鄧 茜，張愛(ài)華，侯立江，王 丹，許盛寶

(西北農(nóng)林科技大學(xué)農(nóng)學(xué)院，陜西楊凌 712100)

小麥(TriticumaestivumL.)是世界上重要的糧食作物之一，保障小麥高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)是我國(guó)乃至全世界當(dāng)前重要的課題。小麥根系在其整個(gè)生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中扮演著非常重要的角色，特別是早期根的數(shù)目、總根長(zhǎng)和側(cè)根的數(shù)目，對(duì)于小麥產(chǎn)量影響較大[1-2]。

油菜素內(nèi)酯(brassinolide, BL)是活性最強(qiáng)的一種甾醇類(lèi)植物激素(brassinosteroids,BRs)[3-7]。BRs參與植物一系列的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程，如胚根和胚軸的伸長(zhǎng)、葉片伸展、基因表達(dá)調(diào)控、開(kāi)花和結(jié)果、細(xì)胞程序性死亡等，最典型的就是作用于細(xì)胞的伸長(zhǎng)和分裂[3-4]，以及參與植物對(duì)各種生物或非生物脅迫耐受過(guò)程[5-6]。在擬南芥中，BRs不僅參與根細(xì)胞伸長(zhǎng)，而且還參與根系發(fā)育的許多方面，例如根毛形成、側(cè)根起始、菌根形成、根細(xì)胞分裂和根分生組織原生韌皮部的分化[8-9]。目前，關(guān)于BRs對(duì)小麥根系影響的研究較少，限制了其在小麥中的應(yīng)用。研究表明，BRs對(duì)小麥種子的萌發(fā)[10]、幼苗抗冷性[11]、抗旱性[12]以及萌發(fā)期間抗鹽性[13]具有重要的調(diào)控功能。在小麥孕穗期和灌漿期，噴灑低濃度BL可以增強(qiáng)植株抗青枯能力，降低不育小穗數(shù)，提高結(jié)實(shí)率和粒重[14]。BL浸種可促進(jìn)小麥根和胚芽鞘的伸長(zhǎng)，并增加干物質(zhì)量[15]。先前的研究也觀察到，BRs對(duì)小麥根系發(fā)育有調(diào)控功能[16]。此外，在小麥根系發(fā)育中，細(xì)胞伸長(zhǎng)和增殖是緊密相關(guān)的，而B(niǎo)R對(duì)細(xì)胞增殖的影響更為突出[17-19]，但需要系統(tǒng)的研究來(lái)闡明BR在小麥根系發(fā)育中的具體功能，從而促進(jìn)油菜素內(nèi)酯在小麥根系改良中的應(yīng)用。

本研究通過(guò)水培方法探究了不同濃度的BL及BRs合成抑制劑BRZ對(duì)小麥幼苗根系的形態(tài)、長(zhǎng)度、直徑和側(cè)根原基、側(cè)根及其長(zhǎng)出速率的影響，以期解析BRs在小麥根系發(fā)育的調(diào)控功能，為利用BRs的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試小麥(TriticumaestivumL.)品種為中國(guó)春和遼春10號(hào)。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與方法

1.2.1 小麥幼苗的水培

精選飽滿種子在蒸餾水中浸泡5～8 h，用消毒液(綠傘)對(duì)種子進(jìn)行表面消毒(消毒液∶蒸餾水=3∶2)5～6 min，然后用蒸餾水沖洗5～7次。在滅菌的培養(yǎng)皿(直徑15 cm)中鋪兩層濾紙，加入5 mL蒸餾水潤(rùn)濕，將沖洗干凈的種子均勻地?cái)[放在濾紙上，再緩慢加入15 mL蒸餾水，蓋上蓋子，置于4 ℃ 條件下春化24 h。然后在白天 23 ℃、晚上 20 ℃、光/暗時(shí)間14 h/10 h、光強(qiáng) 110 μmol·L-1·m-2·s-1、濕度 60%～70% 的光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，大概 12 h 后露白，培養(yǎng)2 d 后將長(zhǎng)勢(shì)一致的幼苗作為實(shí)驗(yàn)所用材料，并移至發(fā)芽盒(12 cm×12 cm)。每個(gè)發(fā)芽盒中放20株，發(fā)芽盒用保鮮膜覆蓋，在保鮮膜上戳孔，以保證小麥的根系可以正常的呼吸。

