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LC-MS/MS法測定人血漿中4種非典型抗精神分裂藥物及2種代謝物

2019-01-21 05:07:36劉文榮莊緒慧孫合園朱麗萌康毅敏王文艷
關(guān)鍵詞:氯氮阿立哌唑奧氮

劉文榮,莊緒慧,孫合園,朱麗萌,康毅敏,王 帆,王文艷

(1.煙臺大學(xué)新型制劑與生物技術(shù)藥物研究山東省高校協(xié)同創(chuàng)新中心、分子藥理和藥物評價教育部重點實驗室(煙臺大學(xué)),山東 煙臺 264005;2.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)精神醫(yī)學(xué)研究室,呼和浩特 010110;3.北京大學(xué)北京回龍觀醫(yī)院,北京 100096)

精神分裂癥是一種慢性、致殘性、終生性的疾病,需要長期維持治療[1].非典型抗精分裂藥物如利培酮(risperidone)、氯氮平(clozapine)、奧氮平(olanzapine)和阿立哌唑(aripiprazole)等是精神分裂癥的主要一線治療藥物.精神分裂癥的主要治療策略是抗精神病藥物單藥治療(AMP)和抗精神病藥物多藥治療(APP,同時聯(lián)用至少2種抗精神分裂藥物).盡管精神分裂癥治療指南推薦采用AMP[1],臨床上常采用APP來增加療效并改善非典型抗精神病藥治療的服藥依從性問題[2-3],但是多藥聯(lián)用可能引起臨床上的藥物-藥物相互作用(DDI)[4-5].據(jù)報道,利培酮、阿立哌唑、氯氮平和奧氮平可經(jīng)CYP2D6、CYP3A4或CYP1A2代謝且均為P-糖蛋白的底物[6-8],可能發(fā)生競爭性抑制引起臨床相關(guān)的DDI.

目前,有許多研究報道了同時測定血漿中抗精神分裂藥物濃度的液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)方法[9-12],這些方法主要應(yīng)用于常規(guī)分析和AMP的治療藥物濃度監(jiān)測(TDM)研究,很少涉及APP.本研究的目的是建立一種LC-MS/MS方法,用于同時測定接受AMP或APP的治療穩(wěn)定期精神分裂患者血漿中的利培酮、氯氮平、奧氮平、阿立哌唑和活性代謝物9-羥基利培酮(9-hydroxyrisperidone)、脫氫阿立哌唑(dehydroaripiprazole)的穩(wěn)態(tài)濃度(cps),并從藥代動力學(xué)的角度探討APP潛在的DDI.

1 實驗材料

1.1 主要儀器

TSQ Quantum Access型三重四級桿串聯(lián)質(zhì)譜儀(美國Thermo公司),配備有ESI離子源和Lcquan數(shù)據(jù)處理器;Aglient 1100系列高效液相色譜儀(美國安捷倫公司),配有四元輸液泵、自動進樣器、柱溫箱;HSC-24A氮吹儀(天津恒奧科技有限公司);XS-105生物分析天平(瑞士METTLER TOLEDO公司).

1.2 藥品與試劑

利培酮(99.9%)和氯氮平(>98%)購自中國藥品生物制品檢定所(北京);阿立哌唑(99.8%)從永諾制藥公司獲得(宜昌);脫氫阿立哌唑(≥98%)從呈貢生物制品公司獲得(昆明);脫氫阿立哌唑-d8(98.8%)購自多倫多研究化學(xué)品公司(多倫多,加拿大);9-羥基利培酮(≥98%)、奧氮平(≥98%)、利培酮-d4(98.6%)、9-羥基利培酮-d4(>99.9%)和奧氮平-d8(99.8%)均購自Sigma公司(美國);色譜純的甲醇、乙腈、異丙醇購自Merck公司(德國);其余所用試劑為分析純.

