徐林芳，卞兆連，邵建國

（南通市第三人民醫(yī)院，江蘇226006）

中國是世界上原發(fā)性肝癌高發(fā)國家,約占全球原發(fā)性肝癌患者的55%,居我國惡性腫瘤發(fā)病率的第三位[1],其原因可能與我國乙型肝炎病毒（hepatitis B virus,HBV）高感染率有關(guān),目前肝細胞肝癌（hepatocellular carcinoma,HCC）的發(fā)病機制仍未完全闡明。HCC早期發(fā)現(xiàn)較為困難,而且疾病發(fā)展快、轉(zhuǎn)移早、預后差、生存期短。鋅指蛋白（Zinc finger protein）是諾貝爾獎獲得者Klug及其同事在爪蟾轉(zhuǎn)錄因子ⅢA（TFⅢA）蛋白質(zhì)中首先發(fā)現(xiàn)[2],是一種重要的轉(zhuǎn)錄因子。大量研究發(fā)現(xiàn),鋅指蛋白是哺乳動物細胞內(nèi)含量最豐富的蛋白質(zhì)模體,能夠與各種特異性DNA結(jié)合[3]。進一步研究發(fā)現(xiàn)鋅指蛋白與真核基因的表達調(diào)控密切相關(guān)。目前鋅指蛋白和腫瘤的關(guān)系已經(jīng)成為國內(nèi)外關(guān)注的熱點。鋅指蛋白146（Zinc finger protein146,ZNFl46）是一種分子量為33 kDa蛋白,包含10個鋅指結(jié)構(gòu),在肝、骨骼、心肌等組織有表達,腸癌、胰腺癌中ZNF146蛋白的表達明顯增高[4]。本研究收集我院2017年1月—2017年10月行手術(shù)治療HCC患者40例腫瘤組織及癌旁組織標本,主要闡述ZNFl46在肝細胞肝癌中的表達及其與臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料 行手術(shù)治療的HCC患者40例,其中男性32例,女性8例,年齡54.8±9.0歲；肝癌直徑＜5 cm 21例,≥5 cm 19例；臨床分期Ⅰ～Ⅱ期18例,Ⅲ～Ⅳ期22例；乙肝病毒表面抗原（HBsAg）陽性30例,陰性10例。收集患者手術(shù)切除的腫瘤組織及癌旁組織標本,新鮮組織標本-80℃保存。病理檢查標本置于中性福爾馬林固定后常規(guī)切片、HE染色。所有患者術(shù)后病理證實均為原發(fā)性HCC。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準,所有組織標本的采集均獲得患者的知情同意。

1.2 實驗試劑 引物由上海生工生物工程有限公司合成；RNAiso Plus,Takra逆轉(zhuǎn)錄試劑盒,熒光定量PCR試劑盒[寶生物工程（大連）有限公司]；ZNF146抗體（美國Abnova公司）；辣根過氧化物酶結(jié)合的二抗（上海長島生物科技有限公司）；磷酸鹽緩沖液(PBS)以及檸檬酸鹽緩沖液（pH值6.0）（福州邁新生物技術(shù)開發(fā)公司）。

1.3 方法

1.3.1PCR檢測：提取組織RNA并測定RNA濃度,使用逆轉(zhuǎn)錄試劑在Applied Biosystems GeneAmp 9700 PCR 系統(tǒng)（37 ℃,15 min；85 ℃,5s；4 ℃,5 min）行逆轉(zhuǎn)錄,獲取的cDNA置于-20℃冰箱保存。使用Takra熒光定量試劑行PCR（CFX Connect Real time System）檢測基因表達量。根據(jù)Power=2-△△CT計算相對表達量,對Power值進行統(tǒng)計學分析。引物序列：ZNF146 引物序列：Forward 5’-TTTTGAGTGTAAAGATTGCGGG-3’,Reverse5’-TCATGCTCAGTAAGGTTGGATT3’；β -actin 引 物 序 列 ：Forward 5’-GGACTTCGAGCAAGAGATGG3’,Reverse 5’-AGGAAGGAAGGCTGGAAGA-3’。

