陳郁，龔亮，李海波，羅勇軍

高原地區(qū)由于其特殊的地理環(huán)境，以及近年來的建設發(fā)展和交通設施的逐漸完善，吸引著越來越多的人群從平原進入高原從事相關活動，其中絕大部分為短期旅游者[1]。高原地區(qū)空氣稀薄、氧分壓低，是進入高原的平原人群發(fā)生急性高原反應最主要的原因，但是其導致?lián)p傷的具體機制仍未完全闡明[2-4]。氧化應激和自由基代謝異常是低氧引起損傷的重要因素，故適度應用抗氧化劑是防治低氧損傷的重要考慮方向[5]。在眾多的抗氧化劑中，氫具有極強的還原性，能夠選擇性地與氧自由基結合而減弱其作用，在抗氧化應激、對抗自由基代謝和抗炎方面發(fā)揮著重要作用，對機體重要器官具有顯著的保護效應[6]。為評估氫在急性缺氧過程中的抗氧化作用，本研究將大鼠暴露在模擬海拔5000m的高原環(huán)境中，構建大鼠急性缺氧模型，探討不同劑量氫氣菌群制劑對急性缺氧大鼠重要器官氧化應激指標和抗氧化指標的影響，為應用氫氣菌群及氫氣相關制品預防和治療急性高原病提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 10～12周齡健康雄性SD大鼠共40只，體重200～220g，購自陸軍軍醫(yī)大學實驗動物中心。動物飼養(yǎng)于陸軍軍醫(yī)大學高原軍事醫(yī)學系動物房，所有動物均自由攝食、飲水，控制室溫在20～24℃。本實驗經(jīng)陸軍軍醫(yī)大學動物倫理委員會批準。

1.2 藥物及主要試劑、儀器 氫氣菌群制劑購自日本D&D TRINITY公司(http://ddtrinitylab.shopselect.net/items/3183023)。丙二醛(malonaldehyde，MDA)、過氧化氫酶(catalase，CAT)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、谷胱甘肽(glutathione，GSH)檢測試劑盒均購自南京建成生物工程研究所。血漿腫瘤壞死因子α(tumour necrosis factor-α，TNF-α)檢測采用ELISA試劑盒完成(武漢博士德生物工程有限公司)。Multiskan GO全自動多功能酶標儀購自美國Thermo公司。動物模型制備采用高原環(huán)境模擬艙(DYC-2842T型低壓氧艙)，由貴航集團風雷機械廠建造。

1.3 動物模型制備 將40只SD大鼠隨機分為平原生理鹽水(normoxic saline，NS)組、高原生理鹽水(high-altitude saline，HS)組、高原低劑量(highaltitude low-dose，HL)組、高原中劑量(high-altitude medium-dose，HM)組、高原高劑量(high-altitude high-dose，HH)組，每組8只。低劑量組、中劑量組和高劑量組的給藥劑量分別為10、20、40mg/(kg·d)，于每天上午固定時間灌胃給藥，1次/d。高原組的動物在海拔4000m灌胃給藥、換水、食物及新鮮干凈墊料，在30min內完成，給藥完畢后動物上升至海拔5000m，連續(xù)3d，其中HS組每只大鼠灌胃2ml生理鹽水。NS組每只大鼠亦灌胃2ml生理鹽水，不進入低壓氧艙。

1.4 實驗動物處理 第3次給藥后1d，在模擬海拔4000m處，將所有高原組動物處死取材。采用14%烏拉坦腹腔注射麻醉大鼠，劑量以1ml/100g計。取材時剪開胸腔，用注射器心臟采血，注意防止大出血導致采血失敗。取血完畢后將血液轉移至EDTA鈉抗凝管中，3000r/min離心10min，留取血漿，分裝凍存，–80℃?zhèn)溆谩７謩e獲取肝、肺及心臟組織，轉移至凍存管中，于液氮中凍存，再轉移至–80℃?zhèn)溆?。NS組取材在高原組取材后完成，樣品處理同高原組。

1.5 實驗指標檢測 血漿在室溫解凍，采用ELISA法檢測血漿中的TNF-α含量，單位為pg/ml。采用比色法測定肝、肺、心肌組織中的MDA、CAT、SOD和GSH含量。將肝、肺、心肌組織4℃解凍后，每個標本剪取0.1g的組織，放入2ml的EP管中，再加入0.9ml的生理鹽水。采用預冷的眼科剪剪碎組織，勻漿機勻漿結束后置于冰上。待全部樣品勻漿完成后，以2500r/min的速度于4℃條件下離心10min，制備10%組織勻漿液置于4℃?zhèn)溆谩２捎肂CA法測定組織勻漿液蛋白含量。在預實驗中，對每個器官的每個檢測指標均測定了最佳檢測濃度，故在獲取10%的組織勻漿液后，采用生理鹽水稀釋至最佳濃度，分裝置于4℃?zhèn)溆谩?/p>

