吳美霞，劉亞軍，陸士娟，孫定軍，吳淼，張偉，黃康，鐘江華

慢性充血性心力衰竭(congestive heart failure，CHF)主要為老年發(fā)病，病情復(fù)雜且兇險(xiǎn)，容易引發(fā)惡性室性心律失常(MVA)，隨之出現(xiàn)心源性猝死(SCD)[1]。目前有調(diào)查顯示，約75%的老年CHF患者猝死與MVA有關(guān)[2]。但迄今為止，CHF易發(fā)MVA的生理機(jī)制仍未明確，因而缺乏有效的預(yù)防及控制措施。近年來(lái)有研究發(fā)現(xiàn)MVA的發(fā)生可能與跨室壁復(fù)極離散(TDR)有關(guān)[3]。成人心臟在解剖上由心內(nèi)膜下心肌(Endo)、中層心肌(Mid)及心外膜下心肌(Epi)組成，其中Mid的復(fù)極化持續(xù)時(shí)間比另外兩層心肌明顯延長(zhǎng)，從而造成TDR。在某些病理?xiàng)l件下，這種心肌橫斷面上的復(fù)極差異還會(huì)進(jìn)一步擴(kuò)大[4]，容易誘發(fā)MVA，但其發(fā)生的蛋白分子機(jī)制并不清楚。

縫隙連接蛋白43(connexin 43，Cx43)廣泛參與左心室心肌細(xì)胞和傳導(dǎo)系統(tǒng)的各種工作，通過(guò)相鄰細(xì)胞間電、化學(xué)信號(hào)通路參與MVA的發(fā)生發(fā)展[3]。Chang等[5]在大鼠心肌梗死(MI)模型中發(fā)現(xiàn)Cx43表達(dá)明顯降低，且梗死邊緣區(qū)心肌細(xì)胞電傳導(dǎo)功能受損，說(shuō)明MVA與Cx43的異質(zhì)性有關(guān)。本研究通過(guò)縮窄腹主動(dòng)脈建立CHF兔模型，觀察其左心室三層心肌間Cx43表達(dá)的差異，旨在探討CHF發(fā)生MVA的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物分組及模型制作 24只雄性健康新西蘭大白兔，體重(2.5±0.5)kg，由杭州余杭科聯(lián)兔業(yè)提供[合格證號(hào)：SCXK(浙)2013-0055]。將24只兔隨機(jī)分為CHF組(n=12)和假手術(shù)組(Sham組，n=12)。CHF組兔稱重后經(jīng)耳緣靜脈用氨基甲酸乙酯(1.0g/kg)麻醉，腹部常規(guī)消毒，正中線切開(kāi)，沿左腎動(dòng)脈上方游離出腹主動(dòng)脈并鈍性分離，用5F或6F導(dǎo)管平行于腹主動(dòng)脈，4號(hào)線結(jié)扎，取出導(dǎo)管，使腹主動(dòng)脈橫截面積狹窄約為70%[6]。Sham組開(kāi)腹后不結(jié)扎腹主動(dòng)脈，其余步驟同CHF組。兩組兔均在縫合切口后青霉素連續(xù)肌內(nèi)注射3d以預(yù)防感染，術(shù)后連續(xù)喂養(yǎng)8周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院附屬?？卺t(yī)院生物醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 溶液制備 ①10%過(guò)硫酸銨(AP)：超純水1.0ml和過(guò)硫酸胺0.1g溶解后，于4℃保存1周；②電泳緩沖液：Tris[重均分子量(MW)121.14]3.04g、甘氨酸(MW 75.07)14.42g、十二烷基硫酸鈉(SDS)0.5g加蒸餾水至1000ml；③轉(zhuǎn)移緩沖液：甘氨酸(MW 75.07)14.42g、Tris(MW 121.14)3.04g、甲醇200ml加蒸餾水至1000ml；④TBST緩沖液：Tris(MW 121.14)1.22g、NaCl 2.92g、Tween 20 0.5ml加蒸餾水至1000ml；⑤封閉液：脫脂奶粉5g加TBST緩沖液100ml。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 在體心臟超聲檢查 兔喂養(yǎng)8周后稱重，并通過(guò)耳靜脈用1.0g/kg氨基甲酸乙酯靜脈麻醉，取仰臥位，固定兔的四肢，采用超聲掃描儀(ATLHDI-5000型)在胸骨旁左室長(zhǎng)軸掃描，通過(guò)心臟彩超檢查兔的左心室舒張末期內(nèi)徑(LVEDD)，左心室收縮末期內(nèi)徑(LVESD)、室間隔厚度(IVS)、左心室后壁厚度(LVPW)和左室射血分?jǐn)?shù)(LVEF)。

