牛艷路，朱 浩，王 佩，陳坤梅，李宏偉，陳耀鋒

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué)農(nóng)學(xué)院，陜西楊凌 712100； 2.中國(guó)科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所，北京 100101； 3.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院麻類研究所，湖南長(zhǎng)沙 410205)

作物的產(chǎn)量主要來(lái)自光合作用的物質(zhì)積累，但植物的光能利用率僅為1%～2%[1]，因此選育高光效品種來(lái)提高作物的光能利用率是提升作物產(chǎn)量的有效途徑。但傳統(tǒng)的育種方法育種年限長(zhǎng)且利用的基因有限，而轉(zhuǎn)基因技術(shù)的發(fā)展大大縮短了育種周期，為小麥基因資源的利用、種質(zhì)創(chuàng)新和品種改良開辟了新的途徑和方法。1992年，世界第一株轉(zhuǎn)基因小麥誕生[2]，此后小麥轉(zhuǎn)基因技術(shù)不斷發(fā)展優(yōu)化，目前作物轉(zhuǎn)基因技術(shù)已涉及抗病蟲[3]、抗逆[4]、品質(zhì)改良[5]和產(chǎn)量提高[6-7]等多方面。因此，可以利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)將高光效基因轉(zhuǎn)入小麥品種，結(jié)合傳統(tǒng)育種方式，選育高光效種質(zhì)。有研究發(fā)現(xiàn)，將高光效丙酮酸磷酸雙激酶(PPDK)基因轉(zhuǎn)入秈稻，磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因轉(zhuǎn)入水稻、小麥和大豆等作物均能夠引起轉(zhuǎn)基因植株的產(chǎn)量或光合特性的提高[8-11]。

GRAS蛋白是存在于多種高等植物中的重要的轉(zhuǎn)錄因子，GRAS的名字來(lái)源于最初被發(fā)現(xiàn)的三個(gè)功能成員GIBBERELLICACIDINSENSITIVE(GAI)、REPRESSOROFGAI(RGA)和SCARECROW(SCR)[12]。它有8個(gè)亞家族：DELLA、LISCL、HAM、PATI、SCR、LS、SCL3和SHR，在植物分生組織形成、光、赤霉素信號(hào)傳導(dǎo)、生長(zhǎng)發(fā)育、生物及非生物脅迫過(guò)程中起著重要的作用[13-14]。目前，已在水稻[15]、葡萄[16]、胡楊[17]、佛手[18]、枳[19]和煙草[20]等多種植物中發(fā)現(xiàn)GRAS家族基因。1996年，SCR基因在擬南芥中被克隆，該基因在擬南芥?zhèn)雀纬缮掀痍P(guān)鍵作用[21]。2010年，Ma等[17]克隆了胡楊中的一個(gè)GRAS基因PeSCL7，轉(zhuǎn)PeSCL7基因的擬南芥對(duì)干旱和鹽的耐受性顯著增強(qiáng)。2015年，陳坤梅等[22]從小麥品種小偃54中篩選并克隆了強(qiáng)光效應(yīng)基因TaSCL14，并證實(shí)TaSCL14基因是小麥GRAS轉(zhuǎn)錄因子家族的一員；利用大麥條紋花葉病毒介導(dǎo)的基因沉默技術(shù)將TaSCL14基因沉默，發(fā)現(xiàn)小麥植株的生物量下降，凈光合速率降低，并通過(guò)基因槍介導(dǎo)法將TaSCL14基因?qū)肫胀ㄐ←溒贩N小偃39中，獲得了一批轉(zhuǎn)TaSCL14基因的小麥植株。為了獲得農(nóng)藝性狀優(yōu)良的轉(zhuǎn)TaSCL14基因小麥品系，本研究在此基礎(chǔ)上，采用普通PCR和qRT-PCR技術(shù)分析轉(zhuǎn)TaSCL14基因小麥后代中外源基因的遺傳穩(wěn)定性，并對(duì)主要的農(nóng)藝性狀特性進(jìn)行分析，以期為該基因在高光效品種改良中的應(yīng)用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試材料為普通小麥小偃39以及以小偃39為受體通過(guò)基因槍轉(zhuǎn)化法獲得的轉(zhuǎn)TaSCL14基因的T1～T3代植株。轉(zhuǎn)基因后代分別于2015-2016和2016-2017年度種植于陜西省楊凌示范區(qū)西北農(nóng)林科技大學(xué)轉(zhuǎn)基因材料試驗(yàn)田，四周設(shè)置保護(hù)行，按田間常規(guī)管理。

