劉 敬,石曉冰,張一鳴,郝雪言,何 杰,馬成俊,李 忌,王振華

(煙臺大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院/線粒體與健康衰老研究中心,山東 煙臺 264005)

冠心病是全球范圍內(nèi)導(dǎo)致死亡和殘疾的主要原因之一.治療手段主要有藥物、經(jīng)皮冠狀動脈介入治療、冠狀動脈旁路移植術(shù)等[1],各種血運重建手段通過及時有效地恢復(fù)心肌血液灌注,可以減輕缺血導(dǎo)致的心肌損傷及壞死.然而,心肌缺血后恢復(fù)血液再灌注本身也可進一步導(dǎo)致心肌細胞損傷甚至壞死,這一現(xiàn)象被稱為心肌缺血再灌注(ischemia/reperfusi-on,I/R)損傷[2].

心肌I/R損傷會破壞線粒體穩(wěn)態(tài)平衡引起功能紊亂,如線粒體 ATP 合成減少、ROS生成增加、Ca2+超載、膜通透性增加、線粒體片段化等[3-5],這些事件相互作用從多條途徑參與 I/R過程,是心肌I/R損傷的重要原因.I/R破壞線粒體穩(wěn)態(tài)平衡進而引起結(jié)構(gòu)和功能的改變是導(dǎo)致I/R損傷的關(guān)鍵因素,研究和闡明線粒體參與I/R損傷的機制,對心肌I/R損傷線粒體保護新途徑的發(fā)現(xiàn)和減輕I/R損傷,改善心?；颊叩念A(yù)后具有重要意義[6].

藥用植物中富含的黃酮類化合物具有廣泛藥理活性,臨床用于改善血液循環(huán),降低血脂和膽固醇,防治高血壓、冠心病、心絞痛等多種心腦血管疾病,還具有止咳、祛痰、平喘、抗菌、護肝等功效[7],諸多臨床功效均與其抗氧化作用有關(guān).異甘草素是藥食同源植物甘草(GlycyrrhizauralensisFisch)中所含的一種異黃酮類化合物,近年來,國內(nèi)外學(xué)者發(fā)現(xiàn)其具有抗腫瘤、抗氧化、解痙、抗心律失常等廣泛藥理活性[8].馮斯婷等人研究了異甘草素對豚鼠心室肌細胞L型鈣通道的影響,認為這些可能是異甘草素對抗心律失常作用的機制[9].CHIN Y W等報道了在甘草根和莖的過氧亞硝酸根抗氧化試驗中異甘草素是最有潛力的抗氧化成分[10].

甘草為中藥上品,具有補脾益氣,清熱解毒,祛痰止咳,緩急止痛,調(diào)和諸藥等功效.經(jīng)典方劑炙甘草湯,又名復(fù)脈湯,臨床常用于治療功能性心律不齊、冠心病等心血管疾病[11].已有研究表明甘草查爾酮B、C、D均對心肌I/R損傷有保護作用[12-14],但未見異甘草素對心肌I/R損傷影響的報道.本文旨在探究異甘草素對心肌I/R損傷的改善作用并初步探討其作用機制,為甘草用于心肌I/R損傷的治療提供實驗依據(jù).

1 材 料

1.1 實驗動物

健康雄性SPF級昆明小鼠,體重30 ± 5 g,由濟南朋悅實驗動物研究中心提供,合格證號:SCXK (新) 2009-00101.將小鼠置于可自由飲水和飲食的12 h光照/12 h黑暗的適宜溫濕度環(huán)境中,所有動物操作均遵守實驗準則.

1.2 儀器與設(shè)備

Radnoti離體心臟灌流裝置(美國Radnoti公司);4S AD Instruments 多道生理儀(澳大利亞Powerlab);流式細胞儀(艾森生物);勻漿機(華利精工);AR-2140 型萬分之一電子天平(梅特勒-托利多儀器有限公司);HC-3018R型高速冷凍離心機(安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司);HHS-1 精密恒溫水浴鍋(金壇市醫(yī)療器械廠).