1.3.2 在體血流動(dòng)力學(xué)檢測(cè) 分離并切開(kāi)右頸總動(dòng)脈，然后插入含有1%肝素的直徑約1mm心導(dǎo)管，緩慢推進(jìn)的同時(shí)接BL-420S生物機(jī)能分析系統(tǒng)(成都泰盟軟件有限公司)，穩(wěn)定5min后，測(cè)量其外周動(dòng)脈收縮壓(SBP)、舒張壓(DBP)、平均動(dòng)脈壓(MAP)、左心室最大上升速度和最大下降速度(±dp/dtmax)等參數(shù)。

1.3.3 左心室三層心肌的提取 兔稱重后處死，剪取心臟，用濾紙吸干生理鹽水洗凈的心臟，分別稱量整個(gè)心臟重量(HW)和左心室重量(LVW)，計(jì)算心臟重量比(HW/BW)和左心室重量比(LVW/BW)。按照相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道[7]剪取兔左心室游離壁，并用刀片分離三層心肌組織，其中Epi為心外膜面至其下2mm，Mid為心外膜面下2～7mm，Endo為心內(nèi)膜面至其下2mm。將上述提取出的組織分別用Eppendorf管凍存于-80℃冰箱中備用。

1.3.4 左心室心肌HE染色及免疫組化染色 取左心室心肌組織，用4%聚合甲醛溶液沖洗，在石蠟包埋之前進(jìn)行固定、脫水然后切片，厚度約為4μm，常規(guī)行HE染色。石蠟包埋的左心室不同心肌層切片用于Cx43表達(dá)的免疫組化染色檢測(cè)，脫蠟、水合和抗原修復(fù)后，在室溫下用1%BSA封閉組織45min，切片加入一抗孵育過(guò)夜，并用生物素化標(biāo)記二抗1h，然后用ABC過(guò)氧化物酶和DAB(二氨基聯(lián)苯胺)孵育，蘇木素復(fù)染，并在光鏡下觀察，Cx43陽(yáng)性為深棕黃色，陰性不顯色[8]。對(duì)染色結(jié)果進(jìn)行半定量分析，采用Image-Pro Plus 6.0圖像分析系統(tǒng)，每張切片隨機(jī)選取5個(gè)高倍視野(×200)測(cè)定免疫組化圖像中的平均光密度值。

1.3.5 Western blotting檢測(cè)左心室心肌Cx43蛋白表達(dá) 將兩組兔心肌組織溶解在裂解緩沖液內(nèi)，提取蛋白后用BCA試劑盒檢測(cè)蛋白質(zhì)濃度。在SDS丙烯酰胺凝膠上負(fù)載30μg蛋白，轉(zhuǎn)移至PVDF膜。使用發(fā)光體化學(xué)發(fā)光法針對(duì)Cx43、GAPDH和二次抗體(辣根過(guò)氧化物酶)的特異性抗體進(jìn)行檢測(cè)。將目標(biāo)蛋白/參考蛋白的半定量值作為Cx43蛋白的表達(dá)水平，用Cx43-pro代表左心室三層心肌的Cx43蛋白的含量；左心室壁心肌間最大Cx43-pro與最小Cx43-pro的差值用ΔCx43-pro表示，反映跨室壁Cx43蛋白表達(dá)的差異。

1.3.6 RT-qPCR檢測(cè)左心室Cx43 mRNA的表達(dá)用Trizol試劑提取心肌總RNA，并將其反轉(zhuǎn)錄為cDNA，隨后將100ng cDNA作為模板，加入1μl正反引物，行RT-qPCR反應(yīng)，每個(gè)樣品最終體積為20μl。RT-qPCR反應(yīng)條件為：95℃變性1min；60℃擴(kuò)增30s，95℃變性10s，隨后循環(huán)40次。熔解曲線從70℃增加到95℃，每5s增加0.5℃。qPCR擴(kuò)增過(guò)程中收集熒光，反應(yīng)結(jié)束后，分析、計(jì)算qPCR過(guò)程各檢測(cè)樣本熒光信號(hào)能被檢測(cè)到的循環(huán)閾值(Ct值)，并計(jì)算樣本的Cx43 mRNA表達(dá)差異倍數(shù)(Cq值)用于反映Cx43 mRNA的相對(duì)表達(dá)水平[9]。左心室壁心肌最大Cx43-Cq與最小Cx43-Cq的差值用ΔCx43-Cq表示，反映跨室壁Cx43 mRNA表達(dá)的差異。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。所有數(shù)據(jù)以表示，多組間比較采用單因素方差分析(ANOVA)，進(jìn)一步兩兩比較方差齊時(shí)采用SNK-q檢驗(yàn)，方差不齊時(shí)采用Tamhane'sT2檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 一般資料 實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)CHF組兔存活9只，死亡3只，Sham組全部存活。在體血流動(dòng)力學(xué)參數(shù)顯示，與Sham組比較，CHF組SBP、DBP、MAP及±dp/dtmax均明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01，表1)。與Sham組比較，CHF組HW/BW及LVW/HW明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05，表1)。心臟病理切片檢查結(jié)果顯示，CHF組心肌細(xì)胞體積增大、直徑增寬，細(xì)胞排列不規(guī)則、染色不均勻，間質(zhì)纖維化明顯，而Sham組心肌細(xì)胞體積、直徑正常，細(xì)胞排列規(guī)則，間質(zhì)無(wú)明顯纖維化，組織學(xué)表現(xiàn)正常(圖1)。