1.2 PCR檢測(cè)

在轉(zhuǎn)基因小麥拔節(jié)期進(jìn)行取樣，CTAB法提取基因組DNA，根據(jù)TaSCL14基因全長(zhǎng)及載體序列設(shè)計(jì)正反向引物進(jìn)行基因組DNA分子檢測(cè)。正向引物F:5′-GCCGTGGATGACAGTG AGA-3′，反向引物 R：5′-TAATACGACTCACT ATAGGG-3′。PCR擴(kuò)增體系與程序參考TaqDNA聚合酶(TaKaRa，日本)說(shuō)明書，其中循環(huán)數(shù)為35，退火溫度為55 ℃，延伸時(shí)間為2 min，擴(kuò)增產(chǎn)物用1.2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.3 RNA的提取和qRT-PCR

植物總RNA提取參照植物總RNA小量提取試劑盒(美基生物，廣州)說(shuō)明書進(jìn)行。RNA提取后用1.2 %瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)完整性，反轉(zhuǎn)錄采用PrimerScriptTMII 1st strand cDNA synthesis Kit(TaKaRa，日本)。以反轉(zhuǎn)錄得到的 cDNA為模板，目的基因的引物序列為F：5′-CGAGGAGACGGGGCACAGG-3′，R：5′-CGTC CATCAGGTGCCTGAAGTGAC-3′；小麥Actin基因作為內(nèi)參，內(nèi)參引物序列為F：5′-TGTTGT TCTCAGTGGAGGTTCT-3′，R：5′- CTGTAT TTCCTTTCAGGTGGTG-3′，在ABI PRISM 7700熒光定量PCR儀(ABI，美國(guó))上進(jìn)行qRT-PCR。反應(yīng)體系與程序參考2×SuperReal Color PreMix(天根生化，北京)說(shuō)明書，其中循環(huán)數(shù)為40，退火溫度為60 ℃，退火時(shí)間為45 s。反應(yīng)結(jié)束后，通過(guò)熔解曲線分析確認(rèn)擴(kuò)增的特異性。每個(gè)樣品3次技術(shù)重復(fù)，試驗(yàn)共設(shè)3次生物學(xué)重復(fù)，根據(jù)2-ΔΔCT法計(jì)算TaSCL14基因的相對(duì)表達(dá)量。

1.4 轉(zhuǎn)基因植株農(nóng)藝性狀調(diào)查

2015年10月種植轉(zhuǎn)TaSCL14基因T1、T2代株行，以受體小麥小偃39為對(duì)照，T2代經(jīng)由前一年篩選T1代陽(yáng)性單株得到，行長(zhǎng)1 m，行距0.2 m，株距20 cm。在小麥進(jìn)入越冬期停止分蘗后調(diào)查的分蘗作為冬前分蘗，在年后小麥起身前調(diào)查的分蘗作為冬后分蘗，分蘗芽從基部葉腋內(nèi)伸出2 cm作為分蘗的計(jì)數(shù)標(biāo)準(zhǔn)。植株成熟后調(diào)查全部植株的株高、有效分蘗、穗長(zhǎng)、小穗數(shù)、穗粒數(shù)和千粒重。選擇T2代農(nóng)藝性狀表現(xiàn)優(yōu)良且篩選為陽(yáng)性植株的4個(gè)株系于2016年10月按株系種植作為T3代，每個(gè)株系種植5行，行長(zhǎng)1.5 m，行距0.2 m，株距5 cm，隨機(jī)區(qū)組排列，3次重復(fù)，每次重復(fù)包含2個(gè)受體對(duì)照。幼苗期每個(gè)小區(qū)隨機(jī)調(diào)查15株小麥的冬前和冬后分蘗情況，成熟后從每個(gè)小區(qū)抽取10株，測(cè)量T3代小麥各個(gè)株系的農(nóng)藝性狀以及每平方米穗數(shù)用于測(cè)產(chǎn)。

1.5 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)處理及分析使用軟件Excel 2010和SPSS 22.0進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 轉(zhuǎn) TaSCL14基因T1、T2代植株的PCR檢測(cè)及農(nóng)藝性狀分析