1.2.2 小麥幼苗的處理

發(fā)芽盒中恢復(fù)生長(zhǎng)一天后，開(kāi)始用不同濃度BL(0 nmol·L-1、5 nmol·L-1、25 nmol·L-1、100 nmol·L-1、1 μmol·L-1)和BRs合成抑制劑BRZ(100 nmol·L-1、1 μmol·L-1和10 μmol·L-1)處理。每種處理設(shè)置 3 次重復(fù)，每次重復(fù)取15～20株長(zhǎng)勢(shì)一致的幼苗進(jìn)行觀察和測(cè)定，處理溶液每 2 d更換1次。所有處理均放置于光照培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)條件同上。

1.2.3 亞甲基藍(lán)染色

將切下的根固定在無(wú)水乙醇∶冰醋酸溶液(3∶1，v/v)中，4 ℃下至少24 h；之后用蒸餾水漂洗5 min，并浸泡在次氯酸鈉溶液(5%，v/v)中抽真空10 min，再置于大氣下 10 min；倒掉次氯酸鈉溶液，用蒸餾水清洗干凈；最后用亞甲基藍(lán)(0.01%，溶解于蒸餾水中)染色[20]。經(jīng)過(guò)亞甲基藍(lán)染色的小麥幼苗，側(cè)根和側(cè)根原基處顯色會(huì)明顯加深，便于觀察和統(tǒng)計(jì)。

1.2.4 試劑

試驗(yàn)所用的BL和BRZ均購(gòu)買(mǎi)于上海Sigma-Aldrich公司。BL 用乙醇配成 10 mmol·L-1的母液，根據(jù)需要按一定的比例用蒸餾水稀釋配成濃度為 0 nmol·L-1、5 nmol·L-1、25 nmol·L-1、100 nmol·L-1、1 μmol·L-1的使用液，其中0 nmol·L-1是對(duì)照；BRZ 用DMSO配制成 10 mmol·L-1的母液，其使用濃度為 100 nmol·L-1、1 μmol·L-1和10 μmol·L-1。

1.4 幼苗根系的觀察與測(cè)定

用BL和BRZ 處理 10 d后，觀察小麥幼苗根系的外形，并用數(shù)碼相機(jī)(Canon eos 600d)對(duì)小麥幼苗的根系進(jìn)行拍照，并用 Image-J軟件測(cè)量小麥幼苗最長(zhǎng)的根長(zhǎng)。每個(gè)處理統(tǒng)計(jì) 20 株種苗并求平均值，每個(gè)處理重復(fù) 3 次。

小麥種子根經(jīng)亞甲基藍(lán)染色后，在體視顯微鏡(Nikon SMZ1500)下觀察并記錄側(cè)根數(shù)目，每個(gè)處理統(tǒng)計(jì) 20 株幼苗并求平均值，每個(gè)處理重復(fù) 3 次。在距小麥幼苗根尖 1 cm 位置處徒手切片，并在ZEISS生物熒光顯微鏡(Imager M2)下觀察、拍照，測(cè)量其直徑。由于在本實(shí)驗(yàn)時(shí)期小麥幼苗根系數(shù)目在5～7根之間，所以小麥幼根初始原基數(shù)目及其長(zhǎng)出速率測(cè)定時(shí)均將小麥最中間的三個(gè)根作為統(tǒng)計(jì)對(duì)象。側(cè)根原基長(zhǎng)出速率用同一時(shí)間點(diǎn)已長(zhǎng)出的側(cè)根與初始側(cè)根原基數(shù)目的比值來(lái)表示。

1.5 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)均用Microsoft Excel 2010進(jìn)行整理、分析和作圖，用SPSS 17.0進(jìn)行方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 BL對(duì)小麥幼苗根形態(tài)的影響