表1 兩組兔一般資料比較(±s)Tab.1 Basic data of the two groups of rabbits (±s)

表1 兩組兔一般資料比較(±s)Tab.1 Basic data of the two groups of rabbits (±s)

(1)P＜0.05, (2)P＜0.01 compared with sham group

Item Sham group (n=12) CHF group (n=9)HW/BW 0.20±0.01 0.25±0.03(1)LVW/HW 0.15±0.01 0.18±0.02(1)SBP (mmHg) 151.14±21.75 134.16±5.78(2)DBP (mmHg) 110.24±18.56 93.40±3.64(2)MAP (mmHg) 74.32±7.06 58.89±2.40(2)+dp/dtmax (mmHg/ms) 3.56±0.40 3.40±0.71(1)–dp/dtmax (mmHg/ms) –2.91±0.07 –2.88±0.47(1)

圖1 兩組兔左心室心肌病理切片觀察(HE染色)Fig.1 Pathological observation of left ventricular myocardium in the two groups of rabbits (HE staining)

2.2 超聲心動(dòng)圖檢測(cè)結(jié)果 與Sham組比較，CHF組LVEF降低，LVEDD、LVESD明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；而IVS、LVPW比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05，表2)。

表2 兩組兔超聲心動(dòng)圖檢測(cè)結(jié)果(±s)Tab.2 Results of echocardiography in the two groups of rabbits (±s)

表2 兩組兔超聲心動(dòng)圖檢測(cè)結(jié)果(±s)Tab.2 Results of echocardiography in the two groups of rabbits (±s)

(1)P＜0.05 compared with sham group

Item Sham group (n=12) CHF group (n=9)LEVF(%) 79.23±0.08 49.67±0.15(1)LVEDD(mm) 9.54±1.75 14.32±1.98(1)LVESD(mm) 6.46±0.67 9.12±1.66(1)IVS(mm) 3.35±0.87 3.12±0.22 LVPW(mm) 3.54±0.57 3.65±0.30

2.3 左心室三層心肌Cx43蛋白的表達(dá)的Western blotting檢測(cè)結(jié)果 CHF組Epi、Mid及Endo的Cx43蛋白表達(dá)水平(分別為43.76±2.43、32.49±2.27及44.28±4.75)均明顯低于Sham組(分別為56.23±2.45、50.43±4.56、58.65±3.21)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。兩組組內(nèi)比較，Endo的Cx43蛋白表達(dá)水平明顯高于Mid、Epi，而Epi的Cx43蛋白表達(dá)水平明顯高于Mid，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。CHF組的ΔCx43-pro(15.37±2.08)明顯高于Sham組(11.19±1.48，P＜0.05，圖2)。

圖2 兩組兔左心室三層心肌Cx43蛋白的表達(dá)(Western blotting)Fig.2 Expression of Cx43 protein in three layers of left ventricular myocardium in the two groups of rabbits (Western blotting)

2.4 左心室三層心肌間Cx43蛋白表達(dá)的免疫組化檢測(cè)結(jié)果 CHF組Endo、Mid及Epi的Cx43蛋白表達(dá)水平(分別為2.69±0.31、2.03±0.29、2.54±0.33)明顯低于Sham組(分別為3.72±0.12、3.59±0.13、3.69±0.17)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。CHF組各層心肌深棕黃色顆粒較Sham組明顯減少，且三層心肌中以Mid減少最為顯著(圖3)。

圖3 兩組兔左心室三層心肌Cx43蛋白的表達(dá)(免疫組化染色)Fig.3 Expressions of Cx43 protein in three layers of left ventricular myocardium in the two groups of rabbits (Immunohistochemical staining)