2.1.1 轉(zhuǎn)TaSCL14基因T1、T2代植株的PCR檢測(cè)結(jié)果

T0代得到56個(gè)單株，經(jīng)篩選，T0代單株所結(jié)種子種植為株行，T1代種植40個(gè)株行，共170株；T2代種植62個(gè)株行，共236株。轉(zhuǎn)基因小麥T1代和T2代植株P(guān)CR檢測(cè)結(jié)果表明，所有陽(yáng)性植株均擴(kuò)增到約1 700 bp的特異片段，而陰性植株和對(duì)照(小偃39)中無(wú)特異條帶(圖1)。通過(guò)統(tǒng)計(jì)共檢測(cè)出陽(yáng)性植株297株，其中T1代95株，T2代202株，陽(yáng)性率分別為55.9% 和85.6%。

2.1.2 轉(zhuǎn)TaSCL14基因小麥T1、T2代主要農(nóng)藝特性

調(diào)查結(jié)果(表1)表明，對(duì)照小偃39及轉(zhuǎn)基因T1、T2代在冬后分蘗數(shù)、有效分蘗數(shù)、株高、穗長(zhǎng)、小穗數(shù)和千粒重等主要農(nóng)藝性狀上均無(wú)顯著差異，但T1代轉(zhuǎn)基因植株的穗粒數(shù)顯著低于對(duì)照；T2代轉(zhuǎn)基因植株的冬前分蘗數(shù)顯著高于對(duì)照。T1、T2代的千粒重略低于對(duì)照，T2代的農(nóng)藝性狀整體優(yōu)于T1代。

M：DL2000 ；1：對(duì)照(小偃39)；2～9：陽(yáng)性植株；10：陰性植株。

M:DL2000; 1:CK(Xiaoyan39); 2-9:positive plants; 10:negative plant.

圖1 轉(zhuǎn)基因植株中 TaSCL14基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果

*表示在0.05水平上與對(duì)照差異顯著。下同。

* indicates significant difference with CK at 0.05 level.The same in the following tables.

把T1、T2代各陽(yáng)性單株的農(nóng)藝性狀與對(duì)照小偃39進(jìn)行比較，分析各性狀高于和低于對(duì)照的植株數(shù)量占各世代植株總數(shù)的比例以及各性狀均值與對(duì)照的差異程度，結(jié)果(表2)表明，T1、T2代陽(yáng)性植株的冬后分蘗數(shù)平均比對(duì)照多4.26個(gè)和5.03個(gè)，高出了對(duì)照33.89%和40.10%，差異較大，表明該基因的轉(zhuǎn)入對(duì)冬后分蘗的影響較大。此外，T1代中千粒重高于對(duì)照的植株數(shù)僅占26.19%，而千粒重低于對(duì)照的植株數(shù)占73.81%，在T2代這兩個(gè)值分別為21.05%和78.95%，這表明TaSCL14基因的轉(zhuǎn)入對(duì)轉(zhuǎn)基因小麥T1、T2代千粒重主要產(chǎn)生負(fù)效應(yīng)。同時(shí)，發(fā)現(xiàn)從T1代到T2代各農(nóng)藝性狀高于對(duì)照的植株占比在上升。

表2 T1、T2代植株農(nóng)藝性狀與對(duì)照的比較Table 2 Comparison of agronomic characters between T1 and T2 plants and controls

2.2 轉(zhuǎn) TaSCL14基因T3代植株分子檢測(cè)及農(nóng)藝性狀分析

2.2.1 轉(zhuǎn)TaSCL14基因T3代植株分子檢測(cè)結(jié)果

對(duì)4個(gè)來(lái)源不同的轉(zhuǎn)TaSCL14基因T3代株系3-4、3-7、3-8和3-11及對(duì)照小偃39，在拔節(jié)期每個(gè)株系和對(duì)照隨機(jī)選取10株提取基因組DNA，進(jìn)行PCR檢測(cè)，結(jié)果(圖2)顯示，對(duì)照株系小偃39中不能擴(kuò)增出目的條帶，而轉(zhuǎn)基因株系全部可以擴(kuò)增到約1 700 bp的特異片段，說(shuō)明4個(gè)轉(zhuǎn)基因株系陽(yáng)性率能達(dá)到90%以上，表明這4個(gè)轉(zhuǎn)基因株系已基本純合。

M:DL2000；1～4:株系3-4、3-7、3-8、3-11；5:對(duì)照(小偃39)。

M:DL2000; 1-4:Line 3-4, 3-7, 3-8, 3-11; 5:CK(Xiaoyan 39).

