表明 ATG蛋白通過調(diào)節(jié)STING及TBK1的結(jié)合來調(diào)控DNA激活的天然免疫信號(hào)通路(圖1)，而這些作用通常獨(dú)立于自噬過程，具體的調(diào)節(jié)機(jī)制還需進(jìn)一步探究。

圖1 RIG-I樣受體型號(hào)通路[19]Fig.1 The signal pathway mediated by RIG-I like receptor[19]

1.3 ATG參與炎癥反應(yīng)最近研究報(bào)道顯示，ATG可以調(diào)節(jié) NF-κB活化。例如，BCL10與自噬接頭分子 p62/SQSTM1結(jié)合參與調(diào)節(jié)T細(xì)胞受體(TCR)介導(dǎo)的NF-κB的活化[20]。在巨噬細(xì)胞中，SQSTM1/p62依賴性清除受損的線粒體來調(diào)節(jié)NLRP3-炎性小體的激活，SQSTM1/p62的缺失導(dǎo)致炎癥小體激活和產(chǎn)生大量的 IL-1β[21]。雖然這種機(jī)制限制了過量的IL-1β依賴性炎癥，但其它研究已經(jīng)表明，自噬通過螯合A20來增強(qiáng)特異性組織巨噬細(xì)胞中的NF-κB活性，以提高抗真菌免疫力[22]。這一證據(jù)表明，自噬可以通過許多途徑包括不同細(xì)胞類型中的NF-κB活化來調(diào)節(jié)促炎信號(hào)傳導(dǎo)。由于自噬在免疫系統(tǒng)中起多重作用，自噬活性的紊亂可能會(huì)影響自身免疫的發(fā)生[7]。

2 ATG蛋白參與抗動(dòng)物病原侵染

2.1 抑制病毒復(fù)制ATG12-ATG5/ATG16L1蛋白復(fù)合物與其它一些自噬蛋白共同參與機(jī)體抗細(xì)菌、病毒等病原的侵染[23]。宿主與病原均利用自噬相關(guān)的細(xì)胞器或組份來抑制或促進(jìn)病毒的復(fù)制，而這與傳統(tǒng)的自噬途徑無關(guān)。屬于人獸共患病的諾如病毒是一種單鏈RNA病毒，機(jī)體在IFN-γ介導(dǎo)的抵抗該病毒感染時(shí)需要一些自噬相關(guān)的細(xì)胞器或組份以非降解形式參與。在此期間，IFN-γ活化的巨噬細(xì)胞促使一部分ATG蛋白阻礙病毒復(fù)制復(fù)合體的形成。值得注意的是，巨噬細(xì)胞感染諾如病毒所產(chǎn)生的IFN-γ的抗病毒作用還需要 ATG12-ATG5、ATG7、ATG16L1的參與，尤其是ATG5，因?yàn)椴《驹贏TG5敲除的細(xì)胞中可以正常增殖。同時(shí)JAK-STAT信號(hào)通路也可以被激活，但此過程并不誘發(fā)自噬、溶酶體酶降解作用及自噬體與ATG4B或溶酶體的融合作用。至于上述自噬蛋白干擾病毒復(fù)制的機(jī)制還不清楚。相反，自噬蛋白beclin1、LC3、ATG4B、ATG5、ATG7和ATG12對(duì)丙肝病毒(Hepatitis C Virus，HCV)蛋白翻譯、病毒復(fù)制及子代病毒的分泌有關(guān)鍵作用，而非干擾病毒生命周期[24-26]。

最近研究顯示，通過siRNA screen方法篩選到至少36%的ATG蛋白可參與調(diào)控6種病毒的復(fù)制，并且通過進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證實(shí)ATG13及FIP200這兩種蛋白參與調(diào)控小RNA科病毒人獸共患病腦心肌炎病毒(Encephalomyocarditis virus，EMCV)及柯薩奇病毒(Coxsackievirus，CV)的復(fù)制[27]。研究者還發(fā)現(xiàn)，ATG13敲除后對(duì)單純皰疹病毒、泡沫病毒等病毒的復(fù)制不產(chǎn)生影響，CV的復(fù)制受到了抑制，而EMCV及其它小RNA科病毒的復(fù)制能力卻提高了。鼠胚胎纖維細(xì)胞中ATG13敲除后，流感病毒的復(fù)制能力提高，而在U2OS及Hela細(xì)胞中ATG13的敲除對(duì)該病毒的復(fù)制無影響，表明在不同細(xì)胞系中，病毒與細(xì)胞的相互作用機(jī)制是不同的。最終，他們還通過高通量測(cè)序篩選出與抗病毒天然免疫、細(xì)胞凋亡等重要生理功能相關(guān)的一些因子，因此推測(cè)，ATG13及FIP200蛋白可能是通過以上機(jī)制來調(diào)控病毒復(fù)制的[27]。