在不同濃度BL和BRZ處理后，小麥幼苗地上部分形態(tài)沒(méi)有明顯的變化，但是根系形態(tài)發(fā)生了嚴(yán)重扭曲，根長(zhǎng)、根直徑和側(cè)根數(shù)目也發(fā)生不同程度的變化(圖1)。

2.2 BL對(duì)小麥幼苗根長(zhǎng)的影響

低濃度BL促進(jìn)了小麥幼苗根系伸長(zhǎng)，但高濃度BL抑制了小麥幼苗根系生長(zhǎng)(圖2A和圖2B)。其中，中國(guó)春的根長(zhǎng)在5 nmol·L-1BL處理下較0 nmol·L-1處理(對(duì)照)極顯著增加，但是BL濃度增加至100 nmol·L-1和1 μmol·L-1時(shí)，根長(zhǎng)的生長(zhǎng)又受到極顯著的抑制。100 nmol·L-1和1 μmol·L-1BRZ處理對(duì)中國(guó)春根長(zhǎng)沒(méi)有顯著影響，直到BRZ濃度增加到10 μmol·L-1時(shí)中國(guó)春幼苗根系的伸長(zhǎng)才被明顯抑制。遼春10號(hào)受BL和BRZ影響的趨勢(shì)和中國(guó)春基本一致。

植物根系的生長(zhǎng)主要是因?yàn)榉稚鷧^(qū)細(xì)胞的分裂和伸長(zhǎng)區(qū)細(xì)胞的擴(kuò)張[21]。不同濃度BL及BRZ處理對(duì)兩個(gè)小麥品種的幼苗根長(zhǎng)均產(chǎn)生了影響。不同處理下兩個(gè)小麥品種幼苗的成熟細(xì)胞長(zhǎng)度和根長(zhǎng)的表現(xiàn)基本一致(圖2C和圖2D)。在5 nmol·L-1BL處理下成熟細(xì)胞長(zhǎng)度最大，與對(duì)照相比顯著增加；但是根分生區(qū)域的細(xì)胞長(zhǎng)度隨著B(niǎo)L濃度的增大受到的抑制越來(lái)越嚴(yán)重(圖2E和圖2F)。由此可知，BL主要通過(guò)調(diào)控根成熟細(xì)胞長(zhǎng)度來(lái)影響小麥幼苗根系長(zhǎng)度。

1～5 分別表示0 nmol·L-1、5 nmol·L-1、25 nmol·L-1、100 nmol·L-1、1 μmol·L-1BL處理；6～8 分別表示100 nmol·L-1、1 μmol·L-1和10 μmol·L-1BRZ處理。下圖同。

1～5 represent BL concentrations of 0 nmol·L-1, 5 nmol·L-1, 25 nmol·L-1, 100 nmol·L-1and 1 μmol·L-1, respectively, and 6～8 represent 100 nmol·L-1, 1 μmol·L-1and 10 μmol·L-1BRZ, respectively. The same in the other figures.

圖1不同濃度BL和BRZ處理對(duì)小麥幼苗生長(zhǎng)發(fā)育的影響

Fig.1EffectsofdifferentconcentrationsofBLandBRZongrowthanddevelopmentofwheatseedlings

2.3 BL對(duì)小麥幼苗根尖解剖結(jié)構(gòu)的影響

從小麥幼苗根尖的橫切結(jié)構(gòu)(圖 3)看，與對(duì)照相比，BL處理濃度越大，根系直徑越??；而不同濃度BRZ處理均使根系直徑增加。根尖維管柱內(nèi)分化出木質(zhì)部，且皮層細(xì)胞層次清晰、排列整齊，內(nèi)皮層細(xì)胞“馬蹄”型加厚非常明顯，維管柱的結(jié)構(gòu)與對(duì)照沒(méi)有特別明顯的差異(圖 3A和圖3C)；兩個(gè)品種根細(xì)胞大小出現(xiàn)了很明顯的差異。根據(jù)以上結(jié)果推測(cè)，BL可能通過(guò)影響根系皮層細(xì)胞大小來(lái)影響小麥幼苗根的粗細(xì)。