2 實驗方法

2.1 色譜質(zhì)譜條件

色譜條件: 色譜柱為Agilent XDB-C18柱(150×2.1 mm,3.5 μm);流速:0.3 mL/min;柱溫箱:30 ℃;進樣體積:5 μL;流動相:A相:乙腈(含0.01%冰乙酸),B相:水(含0.01%冰乙酸).采用梯度洗脫的方式,梯度洗脫條件(流動相A線性增加)如下:0~1.5 min,20%~90%A;1.5~2.0 min,90% A;2.0~2.1 min,90%~20% A;2.1~6.5%,20% A.

質(zhì)譜條件: 電噴霧離子化電離源(ESI),噴霧電壓為4 000 V;毛細管溫度為350 ℃;鞘氣和輔助氣壓力分別為30和5 psi;碰撞氣壓力為1.5 minni-Torr.每種分析物的選擇性反應(yīng)監(jiān)測參數(shù)和保留時間見表1.

表1 6種分析物和4種同位素內(nèi)標的LC-MS/MS參數(shù)Tab.1 The optimized LC-MS/MS parameters of six analytes and four isotope Internal standard

2.2 儲備液和標準工作液的制備

儲備液的配制:分別精密稱取利培酮、9-羥基利培酮、阿立哌唑、脫氫阿立哌唑、氯氮平、奧氮平約5 mg,用甲醇稀釋至10 mg/mL,作為儲備液.利培酮-d4、9-羥基利培酮-d4、奧氮平-d8、脫氫阿立哌唑-d8為100 μg/mL的甲醇溶液.取每種分析物的儲備液適量,混合,用甲醇連續(xù)稀釋以制備所需濃度的標準工作液和質(zhì)控工作液.同法制備混合的內(nèi)標工作液.所有儲備液和工作溶液均置于4 ℃冰箱中備用.

2.3 血漿樣品處理

精密移取25 μL血漿樣品置于干凈的10 mL玻璃管中,加內(nèi)標工作液5 μL和0.1 mol/L氫氧化鈉溶液25 μL,渦旋30 s,加3 mL混合提取液(正己烷∶二氯甲烷∶異丙醇=2/1/0.1,v/v/v),渦旋震蕩3 min,混合物以2 000×g離心10 min,將有機相轉(zhuǎn)移至干凈的玻璃管中并于35 ℃空氣流吹干,加入200 μL流動相A∶B(50∶50,v/v)復(fù)溶并在16 200×g下離心10 min,取5 μL進樣分析.

2.4 方法學(xué)驗證

根據(jù)《中國藥典》(2015版)生物樣品定量分析方法驗證的指導(dǎo)原則進行了方法學(xué)驗證,驗證的內(nèi)容主要包括專屬性、殘留效應(yīng)、線性范圍、精密度準確度、基質(zhì)效應(yīng)、穩(wěn)定性和稀釋可靠性[18].

2.5 樣品來源

共收集到46位患者的血漿樣品,28人接受AMP,18人接受APP(利培酮與阿立哌唑、利培酮與氯氮平、氯氮平與奧氮平聯(lián)用各6人).所有患者均服用抗精神分裂藥至少1個月且無酗酒、吸毒或重大器質(zhì)性疾病.穩(wěn)態(tài)下的血液樣品收集時間為早上8點(除阿立哌唑組取血時間是服藥后24 h外,其余用藥組均為服藥后12 h).離心分離血漿并保存于-20 ℃待測.本研究經(jīng)內(nèi)蒙古第三醫(yī)院倫理委員會批準,參加本次研究的患者在入組前本人或其家屬均已簽署知情同意書.

2.6 數(shù)據(jù)分析

C/D ratio的結(jié)果用Mean±SD進行描述性統(tǒng)計分析.采用獨立樣本t檢驗(SPSS 17.0)比較AMP和APP的C/D ratio的差異.P<0.05即認為有統(tǒng)計學(xué)意義.