有研究報(bào)道，ATG5-ATG12參與口蹄疫病毒(Footand-Mouth Disease Virus，F(xiàn)MDV)的復(fù)制。FMDV感染ATG5-ATG12敲低的PK-15細(xì)胞，與野生型FMDV相比，病毒的復(fù)制能力提高。在FMDV感染后的IBRS-2細(xì)胞中過表達(dá) ATG5-ATG12，發(fā)現(xiàn)ATG5-ATG12能夠正向調(diào)控NF-κB信號(hào)通路，但在BHK-21細(xì)胞中沒有顯著影響。使用qPCR和ELISA檢測(cè)到IFN-I產(chǎn)生，以及細(xì)胞因子的大量產(chǎn)生，包括：CXCL10、PKR、RIG-I、MDA5等等[28]。

2.2 破壞動(dòng)物寄生蟲納蟲泡自噬蛋白還參與與自噬不相關(guān)的抗胞內(nèi)寄生蟲感染作用。弓形蟲感染宿主后，寄生在未活化的巨噬細(xì)胞中并通過抑制納蟲泡與溶酶體結(jié)合來持續(xù)增殖[29]。然而活化的巨噬細(xì)胞通過兩種機(jī)制來限制弓形蟲增殖，進(jìn)一步將其殺死并清除。一種是通過CD40-CD40L信號(hào)激活自噬的機(jī)制，另一種是利用IFN-γ誘發(fā)的破壞納蟲泡膜并進(jìn)一步清除病原及膜碎片的機(jī)制，此途徑可以通過p47 GTPase IIGP1進(jìn)行調(diào)節(jié)且依賴ATG5的非自噬相關(guān)功能。研究表明，當(dāng)弓形蟲感染ATG5敲除的巨噬細(xì)胞后，觀察到細(xì)胞中完整的納蟲泡且蟲體無法被清除。其可能的機(jī)制是ATG5缺失后阻礙了IIGP1向納蟲泡膜的聚集轉(zhuǎn)而出現(xiàn)在胞內(nèi)的膜泡中，因此推斷ATG5的缺失抑制了IIGP1向弓形蟲納蟲泡的運(yùn)輸[30]。由于在納蟲泡附近沒有發(fā)現(xiàn)膜結(jié)構(gòu)組裝的自噬體，所以判斷此過程不依賴于自噬。然而，在ATG5敲除及野生型的細(xì)胞中，觀察不到LC3在胞內(nèi)的定位。在先前的報(bào)道稱，在弓形蟲感染后，星型膠質(zhì)細(xì)胞被IFN-γ激活，IIGP1信號(hào)附近可檢測(cè)到LC3向被破壞的納蟲泡聚集[31-32]。ATG5及 LC3在抗弓形蟲的免疫反應(yīng)中發(fā)揮何種關(guān)鍵作用尚未定論。