2.4 BL對(duì)小麥幼苗側(cè)根數(shù)目的影響

在BL處理下中國(guó)春和遼春10號(hào)幼苗的側(cè)根數(shù)目與對(duì)照均存在肉眼可見(jiàn)的差異(圖1、圖4A和圖4B)。隨著B(niǎo)L處理濃度的增加，兩品種幼苗的側(cè)根數(shù)目均極顯著增加(圖4C和圖4D)；BRZ總的說(shuō)來(lái)會(huì)抑制幼苗側(cè)根數(shù)目。其中中國(guó)春側(cè)根數(shù)目在100 nmol·L-1BL處理下最多，而遼春10號(hào)在5 nmol·L-1BL處理下最多。

圖柱上的大小寫(xiě)字母分別表示處理間差異在0.01和0.05水平上顯著。下圖同。

Different capital and lower-case letters mean significantly different among the treatments at 0.01 and 0.05 levels. The same in figures 3-5.

圖2不同濃度BL和BRZ處理對(duì)小麥幼苗根長(zhǎng)、成熟細(xì)胞長(zhǎng)度和根分生區(qū)長(zhǎng)度的影響

Fig.2EffectsofdifferentconcentrationsofBLandBRZonrootlength,maturecelllengthandrootmeristemsizeofwheatseedlings

2.5 BL對(duì)小麥幼苗側(cè)根原基及其長(zhǎng)出速率的影響

側(cè)根的數(shù)目決定于側(cè)根原基起始數(shù)目及側(cè)根原基長(zhǎng)出的速率[22]。由圖5A和圖5B可知，中國(guó)春的幼苗用100 nmol·L-1及以下濃度的BL處理時(shí)，其起始側(cè)根原基數(shù)相比于對(duì)照顯著增加，但是當(dāng)BL濃度增加到1 μmol·L-1時(shí)，其起始側(cè)根原基數(shù)顯著減少；而遼春10號(hào)的幼苗只有在5 nmol·L-1BL處理時(shí)起始側(cè)根原基數(shù)顯著增加，當(dāng)BR濃度上升至100 nmol·L-1時(shí)，開(kāi)始出現(xiàn)抑制；用BRZ處理時(shí)，兩個(gè)品種基本無(wú)明顯變化。兩個(gè)品種的測(cè)定結(jié)果表明 BL作用于側(cè)根原基起始過(guò)程，可以增加起始側(cè)根原基數(shù)目，而且遼春10號(hào)比中國(guó)春對(duì)BL更加敏感。雖然起始原基數(shù)目顯著增加，但是考慮到側(cè)根原基突破主根表皮之后才算是側(cè)根，所以本研究對(duì)整個(gè)主根進(jìn)行側(cè)根原基長(zhǎng)出率的統(tǒng)計(jì)和計(jì)算(圖 5C和圖5D)。經(jīng)過(guò)BL處理后小麥幼苗的側(cè)根原基長(zhǎng)出比例會(huì)顯著提高，說(shuō)明適宜濃度BL會(huì)促進(jìn)小麥側(cè)根原基的形成，加快側(cè)根原基突破主根皮層的速度，從而使側(cè)根數(shù)目增加。

圖3 不同濃度 BL 和 BRZ 處理對(duì)小麥幼苗根系直徑的影響Fig.3 Effects of different concentrations of BL and BRZ on root diameter of wheat seedlings

3 討 論

植物根系是獲得養(yǎng)分的關(guān)鍵，根系的形態(tài)調(diào)整是植物適應(yīng)環(huán)境的重要策略，對(duì)于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)意義重大。小麥?zhǔn)堑湫偷捻毟抵参铮瑳](méi)有主根，根系由初生根和次生根以及其上著生的各級(jí)側(cè)根構(gòu)成，側(cè)根分枝可以達(dá)到6級(jí)，是小麥根系的主要組成部分[23]。根長(zhǎng)及側(cè)根的分布對(duì)于確定根系統(tǒng)結(jié)構(gòu)至關(guān)重要，直接關(guān)系到根系對(duì)不同土層水分與養(yǎng)分的吸收。近年來(lái)，單子葉植物相應(yīng)研究也陸續(xù)開(kāi)展，尤其是水稻根系的相關(guān)研究，并取得了一定的進(jìn)展，但目前有關(guān)BR對(duì)小麥根系的研究還鮮有報(bào)道[24-25]。