圖2轉(zhuǎn)基因T3代株系的PCR檢測(cè)結(jié)果

Fig.2PCRampliconfromtransgenicT3strains

為了研究TaSCL14基因在轉(zhuǎn)基因后代的表達(dá)情況，對(duì)不同的轉(zhuǎn)基因T3代株系和對(duì)照材料在幼苗期取樣進(jìn)行qRT-PCR。結(jié)果(表3)表明，4個(gè)轉(zhuǎn)基因株系3-4、3-7、3-8和3-11的表達(dá)水平均高于對(duì)照，且與對(duì)照呈極顯著差異。

2.2.2 轉(zhuǎn)TaSCL14基因T3代小麥農(nóng)藝性狀分析

4個(gè)轉(zhuǎn)基因株系在T3代整個(gè)生育時(shí)期各項(xiàng)農(nóng)藝性狀的觀測(cè)結(jié)果(表4)表明，轉(zhuǎn)基因各株系的冬前分蘗數(shù)、冬后分蘗數(shù)和有效分蘗數(shù)都高于對(duì)照，其中轉(zhuǎn)基因株系3-7的冬前分蘗數(shù)與對(duì)照存在極顯著差異，株系3-11與對(duì)照存在顯著差異；轉(zhuǎn)基因株系3-7的冬后分蘗數(shù)與對(duì)照存在極顯著差異，株系3-4與對(duì)照存在顯著差異。4個(gè)轉(zhuǎn)基因株系有效分蘗數(shù)的變化范圍為7.3～8.5，平均比對(duì)照高2.68個(gè)；差異顯著性分析表明，轉(zhuǎn)基因株系3-4與對(duì)照存在顯著差異，株系3-7和3-11均與對(duì)照存在極顯著差異，表明目的基因的導(dǎo)入對(duì)T3代3-4、3-7和3-11株系分蘗的影響較為明顯。各株系小穗數(shù)均比對(duì)照上升，株系3-4的小穗數(shù)與對(duì)照存在顯著差異。但各轉(zhuǎn)基因株系的株高和穗長(zhǎng)均與對(duì)照不存在顯著差異。

表3 轉(zhuǎn)基因株系及其對(duì)照 TaSCL14基因的相對(duì)表達(dá)量Table 3 Relative expression of TaSCL14 gene in transgenic lines and their control

**表示與對(duì)照差異極顯著(P<0.01)。下同。

** indicates significant difference with CK at 0.01 level.The same in the following tables.

T3代中4個(gè)轉(zhuǎn)基因株系的每平方米穗數(shù)和穗粒數(shù)都高于對(duì)照，穗粒數(shù)平均高3.39粒，但差異不顯著。轉(zhuǎn)基因株系的千粒重均不同程度的比對(duì)照下降，平均下降了2.73 g，株系3-7極顯著低于對(duì)照。但轉(zhuǎn)基因株系3-4、3-8和3-11的理論產(chǎn)量高于對(duì)照，這與它們每平方米穗數(shù)和穗粒數(shù)的增加有關(guān)(表5)。

表4 T3代轉(zhuǎn)基因株系的農(nóng)藝性狀Table 4 Agronomic traits of transgenic wheat lines in T3 plants

表5 T3代轉(zhuǎn)基因株系的產(chǎn)量性狀Table 5 Yield traits of transgenic wheat in lines of T3 plants