1.6 統(tǒng)計學處理 采用軟件SPSS 20.0進行統(tǒng)計分析。所有數(shù)據(jù)均以表示，多組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較時方差齊采用SNK-q檢驗，方差不齊采用Tamhane'T2分析。均為雙側檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 給藥后大鼠血漿TNF-α含量變化 在模擬海拔5000m的低氧環(huán)境暴露3d后，與NS組[(36.24±3.92)pg/ml]相比，高原各組的TNF-α含量[HS組為(39.89±5.38)pg/ml，HL組為(32.59±1.97)pg/ml，HM組為(39.89±5.38)pg/ml，HH組為(35.43±2.09)pg/ml]無明顯差異；與HS組相比，HL組的TNF-α含量明顯下降(P＜0.01)。

2.2 肝、肺、心肌組織各氧化應激指標的最佳測量濃度 由于不同組織的MDA、CAT、SOD及GSH含量不同，為保證最佳檢測效果，在正式檢測之前，先摸索了不同組織不同指標的最佳檢測濃度，結果見表1。在正式檢測前，將勻漿組織上清用生理鹽水稀釋至目標濃度，存于4℃?zhèn)溆谩?/p>

表1 急性缺氧大鼠各組織氧化應激指標的最佳檢測濃度(%)Tab.1 Optimal concentrations of MDA, SOD, CAT and GSH of different tissues in acute hypoxia rats (%)

2.3 給藥后大鼠肝組織MDA、CAT、SOD和GSH含量變化 與NS組相比，HS組及高原各藥物組大鼠肝組織MDA含量無明顯變化，與HS組相比，高原各藥物組大鼠肝組織DMA含量無明顯變化，提示氫氣菌群制劑在降低肝組織MDA含量方面無明顯效果。與NS組相比，HS組、HL組及HH組大鼠肝組織CAT含量均明顯下降(P＜0.01)，而與HS組相比，高原各藥物組大鼠肝組織CAT含量均無明顯變化，提示氫氣菌群制劑在提高肝組織CAT含量方面無明顯效果。NS組、HS組及高原各藥物組大鼠肝組織SOD含量比較均無明顯差異，提示氫氣菌群制劑對改善肝組織SOD無明顯效果。與NS組相比，HS組及高原各藥物組大鼠肝組織GSH含量明顯下降(P＜0.01)，與HS組相比，HL組和HH組大鼠肝組織GSH含量均明顯升高(P＜0.05)，HL組、HM組和HH組之間無明顯差異，提示低、中、高劑量的菌群制劑均可改善肝組織中GSH代謝，而高劑量的菌群制劑效果較好(表2)。

表2 急性缺氧大鼠各組給藥后肝組織氧化應激相關指標的變化(±s，n=8)Tab.2 Changes of indicators in liver tissue of acute hypoxia rats in different groups after administration (±s, n=8)

表2 急性缺氧大鼠各組給藥后肝組織氧化應激相關指標的變化(±s，n=8)Tab.2 Changes of indicators in liver tissue of acute hypoxia rats in different groups after administration (±s, n=8)

MDA. Malonaldehyde; CAT. Catalase; SOD. Superoxide dismutase; GSH. Glutathione; NS. Normoxic saline group; HS. High altitude saline group, HL. High altitude low-dose group, HM. High altitude medium-dose group; HH. High altitude high-dose group. (1)P＜0.01 compared with NS group; (2)P＜0.01, (3)P＜0.05 compared with HS group

GSH(μmol/g prot)NS 0.36±0.04 0.88±0.18 0.76±0.14 43.63±8.90 HS 0.44±0.13 0.62±0.10(1)0.69±0.10 22.89±3.06(1)HL 0.52±0.16 0.56±0.18(1)0.68±0.22 29.65±6.00(1)(3)HM 0.43±0.08 0.65±0.26 0.58±0.12 27.63±3.64(1)HH 0.46±0.08 0.55±0.11(1)0.63±0.07 31.09±5.06(1)(3)Group MDA(nmol/mg prot)CAT(U/ml)SOD(U/mg prot)