1.3.2 免疫組化檢測：組織標本以10%福爾馬林固定24 h,常規(guī)脫水,石蠟包埋,4 μm厚連續(xù)切片。二甲苯、乙醇等梯度脫蠟至水,PBS洗滌。3%H2O2孵育15 min,隨后以檸檬酸鹽緩沖液（pH=6.0）行微波抗原修復12 min,冷卻后用非免疫羊血清室溫孵育30 min以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶。立即滴加抗ZNF146抗體（兔抗人,1∶150稀釋）,置于濕盒中4℃冰箱過夜。次日PBS洗滌后,滴加辣根過氧化物酶結(jié)合的二抗（鼠抗兔,即用型）孵育30 min,以DAB顯色約1 min,蘇木精復染,封片。由病理醫(yī)師根據(jù)著色強度評分,分別統(tǒng)計不表達（無棕色陽性顆粒）,弱陽性（+,少量棕色陽性顆粒表達）,強陽性（++,大量棕色陽性顆粒表達）。

1.4 統(tǒng)計學處理 采用GraphPadPrism6統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)分析。計量資料組間比較采用配對t檢驗,計數(shù)資料組間比較采用χ2檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 HCC腫瘤組織和癌旁組織中ZNF146的表達熒光定量PCR檢測結(jié)果顯示,40例HCC腫瘤組織中ZNF146 mRNA表達明顯高于癌旁組織,差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05,圖1A）。免疫組化檢測同樣顯示腫瘤組織中ZNF146蛋白的表達較癌旁組織明顯增高,差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05,圖1B,表1）。圖1見封二。

表1 HCC腫瘤組織及癌旁組織中ZNF146的表達 例

2.2 HCC腫瘤組織中ZNF146表達與臨床病理參數(shù)的關(guān)系 在不同分期及不同大小腫瘤中ZNF146表達的差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）,腫瘤直徑≥5 cm、Ⅲ/Ⅳ期腫瘤患者中ZNF146表達明顯增加。而在患者年齡、性別、是否有HBsAg感染的不同組別中ZNF146表達差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表2。

表2 ZNF146表達與肝癌患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系

3 討 論

鋅指蛋白是指含有結(jié)合Zn2+穩(wěn)定的短的可以自我折疊形成“手指”樣結(jié)構(gòu)的一類蛋白質(zhì),是哺乳動物中最大的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子家族,在胚胎發(fā)育、細胞分化、細胞轉(zhuǎn)化及細胞周期的調(diào)控中發(fā)揮重要功能。研究發(fā)現(xiàn)大多數(shù)鋅指蛋白與惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切有關(guān)[5],鋅指蛋白家族中ZNF23在原發(fā)性HCC中的表達明顯降低,并且與順鉑的化療作用密切相關(guān),順鉑可能通過上調(diào)HCC系表達ZNF23,從而促進細胞凋亡[6]。ZNF146是鋅指蛋白家族的成員之一,有研究發(fā)現(xiàn)其在乳腺癌中的表達明顯增加,并且隨著細胞分化程度的降低,其表達量增加更為明顯,提示ZNF146對診斷乳腺癌有一定的價值[7]。Ferbus等[8]通過免疫組化發(fā)現(xiàn)結(jié)腸癌組織中ZNF146的表達明顯增加,而正常腸道黏膜上皮和炎癥腸道黏膜上皮很少表達,提示ZNF146可能與腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)。ZNF146在肝臟中也有表達,但與HCC發(fā)生的關(guān)系不明確。本研究結(jié)果顯示,HCC腫瘤組織中ZNF146 mRNA及其蛋白的表達明顯高于癌旁組織,差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）,提示ZNF146可能參與HCC的發(fā)生和演進。

HCC的發(fā)生是一個多階段、多因素長期暴露和累積的結(jié)果,與HBV感染導致的慢性乙型肝炎密切相關(guān)[9]。研究發(fā)現(xiàn),多種鋅指蛋白參與HCC的發(fā)病機制,例如ZNF165[10],ZNF233[11]等。我們進一步通過研究HCC腫瘤組織中ZNF146的表達與臨床病理參數(shù)的關(guān)系,發(fā)現(xiàn)在腫瘤不同分期及不同大小腫瘤中ZNF146表達的差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）,腫瘤直徑≥5 cm、Ⅲ/Ⅳ期腫瘤患者中ZNF146表達明顯增加,而在患者年齡、性別、是否有HBsAg感染的不同組別中ZNF146表達差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）,提示ZNF146與腫瘤的分化及進展密切相關(guān),ZNF146表達的異常可能是HCC發(fā)病機制的因素之一。

綜上所述,本研究發(fā)現(xiàn)ZNF146與HCC發(fā)生發(fā)展密切相關(guān),ZNF146有可能是HCC潛在的生物標志物之一,但具體作用的分子機制和信號通路還需要進一步通過肝癌細胞生物學功能實驗和荷瘤動物實驗等手段深入研究。