3 討 論

近年來(lái)植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)研究發(fā)展迅速，抗除草劑大豆和油菜、抗蟲玉米和棉花等轉(zhuǎn)基因品種已有商業(yè)化種植[23]，取得了巨大的經(jīng)濟(jì)和社會(huì)效益。小麥?zhǔn)钱愒戳扼w植物，基因組相對(duì)較大，遺傳背景復(fù)雜，這造成了它的轉(zhuǎn)化難度較大。外源基因能否在轉(zhuǎn)基因小麥中穩(wěn)定的遺傳表達(dá)是轉(zhuǎn)基因小麥具有研究?jī)r(jià)值的關(guān)鍵。本研究發(fā)現(xiàn)外源基因TaSCL14在轉(zhuǎn)基因小麥T1～T3代中都能夠被檢測(cè)到，這證實(shí)了轉(zhuǎn)基因植株的真實(shí)性。目的基因TaSCL14在連續(xù)多代中都能被檢測(cè)到，這同王軍衛(wèi)[24]等研究轉(zhuǎn)基因后代的遺傳表現(xiàn)相一致，表明目的基因能在后代中穩(wěn)定遺傳。成功轉(zhuǎn)入外源基因的轉(zhuǎn)基因后代的農(nóng)藝性狀除受品種本身的遺傳特性影響外，還與種植條件和種植環(huán)境有關(guān)。李陳建等[25]研究T4代轉(zhuǎn)sGNA基因小麥株系在大田條件下的生長(zhǎng)情況發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因株系的生長(zhǎng)特性未發(fā)生改變，個(gè)體正常生長(zhǎng)發(fā)育，但千粒重和小穗數(shù)達(dá)到了顯著水平。閆海生等[26]進(jìn)行轉(zhuǎn)OsCYP2基因水稻的研究，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因植株的分蘗數(shù)明顯增加，但是穗粒數(shù)、千粒重等多個(gè)性狀表現(xiàn)低于對(duì)照。實(shí)驗(yàn)室在前期研究中發(fā)現(xiàn)，TaSCL14基因沉默會(huì)致使小麥沉默株系植株變得矮小、分蘗數(shù)和葉片數(shù)減少，生物量下降，光合性能降低。而TaSCL14基因在擬南芥中的過(guò)表達(dá)能提高轉(zhuǎn)基因植株的產(chǎn)量和光合特性[22]。

本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在田間栽培條件相同的情況下，轉(zhuǎn)TaSCL14基因小麥植株能夠正常生長(zhǎng)發(fā)育，植株的形態(tài)特征與對(duì)照相比變化不大，但在轉(zhuǎn)基因小麥后代的分蘗、小穗數(shù)、穗粒數(shù)和千粒重等方面均發(fā)生了一些變化。轉(zhuǎn)基因植株T1代的穗粒數(shù)、T2代的冬前分蘗數(shù)都與對(duì)照存在顯著差異，T1、T2代均有75%左右的轉(zhuǎn)TaSCL14基因植株千粒重低于對(duì)照，可見TaSCL14基因的轉(zhuǎn)入對(duì)大多數(shù)植株的千粒重呈現(xiàn)負(fù)效應(yīng)。TaSCL14基因在T3代的四個(gè)轉(zhuǎn)基因株系中都過(guò)表達(dá)，4個(gè)轉(zhuǎn)基因株系的株高、穗長(zhǎng)、穗粒數(shù)與對(duì)照無(wú)差異，大多數(shù)株系的各時(shí)期分蘗數(shù)都顯著或極顯著高于對(duì)照，千粒重都低于對(duì)照，可見轉(zhuǎn)入基因過(guò)表達(dá)對(duì)于分蘗和千粒重的影響較大。這與T1和T2代的田間農(nóng)藝性狀表現(xiàn)也基本一致。秦保平等[27]對(duì)于轉(zhuǎn)Hpa110-42基因小麥株系的研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因各株系小穗數(shù)和千粒重顯著上升；王瑞霞等[28]對(duì)轉(zhuǎn)反義PLDγ基因小麥的研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因株系的株高、千粒重、單株穗數(shù)與受體相比顯著增加，這和本研究結(jié)果(T1～T3代株高與對(duì)照無(wú)差異，千粒重下降)有所不同，可能是因?yàn)檗D(zhuǎn)基因使用的受體材料、外源基因的種類、基因整合位點(diǎn)、整合的拷貝數(shù)等存在差異[29-30]。同時(shí)，本研究也發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因T2代植株總體的農(nóng)藝性狀要優(yōu)于T1代植株，T3代各株系的農(nóng)藝性狀要整體優(yōu)于對(duì)照，這可能是由于在轉(zhuǎn)基因高代目的基因的分離已基本趨于穩(wěn)定，因此轉(zhuǎn)基因植株的性狀也較為穩(wěn)定。

本研究表明，外源TaSCL14基因的導(dǎo)入能夠影響小麥轉(zhuǎn)基因后代的部分農(nóng)藝性狀，隨著篩選世代的增加，基因的遺傳表達(dá)趨于穩(wěn)定且株系間的表達(dá)量存在差異。由于TaSCL14基因?qū)儆谵D(zhuǎn)錄因子基因且是一個(gè)強(qiáng)光響應(yīng)基因，所以調(diào)查轉(zhuǎn)基因小麥田間農(nóng)藝表現(xiàn)和篩選出穩(wěn)定轉(zhuǎn)基因株系對(duì)后期進(jìn)一步探究該基因?qū)τ谛←湽夂咸匦杂绊懢哂兄匾饬x。