2.4 給藥后大鼠肺組織MDA、CAT、SOD和GSH含量變化 與NS組相比，HS組大鼠肺組織MDA含量明顯增加(P＜0.01)，與HS組相比，HL組及HM組大鼠肺組織MDA含量明顯下降(P＜0.05)，HL組則明顯低于HH組(P＜0.01)而明顯高于HM組(P＜0.01)，HM組明顯低于HH組(P＜0.01)，提示在肺組織中，低劑量和中劑量的菌群制劑均有較好的抑制脂質過氧化的效果。與NS組相比，HS組大鼠肺組織CAT含量無明顯變化，與HS組相比，HL、HM和HH組大鼠肺組織CAT含量明顯上升(P＜0.01)，HL、HM和HH組之間CAT含量無明顯差異，提示氫氣菌群制劑能夠改善大鼠肺組織的CAT含量。與NS組相比，HS組與高原各藥物組大鼠肺組織SOD含量均無明顯變化，與HS組相比，HM組大鼠肺組織SOD含量明顯增加(P＜0.01)，HM組明顯高于HL組和HH組(P＜0.01)，HH組與HL組比較無明顯差異，提示氫氣菌群制劑能夠提高缺氧大鼠肺組織SOD的含量，且中等劑量效果最佳。與NS組相比，HS組大鼠肺組織GSH含量明顯下降(P＜0.05)，而高原各藥物組無明顯變化，與HS組相比，HM組大鼠肺組織GSH含量明顯升高(P＜0.01)，且HM組明顯高于HL組及HH組(P＜0.01)，提示氫氣菌群制劑能夠改善肺組織GSH含量，且中等劑量效果最好(表3)。

表3 急性缺氧大鼠各組給藥后肺組織氧化應激相關指標的變化(±s，n=8)Tab.3 Changes of indicators in lung tissue of acute hypoxia rats in different groups after administration (±s, n=8)

表3 急性缺氧大鼠各組給藥后肺組織氧化應激相關指標的變化(±s，n=8)Tab.3 Changes of indicators in lung tissue of acute hypoxia rats in different groups after administration (±s, n=8)

MDA. Malonaldehyde; CAT. Catalase; SOD. Superoxide dismutase; GSH. Glutathione; NS. Plain saline group; HS. Plateau saline group, HL. Plateau low dose hydrogen group, HM. Medium dose hydrogen group; HH. High dose hydrogen group. (1)P＜0.01, (2)P＜0.05 compared with NS group; (3)P＜0.01, (4)P＜0.05 compared with HS group; (5)P＜0.01 compared with HL group; (6)P＜0.01 compared with HM group

GSH(μmol/g prot)NS 0.57±0.20 0.26±0.05 1.64±0.22 5.97±1.70 HS 1.64±0.13(1) 0.29±0.07 1.63±0.40 4.14±1.20(2)HL 1.28±0.29(1)(4) 0.55±0.15(3)2.07±0.53 4.99±1.38 HM 1.22±0.36(1)(4) 0.61±0.13(3)2.71±0.80(3)(5)7.17±2.11(3)(6)HH 1.61±0.25(1)(5)(6)0.59±0.05(3)1.89±0.35(6) 4.88±0.98(6)Group MDA(nmol/mg prot)CAT(U/ml)SOD(U/mg prot)

2.5 給藥后大鼠心肌組織MDA、CAT、SOD和GSH含量變化 與NS組相比，HS組與高原各藥物組大鼠心肌組織MDA含量均明顯增加(P＜0.01)，與HS組相比，HL組、HM組及HH組大鼠心肌組織MDA含量均明顯下降(P＜0.05或P＜0.01)，HL組、HM組及HH組之間比較無明顯差異，提示氫氣菌群制劑可改善缺氧大鼠心肌組織的MDA含量增加。與NS組相比，HS組及高原各藥物組大鼠心肌組織CAT含量無明顯變化，與HS組相比，HH組大鼠心肌組織CAT含量明顯下降(P＜0.05)，HL組和HM組均明顯高于HH組(P＜0.01)，HL組與HM組比較無明顯差異，提示氫氣菌群制劑在改善缺氧大鼠心組織的CAT含量方面無明顯效果，且高劑量組還可導致CAT含量進一步下降。與NS組相比，HS組、HL組及HH組大鼠心肌組織SOD含量無明顯變化，HM組大鼠心肌組織SOD含量明顯增加，與HS組相比，HL組及HM組大鼠心肌組織SOD含量明顯增加(P＜0.05或P＜0.01)，而HH組無明顯變化，HL、HM及HH組之間比較無明顯差異，提示氫氣菌群制劑能夠改善大鼠心組織SOD含量，且以中等劑量為最佳。與NS組相比，HS組大鼠心肌組織GSH含量明顯下降(P＜0.01)，而高原各藥物組無顯著改善，與HS組相比，HL組、HM組及HH組大鼠心肌組織GSH含量均明顯增加(P＜0.05或P＜0.01)，且HH組明顯高于HL組及HM組(P＜0.01)，HL組與HM組之間比較無明顯差異，表明氫氣菌群制劑能夠提高缺氧大鼠心肌組織的GSH含量，且高劑量組的效果較好，優(yōu)于低劑量組與中劑量組(表4)。