1.3 材料與試劑

異甘草素(純度>99%,成都曼思特生物科技有限公司,批號:14022603);水合氯醛(上海山浦化工有限公司,批號:20150236);JC-1熒光探針(sigma);ATP試劑盒(南京建成生物工程研究所);其他試劑均為國產(chǎn)分析純.

2 方 法

2.1 制備小鼠離體全心缺血再灌注損傷模型

采用Langendorff逆向灌流裝置建立小鼠離體心肌I/R損傷模型．取小鼠稱重,腹腔注射3%的水合氯醛麻醉劑.待小鼠完全麻醉后,迅速開胸取出心臟,置于5% CO2和95% O2混合氣充分飽和的冰浴K-H溶液(NaCl 119.0 mmol/L,NaHCO322.0 mmol/L,KCl 4.7 mmol/L,MgSO41.2 mmol/L,KH2PO41.2 mmol/L,Glucose 11.0 mmol/L,CaCl2·2H2O 2.5 mmol/L, Na-pyruvate 2.0 mmol/L,EDTA 0.5 mmol/L,pH 7.4)中,并迅速將心臟固定于Langendorff裝置上,灌流壓力76 mmHg,打開灌流閥讓K-H緩沖液緩慢的進行恒壓逆行灌流,使心臟在短時間內(nèi)恢復(fù)跳動.剪開左心耳,球囊從左心耳插入左心室,球囊內(nèi)壓調(diào)至8～10 mmHg.球囊導(dǎo)管連接壓力換能器,與4S AD Instruments生物多導(dǎo)記錄儀相連.通過生物記錄儀連續(xù)進行監(jiān)測,記錄如下指標(biāo):心率(HR)、左心室舒張壓(LVEDP)、左心室收縮壓(LVSP)、左心室發(fā)展壓(LVDP=LVSP-LVEDP),Chart 5軟件自動記錄分析左心室壓力最大下降速率(±dp/dt)、左心室壓力最大上升速率(+dp/dt)以及左心室做功(RPP=HR×LVDP).

2.2 實驗動物分組

將小鼠隨機分為3組:正常對照組(Control),模型組(I/R)和 異甘草素預(yù)處理組(ISL),ISL劑量是根據(jù)前期預(yù)實驗設(shè)定,異甘草素終濃度為30 μmol/L．正常對照組:不停灌,一直灌注KH液110 min.模型組:平衡灌注35 min,停灌30 min,再灌注45 min.ISL預(yù)處理組:灌注20 min后開始灌注含藥KH液15 min,停灌30 min,再灌注45 min.灌注結(jié)束后,將小鼠心臟快速取下,于-80 ℃冷凍保存,以備進行后續(xù)實驗.

2.3 心肌線粒體分離

采用差速離心法提取心肌線粒體.將小鼠心臟取下置于冰浴的分離緩沖液(蔗糖 300 mmol/L,HEPES 10 mmol/L,EDTA 0.2 mmol/L,pH值7.4)中,將心臟組織剪碎,用勻漿機將組織進行勻漿.將勻漿后的混懸液進行差速離心,先700×g離心10 min,取離心后的上清液在7 000×g下離心10 min, 用緩沖液重懸線粒體沉淀,再次以7 000×g離心10 min.最后得到的線粒體用測定緩沖液(KCl 125 mmol/L,HEPES 20 mmol/L,MgCl23 mmol/L,EGTA 400 μmol/L,DTT 300 μmol/L,KH2PO45 mmol/L,pH值7.2)稀釋備用.線粒體濃度根據(jù)BCA蛋白定量方法確定.心肌線粒體提取全過程必須在低溫下進行.

2.4 離體線粒體膜電勢測定

分離得到的心肌線粒體用測定緩沖液稀釋10倍,加入JC-1熒光染料,終濃度為5 μmol/L,37 ℃避光孵育10 min,用流式細胞儀進行測定線粒體膜電勢.

2.5 心肌組織ATP含量測定

取灌流后的心肌組織,將心肌組織制成10 %勻漿,勻漿離心后取上清,然后按照南京建成的ATP 試劑盒說明中操作進行測定各實驗組心臟組織中ATP含量.

