楊文濤，謝寶剛，徐顏美，劉亞蘭，鄒書(shū)兵

(1.南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院器官移植科，江西南昌 330006;2.南昌大學(xué)藥學(xué)院，江西南昌33006;3.南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，江西南昌 330006;4.南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院肝膽外科，江西南昌 330006)

原發(fā)性肝細(xì)胞癌(HCC)是最常見(jiàn)的原發(fā)性惡性腫瘤之一，全球每年超過(guò)65萬(wàn)人死于HCC，且其發(fā)病率仍在逐年增加[1-2]。HCC患者早期無(wú)明顯臨床癥狀，發(fā)生隱匿，易發(fā)生轉(zhuǎn)移，往往在發(fā)現(xiàn)時(shí)已為肝癌晚期，因此，盡早發(fā)現(xiàn)和治療是提高HCC患者生存率的關(guān)鍵。當(dāng)前肝癌診斷方法有臨床癥狀、病理檢查、血清甲胎蛋白、影像學(xué)超聲和CT檢查等，但這些方法存在創(chuàng)傷性、靈敏度不高和病癥確定困難等缺點(diǎn)[3-4]。因此，尋找與肝癌發(fā)生、發(fā)展緊密相關(guān)的特征代謝物，有望為肝癌盡早診斷提供可靠、安全和靈敏的生物學(xué)指標(biāo)具有重要的臨床價(jià)值。核磁共振氫譜(1H NMR)是代謝組學(xué)研究最常使用的檢測(cè)方法，是一種高通量生物代謝物指紋檢測(cè)技術(shù)，基于原子的自旋特性通過(guò)磁場(chǎng)和射頻脈沖而作用于原子核，氫原子普遍存在于代謝物中[5-6]。1H NMR具有對(duì)樣品非破壞性、檢測(cè)物質(zhì)多樣性和準(zhǔn)確、分辨率高等優(yōu)點(diǎn)[7]。本研究應(yīng)用1H NMR方法研究了HCC患者血清的代謝組特征，旨在篩選出可靠的標(biāo)志性代謝物。

1 資料與方法

1.1標(biāo)本來(lái)源 收集南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院感染性疾病科及肝膽外科收治的肝炎及HCC患者血清作為病例組，診斷標(biāo)準(zhǔn)參照《乙型病毒性肝炎診斷標(biāo)準(zhǔn)》(WS299-2008)[8]。同期收集各項(xiàng)體檢指標(biāo)正常的健康體檢者血清作為對(duì)照組。所有研究對(duì)象均簽署知情同意書(shū)，于清晨空腹采取靜脈血3 mL，3 000 r/min離心10 min，獲得血清標(biāo)本，置于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2樣品預(yù)處理 室溫解凍保存的血清樣品，每管吸取200 μL，加入800 μL甲醇沉淀蛋白，充分漩渦振蕩后靜置10 min，12 000 r/min離心5 min，再取上清液850 μL于干凈的1.5 mL EP管中，使用高速真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀烘干。烘干后加入460 μL蒸餾水將濃縮物復(fù)溶，渦旋振蕩，超聲至溶解，取上清液445 μL至EP管中，依次加入磷酸緩沖液50 μL，TSP重水溶液50 μL，渦旋振蕩混勻，12 000 r/min離心10 min，取上清液500 μL裝入5 mm核磁管中，進(jìn)行1H NMR檢測(cè)。

1.31H NNR試驗(yàn) 采用AvanceⅡ-600MHz核磁共振儀(Bruker公司)檢測(cè)。打開(kāi)氣源開(kāi)關(guān)，待輸出氣壓平穩(wěn)，按啟動(dòng)程序按鈕，將樣品放入核磁共振儀中，打開(kāi)聯(lián)機(jī)電腦上Topspin軟件，輸入edc對(duì)核磁樣品進(jìn)行命名區(qū)分，輸入Lock選用實(shí)驗(yàn)樣品所用的氘代試劑比例90%H2O+10%D2O鎖場(chǎng)；輸入Atma命令進(jìn)行自動(dòng)調(diào)諧以獲得最佳靈敏度；輸入topshim使樣品處于一個(gè)均勻的磁場(chǎng)中，勻場(chǎng)完全后輸入zg進(jìn)行采樣使重新掃描產(chǎn)生結(jié)果，掃描采樣結(jié)束后在命令行輸入tr保存已采集的數(shù)據(jù)點(diǎn)。再直接輸入fp及apk相位轉(zhuǎn)換處理得完整1H NMR譜圖。