表4 急性缺氧大鼠各組給藥后心肌組織氧化應激相關指標變化(±s，n=8)Tab.4 Changes of indicators in heart tissue of acute hypoxia rats in different groups after administration (±s, n=8)

表4 急性缺氧大鼠各組給藥后心肌組織氧化應激相關指標變化(±s，n=8)Tab.4 Changes of indicators in heart tissue of acute hypoxia rats in different groups after administration (±s, n=8)

MDA. Malonaldehyde; CAT. Catalase; SOD. Superoxide dismutase; GSH. Glutathione; NS. Normoxic saline group; HS. High altitude saline group, HL. High altitude low-dose group, HM. High altitude medium-dose group; HH. High altitude high-dose group. (1)P＜0.01 compared with NS group; (2)P＜0.01, (3)P＜0.05 compared with HS group; (4)P＜0.05 compared with HL and HM group

GSH(μmol/g prot)NS 0.68±0.23 1.57±0.34 0.95±0.30 4.02±1.40 HS 1.94±0.71(1) 1.64±0.12 0.90±0.10 2.09±0.44(1)HL 1.52±0.28(1)(3) 1.72±0.26 1.14±0.19(3) 2.39±0.42(3)HM 1.33±0.36(1)(3) 1.72±0.21 1.36±0.22(1)(2)2.47±0.52(3)HH 1.25±0.43(1)(3) 1.42±0.13(3)0.97±0.16 3.38±0.91(2)(4)Group MDA(nmol/mg prot)CAT(U/ml)SOD(U/mg prot)

3 討 論

正常情況下，機體不斷生成自由基，同時也存在自由基的清除體系如抗氧化酶等，使自由基的產生與清除處于動態(tài)平衡中，以保證機體不受自由基的損傷[7]。在高原低氧環(huán)境中，自由基代謝紊亂，自由基生成明顯增多，過多的自由基可造成組織損傷[5]。肝臟是機體最重要的代謝器官，肺臟是最主要的氣體交換場所，而心臟是對氧代謝特別敏感的器官，因此，本研究驗選擇了肝臟、肺臟和心臟作為靶器官，觀察氫氣菌群制劑在大鼠急性缺氧后對機體氧化指標和抗氧化指標的影響。MDA是脂質過氧化的終產物之一，其含量高低可提示機體的自由基代謝狀態(tài)并能夠間接反映自由基對組織的損傷程度[8]。SOD、CAT及GSH是機體重要的抗氧化系統(tǒng)，在機體拮抗氧化應激損傷和清除自由基的過程中發(fā)揮著重要作用[9]。本研究選擇的是能夠在腸道中代謝產生氫氣的菌群，進入消化道之后可在腸道定居并增殖以增加體內氫氣的產量，促進機體對氫氣的吸收以拮抗自由基的生成。本研究發(fā)現(xiàn)，在模擬海拔5000m暴露3d，應用氫氣菌群制劑后，能夠降低缺氧大鼠血漿TNF-α含量，降低缺氧大鼠肺組織和心肌組織的MDA含量，增加缺氧大鼠肝、肺以及心肌組織的GSH含量，增加肺組織CAT含量與肺、心肌組織SOD含量。上述結果表明，氫氣菌群制劑能夠在一定程度上中和缺氧導致的氧代謝自由基增加，對心肌組織和肺組織都有一定程度的保護作用。此外，本研究還觀察到，在單純缺氧組中各組織的MDA、CAT、SOD和GSH指標反應并不一致，考慮一方面可能與動物實驗中個體對藥物的反應不同有關，另外也可能與各組織對氫氣代謝反應的不一致有關。給予氫氣菌群制劑后經(jīng)代謝產生氫氣，但是每只動物的產氫氣的量不一致，氫氣通過各種中間過程到達各組織的途徑不一致，到達的量也不一樣，從而使得HS組中MDA以及各抗氧化的指標反應并不一致。