2.6 統(tǒng)計方法

3 結(jié) 果

3.1 ISL促進I/R損傷小鼠心臟功能恢復(fù)

結(jié)果如表1,停灌前給予ISL 30 μmmol/L預(yù)處理15 min后,可明顯上調(diào)LVDP、RPP和+dp/dt,下調(diào)-dp/dt(P<0.01);停灌30 min,恢復(fù)灌流后25 min,與停灌前相比,I/R對照組LVDP、RPP和± dp/dt均明顯受損(P<0.01),ISL處理組LVDP、RPP和± dp/dt均顯著高于I/R對照組(P<0.01),說明ISL預(yù)處理可顯著增強心臟功能,促進離體心臟I/R損傷后功能恢復(fù).

表1 ISL預(yù)處理小鼠離體心臟缺血再灌注損傷后心功能的影響Tab.1 Effects of ISL pretreatment on the cardiac function after ischemia/reperfusion injury in isolated mouse heart

3.2 ISL抑制I/R損傷致心肌線粒體膜電勢降低

正常的線粒體膜電位是維持線粒體進行氧化磷酸化、產(chǎn)生三磷酸腺苷的先決條件,線粒體膜電位的穩(wěn)定有利于維持細胞的正常生理功能[15-16].本實驗通過對3個不同實驗組的小鼠心臟線粒體進行膜電勢檢測,如圖1數(shù)據(jù)表明,模型組較對照組線粒體膜電勢顯著降低(P<0.01),ISL處理組較模型組線粒體膜電勢有明顯的升高趨勢(P<0.05),充分說明ISL對線粒體有保護作用,可以減輕心肌細胞的損傷,有利于維持心肌細胞的完整性.

I/R組與對照組比較,**P < 0.01;ISL組與I/R組比較,#P<0.05.

3.3 心肌組織ATP含量

細胞各種需能過程所消耗的ATP有95%為線性體所提供,因此線粒體與細胞維持正常功能密切相關(guān)[17],通過測定心肌組織ATP含量來考察心肌損傷與線粒體之間的關(guān)系．如圖2所示,與對照組相比,I/R模型組心肌組織中 ATP的含量顯著降低(P<0.01);而給予ISL處理后,心肌組織中ATP含量較模型組明顯升高(P<0.05),表明 ISL可以保護線粒體,促進ATP生成,進而為心肌組織提供能量來減輕小鼠心肌缺血再灌注損傷.

I/R組與對照組比較,**P<0.01,*P<0.05;ISL組與I/R組比較,#P<0.05.

圖2ISL對小鼠心臟缺血再灌注后ATP生成的影響
Fig.2 Effect of ISL on ATP production after ischemia/reperfu-sioninjury in isolated mouse heart

4 結(jié) 論

心肌I/R損傷可引起心肌代謝功能紊亂,并導(dǎo)致細胞嚴重受損甚至死亡,大量研究證明,在再灌注損傷過程中,線粒體功能障礙是一個非常重要的病理機制[18-19].為了研究驗證ISL對離體心肌缺血再灌注損傷的確切保護作用機制,本文通過建立改良的Langendorff逆行恒壓灌流裝置,確立了穩(wěn)定的小鼠離體心臟I/R損傷模型,以此研究ISL對小鼠離體心臟I/R損傷后心功能及心肌線粒體的影響.

實驗結(jié)果表明ISL處理組I/R后小鼠心臟動力學(xué)指標(biāo)恢復(fù)明顯優(yōu)于對照組,說明ISL可以減輕心肌I/R損傷,增強心肌收縮能力.同時對離體心肌線粒體膜電勢和心肌組織ATP含量測定的實驗中發(fā)現(xiàn)心肌缺血/再灌注損傷會破壞線粒體穩(wěn)態(tài)平衡引起功能紊亂,ISL可以保護線粒體免受損傷,促進ATP生成．綜上所述,ISL具有維持線粒體結(jié)構(gòu)功能完整性和保護心肌的功能.本研究為臨床應(yīng)用異甘草素治療心臟I/R損傷提供了理論依據(jù),為進一步研究奠定了基礎(chǔ).