1.41H NMR譜的數(shù)據(jù)預(yù)處理和聚類分析 采用Topspin軟件將所有樣品1H NMR譜進(jìn)行自動(dòng)積分，手動(dòng)進(jìn)行相位校正和基線校準(zhǔn)。應(yīng)用Matlab軟件對(duì)不同指紋圖譜進(jìn)行處理，將所有樣本指紋圖譜達(dá)到較高擬合度。為減少樣品濃度誤差帶來(lái)的干擾，將處理好的1H NMR全譜數(shù)據(jù)進(jìn)行歸一化，根據(jù)不同組別樣品進(jìn)行分組編號(hào)，觀察樣品的聚離程度，刪除異常點(diǎn)，再輸入SIMCA-P+分析軟件進(jìn)行多元統(tǒng)計(jì)模式識(shí)別分析，包括主成分分析(PCA)、偏最小二乘法判別分析(PLS-DA)和正交校正偏最小二乘法-判別分析(OPLS-DA)，所有類聚分析scale均采用UV及CTR中心化處理算法，以分辨所有樣品不同代謝狀態(tài)。通過(guò)PLS-DA模型和OPLS-DA模型的變量分析獲得重要影響值(VIP，其值越大提示該變量越重要)及Loadings值繪制得到VIP荷載圖，以顏色對(duì)核磁峰的VIP值進(jìn)行編碼，顏色越紅表示該代謝物差異越顯著，顏色越藍(lán)表示該代謝物差異越不明顯。將候選特征峰VIP值>1.5的差異變量所在區(qū)間找出來(lái)，結(jié)合核磁峰的化學(xué)位移和峰形分裂特征，利用2維全相關(guān)譜(TCOSY)、網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.bmrb.wisc.ed，http://mdl.imv.liu.se，http://www.hmdb.ca)及借助標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)照鑒定和確證特征代謝物。根據(jù)1H NMR圖譜選擇峰形干擾較小部分進(jìn)行積分，得差異代謝物積分值將其進(jìn)行對(duì)數(shù)加5變換，再采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)4組數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，篩選與肝癌發(fā)生、發(fā)展相關(guān)的血清特征代謝物組。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，對(duì)乙型肝炎、HCC、健康體檢組血清代謝物的歸一化面積值進(jìn)行方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1各組研究對(duì)象血清1H NMR譜代謝物成分及比較 健康對(duì)照組、肝炎DNA陰性組、肝炎DNA陽(yáng)性、肝癌研究對(duì)象血清1H NMR圖譜中化學(xué)位移從δ為0.5～2.3的區(qū)域，放大后可明顯看出4組之間相同輪廓的相對(duì)峰高存在差異。見(jiàn)圖1。

圖1 各組研究對(duì)象血清1H NMR譜代謝物成分及比較

2.2各組研究對(duì)象組血清1H NMR圖譜聚類分析

2.2.1PCA 健康對(duì)照組和乙型肝炎組代謝物聚集在左下區(qū)域，而肝癌組代謝物聚集在右上區(qū)域，提示乙型肝炎組與健康者代謝特征存在相似性，并能較好地與肝癌組區(qū)分開(kāi)。見(jiàn)圖2。

2.2.2PLS-DA 健康對(duì)照組和乙型肝炎組代謝物聚集在右側(cè)區(qū)域，而肝癌組代謝物聚集在左側(cè)區(qū)域。見(jiàn)圖3。

注：A組為健康對(duì)照組；B組為乙型肝炎DNA陰性組；C組為乙型肝炎DNA陽(yáng)性組；D組為肝癌組

圖2各組研究對(duì)象血清樣品1H NMR檢測(cè)結(jié)果PCA得分圖

2.2.3OPLS-DA 各組樣品聚類明顯，且左邊肝癌組與其他組能顯著區(qū)分。見(jiàn)圖4。

注：A組為健康對(duì)照組；B組為乙型肝炎DNA陰性組；C組為乙型肝炎DNA陽(yáng)性組；D組為肝癌組

圖3各組研究對(duì)象血清樣品1H NMR檢測(cè)結(jié)果PLS-DA得分圖

2.3健康對(duì)照組、乙型肝炎組、HCC組研究對(duì)象血清聚類差異獲得候選特征峰 各組研究對(duì)象VIP荷載圖結(jié)果見(jiàn)圖5。

注：A組為健康對(duì)照組；B組為乙型肝炎DNA陰性組；C組為乙型肝炎DNA陽(yáng)性組；D組為肝癌組

圖4各組研究對(duì)象血清樣品1H NMR檢測(cè)結(jié)果OPLS-DA得分圖

注：1為脂質(zhì)；2為亮氨酸；3為異亮氨酸；4為纈氨酸；5為丙氨酸；6為醋酸；7為琥珀酸；8為?；撬?/p>

圖5各組研究對(duì)象血清1H NMR圖譜VIP荷載圖

2.4與肝癌發(fā)生、發(fā)展相關(guān)的血清特征代謝物組的篩選 各組研究對(duì)象相關(guān)特征峰信息見(jiàn)表1。

表1 各組研究對(duì)象相關(guān)特征峰信息

續(xù)表1 各組研究對(duì)象相關(guān)特征峰信息

注：δ1H表示代謝化合物氫的位移；s、d、t、m、q分別表示代謝產(chǎn)物的峰型為單重峰、雙重峰、三重峰、多重峰、四重峰；與健康對(duì)照組比較，*P<0.05；與肝炎DNA陰性組比較，#P<0.05；與肝癌組比較，△P<0.05