3 結(jié)果與討論

3.1 方法開發(fā)

在該方法中,使用25 μL血漿進行分析,能達到文獻報道200 μL血漿體系的相似的靈敏度[13].采用液-液萃取(LLE)方法,用混合溶劑正己烷-二氯甲烷-異丙醇(2/1/0.1)純化樣品,該方法比文獻報道的固相萃取經(jīng)濟快速[14],且提取回收率約90%.此外,同位素內(nèi)標具有與分析物相似的電離和提取效率,確保了測定結(jié)果的準確可靠.

3.2 方法學(xué)驗證

3.2.1 專屬性 通過分析來自6個不同供體的空白血漿來考察方法的專屬性.結(jié)果表明,在測定條件下,血漿中內(nèi)源性物質(zhì)不干擾分析物的測定,所有分析物和內(nèi)標均無相互干擾,代表性色譜圖如圖1所示.

1—10分別為奧氮平-d8、奧氮平、9-羥基利培酮-d4、9-羥基利培酮、利培酮-d4、利培酮、氯氮平、脫氫阿立哌唑-d8、脫氫阿立哌唑、阿立哌唑

3.2.2 線性范圍、定量下限和殘留效應(yīng) 將5 μL系列標準溶液加至25 μL空白血漿中制備相當于血藥濃度氯氮平、奧氮平、阿立哌唑和脫氫阿立哌唑為4、10、20、40、100、200、400、1 000 ng/mL;利培酮和9-羥基利培酮為0.4、1、2、4、10、20、40、100 ng/mL的標準曲線,同時,制備一個空白樣品和一個零濃度樣品(含內(nèi)標).在標準曲線最高濃度樣品進樣后分析空白樣品來考察殘留效應(yīng).結(jié)果表明所有標準曲線線性關(guān)系良好,相關(guān)系數(shù)大于0.995 8.此外,在最高濃度樣品進樣后,空白樣品中所有分析物和內(nèi)標的保留時間處無明顯色譜峰,表明無殘留.制備定量下限樣品每分析6批樣本,連續(xù)3個分析批考察定量下限,結(jié)果如表2所示,每個分析物定量下限的批內(nèi)批間精密度(用CV表示)均小于12.0%,準確度(用RE表示)在±13.4%以內(nèi).

3.2.3 精密度和準確度 配制氯氮平、奧氮平、阿立哌唑、脫氫阿立哌唑低(10 ng/mL)、中(100 ng/mL)、高(800 ng/mL),利培酮和9-羥基利培酮低(1 ng/mL)、中(10 ng/mL)、高(80 ng/mL)濃度質(zhì)控樣品,按照2.3項下方法處理,每濃度點6平行,連續(xù)3個分析批進行批內(nèi)批間的精確度和準確度.結(jié)果如表2所示,6種分析物的CV值小于13.8%,RE值在±12.5%之內(nèi).該方法精密度和準確度符合要求.

3.2.4 基質(zhì)效應(yīng) 基質(zhì)效應(yīng)的考察通過將內(nèi)標和低或高濃度標準工作液加入到6個不同來源的經(jīng)預(yù)處理的空白血漿中,配制成相當于低、高質(zhì)控濃度的樣品,并制備相應(yīng)濃度的不含基質(zhì)的標準工作溶液,比較含基質(zhì)樣品中每種分析物和內(nèi)標的峰面積比與相應(yīng)工作溶液中的峰面積比.基質(zhì)效應(yīng)的結(jié)果表明,6種分析物經(jīng)內(nèi)標歸一化的平均基質(zhì)效應(yīng)在低濃度下為94.0%~112.4%,在高濃度下為83.9%~91.9%,并且各濃度下的CV值均低于13.7%,無明顯基質(zhì)效應(yīng).