本研究發(fā)現(xiàn)，BRs對(duì)小麥幼苗地上部分的影響不明顯，但對(duì)根系生長(zhǎng)發(fā)育卻具有明顯效應(yīng)，這可能與該研究采用水培實(shí)驗(yàn)方法相關(guān)。此外，BRs對(duì)小麥種苗根系效應(yīng)呈現(xiàn)明顯的濃度梯度，即低濃度促進(jìn)，高濃度抑制。本研究中，促進(jìn)根長(zhǎng)生長(zhǎng)的最適濃度為5 nmol·L-1，超過(guò)該濃度時(shí)，根長(zhǎng)的抑制現(xiàn)象逐漸嚴(yán)重；低于此濃度時(shí)，對(duì)小麥根長(zhǎng)有促進(jìn)效應(yīng)，但同時(shí)會(huì)造成根系形態(tài)異常，這均與前人的研究結(jié)果基本一致[26-27]。

本研究首次報(bào)道了BRs對(duì)小麥根系直徑具有顯著效應(yīng)，并通過(guò)切片技術(shù)進(jìn)行了細(xì)胞學(xué)分析，這在其他植物研究中均未有相應(yīng)的報(bào)道，其是否為小麥等禾本科特有的調(diào)控，或是外源BL處理帶來(lái)的表型，仍需要進(jìn)一步的證實(shí)。本研究結(jié)果表明，BRs對(duì)于小麥幼苗側(cè)根數(shù)目也表現(xiàn)出低促高抑的現(xiàn)象，適宜濃度處理下(中國(guó)春為100 nmol·L-1, 遼春10號(hào)為5 nmol·L-1)，幼苗側(cè)根數(shù)目均極顯著的增加，但不同小麥品種對(duì)BR的敏感性明顯不同，因此其對(duì)應(yīng)的最適濃度也存在差異；當(dāng)濃度高于1 μmol·L-1時(shí)，BRs則對(duì)小麥側(cè)根數(shù)目產(chǎn)生抑制作用，與Gupta之前在擬南芥上的研究結(jié)果相近[28]。此外，在適宜濃度的BRs處理下，除了起始側(cè)根原基的數(shù)目增加，小麥側(cè)根原基生長(zhǎng)速率也顯著提高，這和本實(shí)驗(yàn)室前期在擬南芥上的研究結(jié)果一致，說(shuō)明BRs可能通過(guò)正向調(diào)控一種絲氨酸羧肽酶BRS1使植物側(cè)根原基更容易突破根皮層，使側(cè)根原基生長(zhǎng)速率增快，從而使植物的側(cè)根數(shù)目顯著增加[29]。

圖4 不同濃度 BL 和 BRZ 處理對(duì)小麥幼苗根數(shù)目的影響Fig.4 Effects of different concentrations of BL and BRZ on root number of wheat seedlings

根據(jù)兩種小麥品種的對(duì)比可知，不同小麥品種響應(yīng)BR信號(hào)途徑和強(qiáng)弱可能有所差異，具有遺傳多樣性。外源施用BRs時(shí)，對(duì)于不同的品種可能需要考慮不同的最優(yōu)處理濃度。此外，雖然實(shí)驗(yàn)室結(jié)果表明油菜素內(nèi)酯可用于小麥幼苗根系生長(zhǎng)的調(diào)節(jié)，但其對(duì)于大田小麥的作用效果和具體作用機(jī)制，還有待于進(jìn)一步研究。

圖5 不同濃度 BL 和 BRZ 處理對(duì)小麥幼苗側(cè)根發(fā)育的影響Fig.5 Effects of different concentrations of BL and BRZ on lateral roots development of wheat seedlings