3 討 論

代謝異常是腫瘤發(fā)生的又一重要原因，肝臟是人體重要的物質(zhì)代謝器官，肝癌的代謝物研究備受關(guān)注。核磁共振技術(shù)在代謝組學(xué)研究中最為常用，其優(yōu)點(diǎn)在于不破壞樣本的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)、對(duì)化合物檢測(cè)無(wú)偏倚、實(shí)驗(yàn)方法靈活、預(yù)處理簡(jiǎn)單、可設(shè)計(jì)多種編輯手段、并可在接近生理?xiàng)l件下進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

目前，已有部分文獻(xiàn)報(bào)道，利用代謝組學(xué)技術(shù)尋找肝癌特征生物指標(biāo)物[9-10]。早在2003年ROONEY等[11]成功利用NMR技術(shù)對(duì)乳酸誘導(dǎo)下發(fā)生脂肪變的小鼠肝臟組織進(jìn)行了代謝組學(xué)檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)組小鼠葡萄糖、甜菜堿和三甲胺N-氧化物水平均存在顯著差異，提示該技術(shù)可行。隨后YIN等[12]應(yīng)用高效液相色譜-電噴霧質(zhì)譜(HPLC-MS)聯(lián)合技術(shù)分析慢性乙型肝炎、急性肝衰竭患者血清代謝組學(xué)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，4種溶血卵磷脂和1種膽汁酸可作為診斷肝衰竭的潛在血清標(biāo)記物。CAO等[13]采用UPLC-MS技術(shù)發(fā)現(xiàn)，LC與HCC患者排泄物中的原溶血卵磷脂、尿膽素、鵝去氧膽酸二聚體差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，提示膽酸合成與分泌及溶血卵磷脂的吸收障礙在LC和HCC發(fā)展過(guò)程中具有重要因素。我國(guó)學(xué)者WANG等[14]同樣應(yīng)用HPLC-MS技術(shù)發(fā)現(xiàn)了13種潛在生物標(biāo)記物顯著干擾肝癌的關(guān)鍵代謝途徑，如有機(jī)酸、脂肪酸、膽汁酸、磷脂類和腸道菌群等的代謝。TAN等[15]應(yīng)用HPLC-MS分析比較了肝癌和肝硬化患者血清代謝變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，二氫神經(jīng)鞘氨醇和植物鞘氨醇在HCC下降明顯，可能作為HCC的腫瘤標(biāo)志物，并表明代謝組學(xué)研究中許多脂類代謝產(chǎn)物在肝癌患者血清與健康者血清中存在較大差異。

為進(jìn)一步探索乙型肝炎、肝癌患者有顯著差異的代謝物標(biāo)志物，本研究基于1H NMR技術(shù)對(duì)健康者、乙型肝炎DNA陰性者、乙型肝炎DNA陽(yáng)性者和HCC患者血清代謝物進(jìn)行了分析。與對(duì)照組比較，乙型肝炎DNA陰性組患者血清中有12種代謝物質(zhì)，如乳酸、丙氨酸、磷酸膽堿等顯著降低；乙型肝炎DNA陽(yáng)性組患者血清中有15種代謝物質(zhì)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，其中5種物質(zhì)，如亮氨酸、?；撬岬人较陆?，9種代謝物質(zhì)，如醋酸、膽堿等水平上升。與乙型肝炎DNA陽(yáng)性患者比較，乙型肝炎DNA陰性患者血清中有14種代謝物質(zhì)具有顯著差異，其中4種代謝物，如谷氨酰胺、甲酸水平下降，10種代謝物，如亮氨酸、乳酸水平上升。乙型肝炎DNA陰性組、乙型肝炎DNA陽(yáng)性組與健康對(duì)照組之間均存在水平有差異的代謝物，提示在乙型肝炎期某些代謝物水平已出現(xiàn)明顯紊亂，也為尋找肝癌發(fā)生、發(fā)展相關(guān)特征代謝物提供了證據(jù)。此外，本研究還篩選出21種與HCC發(fā)生、發(fā)展相關(guān)的代謝物標(biāo)志物，其中僅有苯乙尿酸水平上升，其他代謝物，如異亮氨酸、膽堿、纈氨酸等均下降。

苯乙尿酸是嘌呤代謝產(chǎn)物，其水平增多，可能與肝臟病變時(shí)代謝障礙所致。飲酒是高尿酸血癥的相關(guān)危險(xiǎn)因素，也是肝臟損傷的直接危險(xiǎn)因素，但苯乙尿酸代謝增多與肝癌發(fā)生、發(fā)展的機(jī)制仍需進(jìn)一步研究探討。

4 結(jié) 論

本研究通過(guò)1H NMR有效篩查出乙型肝炎、肝癌患者之間21種具有顯著差異的血清代謝物，在無(wú)創(chuàng)診斷HCC方面具有廣闊應(yīng)用前景。但由于存在種族、地域等差異，該結(jié)果仍需進(jìn)一步的多中心實(shí)驗(yàn)證實(shí)。