表2 LC-MS/MS法測定人血漿中六種分析物方法的精密度和準確度Tab.2 Precision and accuracy of LC-MS/MS method for determination of six analyzes

3.2.5 穩(wěn)定性和稀釋可靠性 配制低、高濃度質(zhì)控,分別考察室溫放置2 h、自動進樣器放置6 h、3次凍融循環(huán)和-20 ℃放置6個月的穩(wěn)定性,每種條件下每濃度3樣本平行.此外,制備高于定量上限2倍的血漿樣品并在預(yù)處理時用空白血漿稀釋2.5倍來考察稀釋可靠性.各分析物在不同放置條件下穩(wěn)定性考察的結(jié)果見表3,所有分析物在上述條件下RE%在-5.9%至11.6%之間,CV均低于12.5%.表明,所有分析物在上述條件下穩(wěn)定.稀釋2.5倍后每種分析物的RE在±7.5%內(nèi)且CV小于12.4%,表明稀釋穩(wěn)定性良好.

3.3 臨床樣品分析

表3 不同條件下6種分析物在人血漿中的穩(wěn)定性(Mean±SD) (n=3)Tab.3 Stability of six analytes in human plasma under different conditions (Mean±SD) (n=3)

該方法已成功應(yīng)用于采用AMP或APP的治療穩(wěn)定期精神分裂癥患者血漿樣品分析.6.5%(3/46)患者的Cps超過TDM指南制定的實驗室警戒水平[15].WANG等報道中國患者氨磺必利的Cps明顯高于警戒水平[12].因此,有必要開展中國抗精神病藥物的TDM研究,制定相應(yīng)的TDM指南.

C/D ratio廣泛用于直接比較受試者內(nèi)部和受試者之間的差異,而不考慮服藥劑量的變化,故本實驗采用C/D ratio比較AMP和APP之間的差異[16].因利培酮主要經(jīng)CYP2D6和CYP3A4代謝為9-羥基利培酮,該代謝物具有與母體化合物相似的藥理活性[17],故分別比較了利培酮、9-羥基利培酮和總活性物質(zhì)(利培酮與9-羥基利培酮之和)的C/D ratio.利培酮AMP組(n=14)利培酮、9-羥基利培酮、總活性物質(zhì)的C/D ratio分別為1.34±1.20、13.17±6.52、17.17±9.84 ng/(mL·mg-1),APP組(n=12)分別為1.92±1.37、6.69±3.14、8.62±4.33 ng/(mL·mg-1),9-羥基利培酮和總活性物質(zhì)的C/D ratio顯著低于AMP(P分別為0.006和0.014)而利培酮無顯著性差異(P=0.284),結(jié)果見圖2.無論利培酮與氯氮平還是與阿立哌唑聯(lián)用,對利培酮、9-羥基利培酮和總活性物質(zhì)C/D ratio的影響趨勢相同.這可能是因為CYP2D6和CYP3A4是利培酮、阿立哌唑和氯氮平共同的代謝酶,氯氮平和阿立哌唑競爭抑制利培酮的代謝,體外實驗也有報道氯氮平對CYP2D6有抑制作用[18].此外,利培酮的消除半衰期(約3 h)遠低于其代謝物9-羥基利培酮(約24 h)[19].對于氯氮平組,AMP組(n=14)C/D ratio為2.77±1.04 ng/(mL·mg-1),APP組(n=12)為2.81±1.92 ng/(mL·mg-1),無統(tǒng)計學(xué)差異,結(jié)果如圖2所示,表明APP治療方式對氯氮平無影響.

圖2 AMP和APP組C/D ratio箱式圖比較Fig.2 The box figure of C/D ratio in AMP and APP medations

4 結(jié) 論

本實驗建立了快速、靈敏、可靠的LC-MS/MS方法用于同時測定精神分裂患者血漿中4種抗精神分裂藥物和2種代謝物濃度,并進行了方法學(xué)驗證.結(jié)果表明,當利培酮與氯氮平或阿立哌唑合并用藥時可能發(fā)生DDI.有必要進一步研究阿立哌唑,利培酮和氯氮平體內(nèi)和體外的競爭性抑制,并探討APP的可行性.

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