2.3 清除流產(chǎn)布魯氏菌感染流產(chǎn)布魯氏菌是一種胞內(nèi)寄生菌，它可以侵染多種細(xì)胞并在其中增殖。當(dāng)其被巨噬細(xì)胞吞噬內(nèi)化后形成布魯氏小體(Brucella-containing vacuoles，BCV)，這些膜泡與核內(nèi)體及溶酶體進(jìn)行一定程度融合可避免被內(nèi)溶酶體的降解。BCV的酸化對(duì)于激活布魯氏菌毒力因子(VirB)基因的啟動(dòng)子是必須的，VirB操縱子編碼IV型分泌系統(tǒng)[33]，該系統(tǒng)可以將細(xì)菌LPS釋放到宿主細(xì)胞中并有助于BCV向內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的轉(zhuǎn)移，最終在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中大量增殖形成內(nèi)質(zhì)網(wǎng)衍生型的BCV(rBCVs)，細(xì)菌在此增殖。布魯氏菌在巨噬細(xì)胞及上皮細(xì)胞中增殖的后期會(huì)轉(zhuǎn)移到具有自噬性能的膜泡中，稱之為自噬BCVs(aBCVs)，這對(duì)于布魯氏菌在胞內(nèi)完成其生命周期及在胞間傳遞至關(guān)重要[33]。aBCVs是內(nèi)溶酶體系統(tǒng)晚期的組份蛋白，它的產(chǎn)生依賴一些 ATG蛋白如 ULK1、BECLIN1、ATG14L及Ptdins3P參與的自噬體的形成[12]。相反，敲除一些對(duì)自噬泡的延伸起重要作用的蛋白，如ATG5、ATG7、ATG16L1、ATG4B及LC3B，或一些對(duì)自噬體成熟有關(guān)鍵作用的因子，如UVRAG及RAB9，則不會(huì)影響到aBCVs的形成及菌體的繁殖。ATG蛋白在宿主清除布魯氏菌感染過程中也發(fā)揮重要作用，研究表明，敲除了自噬相關(guān)蛋白的自噬功能缺陷型HeLa細(xì)胞或者ATG基因突變的巨噬細(xì)胞中BCV的形成及布魯氏菌向內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的運(yùn)輸均不受影響[33]。

2.4 宿主-病原互作ATG12-ATG5/ATG16L1蛋白復(fù)合物同其它一些自噬相關(guān)蛋白共同參與宿主抗病原如細(xì)菌及病毒的侵染[11]。細(xì)胞與病毒均利用這些蛋白或者自噬相關(guān)的膜結(jié)構(gòu)來促進(jìn)或抑制病毒復(fù)制，而這些過程不依賴于自噬。如宿主細(xì)胞在抗諾如病毒感染過程中依賴IFN-γ激活巨噬細(xì)胞及相關(guān)ATG蛋白的參與來抑制MNV復(fù)制復(fù)合體的組裝，干擾病毒基因復(fù)制。值得關(guān)注的是，ATG12-ATG5、ATG7及 ATG16L1參與了巨噬細(xì)胞中 IFN-γ抗MNV感染作用，但此過程不引起像自噬、溶酶體蛋白酶降解及自噬體與溶酶體或者ATG4B的融合等過程的發(fā)生[11]。

3 結(jié)論與展望

研究者通過對(duì)不同病毒包括人獸共患病病源、動(dòng)物病源以及人源病毒等的研究，發(fā)現(xiàn)ATG蛋白不僅能夠通過其本身具有的自噬功能清除入侵的病原體，還能通過其非依賴自噬的功能去調(diào)節(jié)病毒的復(fù)制，例如：調(diào)節(jié)宿主天然免疫信號(hào)通路、與病毒抗原相互作用等等。但是目前對(duì)這些自噬相關(guān)蛋白在抗病源的功能認(rèn)知上仍然存在局限性。近年來，通過對(duì)宿主免疫性及相關(guān)病原致病性的研究發(fā)現(xiàn)ATG蛋白單獨(dú)或與其它ATG蛋白共同作用參與這些過程并且發(fā)揮重要的作用，而且這些作用往往不依賴于自噬過程。ATG蛋白除了自噬功能之外在動(dòng)物病原微生物方面的研究目前還是一個(gè)新的領(lǐng)域，相信今后隨著ATG蛋白分子生物學(xué)特性逐步被揭示，這方面的研究會(huì)越來越多。目前，國(guó)內(nèi)外相關(guān)實(shí)驗(yàn)室大都構(gòu)建了大多數(shù)自噬基因敲除的小鼠品系，這也為揭示ATG蛋白自噬功能之外的其它重要生物學(xué)功能提供了必要條件。然而，單獨(dú)敲除單個(gè)ATG基因或幾個(gè)具有相同功能的ATG基因還不足以掌握其全部的生物學(xué)功能。所以，隨著分子生物方法的進(jìn)一步發(fā)展，相信會(huì)有更優(yōu)的方法可以供研究者利用，為ATG蛋白在動(dòng)物病源微生物中重要功能的揭示提供可能，使其更好服務(wù)人類社會(huì)。