目前針對抗缺氧的藥物研究較多，以各種植物提取物以及小分子化合物為主，如槲皮素[10]、黃芪甲苷[9]、苯乙醇苷[11]、天麻素[12]、醋甲唑胺[13]、四甲基哌啶衍生物[14]及單硝酸異山梨酯化合物等[15]?，F(xiàn)有研究多為觀察自由基及抗缺氧物質等氧化損傷/抗氧化指標在細胞水平[11]或者動物組織中的含量變化[9-10,12-15]以評估抗缺氧物質的效應，本研究選取的MDA、CAT、SOD及GSH等也是動物實驗較多采用的指標，而部分細胞實驗則采用細胞活力等指標。目前的抗氧化指標雖然多，但仍缺少敏感、特異的抗缺氧指標，這也是篩選抗缺氧藥物的重要方向之一?？谷毖跣且粋€整體效應，是在面對低氧環(huán)境時整個機體的活動能力，而不是僅僅停留在細胞或者組織層面。因此，針對藥物的抗缺氧效應，可考慮以動物的整體表現(xiàn)為評估指標，如在低氧環(huán)境中的認知能力和運動能力等行為學特征，并以此為基礎在組織、細胞及分子層面深入研究其機制。

氫氣是自然界中最小、結構最簡單的分子，無色無味，具有極強的還原性。此外，由于其分子量小和電中性特點，能夠穿透生物膜到達細胞質、線粒體、細胞核等部位，因此很有可能作為一種小分子生命信號傳遞物質，在機體內傳遞信息。人體內的氫氣有兩個來源：一是皮膚從外界吸收，但是通過此途徑獲得的氫氣量非常少，二是腸道菌群代謝產生的氫氣，這也是人體內氫氣最主要的來源。研究表明，氫氣能夠對氧自由基進行有針對性的清除，尤其是中和體內氧化性較強的活性氧(reactive oxygen species，ROS)如羥基等而發(fā)揮作用[6]。而且大量研究表明，氫氣相關制劑如富氫水等能夠抑制炎癥因子如TNF-α、IL-1β的生成，并降低自由基的含量，進而減輕缺血再灌注損傷[16]。此外，富氫水還可通過抗炎抗氧化作用，減輕炎癥性腸病損傷[17]，改善多發(fā)性硬化模型小鼠的癥狀和減輕脫髓鞘病變[18]。除了炎癥病變外，富氫水還可通過促進干擾素的表達來減低腫瘤的質量和體積[19]，改善因化療導致的肝功能損傷[20]。上述研究結果提示，氫氣及其相關制劑有望在多種疾病的治療中得到進一步應用，改善機體癥狀。

本研究使用的是氫氣菌群制劑，依賴于腸道菌群代謝產生氫氣，這種方式不穩(wěn)定，易受原有的腸道菌群和飲食的影響。在后期的進一步實驗中，可考慮直接應用富氫水腹腔注射處理動物模型，對急性高原病動物模型應有較好的效果。此外，雖然本研究使用的是急性動物模型，但是在高原紅細胞增多癥和高原肺動脈高壓等慢性缺氧模型中，也可針對性使用氫氣菌群或者富氫水制劑，以觀察其對低氧損傷的拮抗作用。目前，尚無高原現(xiàn)場條件下制備富氫水的報道，在高原條件下富氫水的保存也存在一定難度，因此使用氫氣菌群制劑以改善高原地區(qū)人群的腸道菌群，增加高原人群腸道氫氣的生成，也是未來可以考慮的方式。值得注意的是，由于高原低氧環(huán)境會對腸道菌群的組成和含量造成明顯的影響[21]，因此針對需要長期在高原停留的人群，建議考慮長期應用氫氣菌群制劑以獲得較好的效果。

綜上所述，本研究表明，使用氫氣菌群制劑可改善缺氧環(huán)境對心臟以及肺臟的損傷，通過拮抗自由基而對上述器官發(fā)揮保護作用。此外，氫氣菌群制劑的應用方式還可進一步優(yōu)化調整以發(fā)揮其最大效應。而氫氣在這其中發(fā)揮作用的機制如何，是否還有其他因子也參與了這一過程，我們將在后期實驗中進一步關注。