2.5 RT-PCR檢測(cè)左心室三層心肌間Cx43 mRNA的表達(dá) CHF組Epi、Mid及Endo的Cx43 mRNA表達(dá)(Cq值分別為21.07±1.02、17.54±1.08及20.62±1.21)明顯低于Sham組(Cq值分別為23.45±0.98、22.48±1.08、24.87±1.45)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。兩組組內(nèi)比較，Endo的Cx43 mRNA明顯高于Mid、Epi，Epi的Cx43 mRNA明顯高于Mid，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。CHF組的ΔCx43-Cq(4.26±0.27)較Sham組(2.22±0.48)明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05，圖4)。

圖4 RT-PCR檢測(cè)兩組兔左心室三層心肌Cx43 mRNA表達(dá)Fig.4 Expressions of Cx43 mRNA in three layers of left ventricular myocardium in the two groups of rabbits (RT-PCR)

3 討 論

CHF是因心臟結(jié)構(gòu)改變、功能和代謝紊亂引起心臟擴(kuò)大、心室充盈受損及心臟射血能力下降的臨床綜合征[10-11]，是各種類型心臟疾病發(fā)展的最后階段。本研究通過(guò)腹主動(dòng)脈縮窄術(shù)建立兔CHF模型，CHF組兔死亡3只，模型成活率75%。術(shù)后8周CHF組的LEVF＜50%，且LVEDD、LVESD增高，提示兔造模8周后心臟收縮功能及舒張功能均明顯受損。此外，通過(guò)頸動(dòng)脈插管也證實(shí)，CHF組SBP、DBP及左心室±dp/dtmax明顯降低，表明CHF兔心臟泵功能明顯降低，心臟逐漸喪失代償能力。病理結(jié)果顯示，CHF組心肌細(xì)胞體積變大，直徑加寬，細(xì)胞排列混亂、染色不一，間質(zhì)有明顯的纖維化現(xiàn)象，與CHF的病理表現(xiàn)相同，證明本研究成功建立了可靠的CHF動(dòng)物模型。

MVA是CHF的一種常見(jiàn)并發(fā)癥，其死亡發(fā)生率高達(dá)50%～60%，更是CHF患者突發(fā)SCD的常見(jiàn)因素[12]。Cx43主要負(fù)責(zé)心肌細(xì)胞間電位的快速傳送，在電流傳導(dǎo)中具有重要作用[13]。研究表明，Cx43蛋白主要在心肌細(xì)胞中豐富表達(dá)，作為心室肌電流傳導(dǎo)的介質(zhì)并維持搏動(dòng)節(jié)律，是MVA發(fā)生的潛在基礎(chǔ)[14]。此外，有研究發(fā)現(xiàn)，右心室發(fā)育不良導(dǎo)致心律失常的患者存在Cx43蛋白的減少及分布異常，且可發(fā)生持續(xù)性心動(dòng)過(guò)速[15]。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，在心肌肥厚小鼠中Cx43分布的空間異質(zhì)性增加，出現(xiàn)了Cx43的去磷酸化，Cx43的去磷酸化可導(dǎo)致耦聯(lián)受損，引起傳導(dǎo)阻滯，從而增加了MVA的易患性，心電圖表現(xiàn)為QRS波延長(zhǎng)[16]。本研究結(jié)果顯示，CHF組左心室三層心肌的Cx43蛋白表達(dá)均明顯低于Sham組，這可能是CHF易發(fā)MVA的重要原因之一。

近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外還有研究認(rèn)為跨室壁電生理差異性是心室壁固有的心電現(xiàn)象[17]。而Mid具有特殊的電生理特性，這種特殊性在于：在各種離子交換產(chǎn)生的作用下，Mid的動(dòng)作電位持續(xù)時(shí)間較Endo及Epi延長(zhǎng)，這種差異使得心臟在不同的層面上出現(xiàn)復(fù)極異常，也就是TDR。本研究的Western blotting及RT-PCR檢測(cè)結(jié)果均表明，Sham組兔的Cx43在三層心肌橫斷面上存在表達(dá)差異，Mid的Cx43蛋白及mRNA表達(dá)均明顯少于Epi及Endo，由此可見(jiàn)，左心室三層心肌間的Cx43表達(dá)差異可能是心肌不同層面電生理異質(zhì)性的蛋白基礎(chǔ)。

此外，左心室壁各層心肌細(xì)胞不僅復(fù)極時(shí)程不一致，對(duì)其他疾病如心肌梗死和CHF產(chǎn)生的復(fù)極作用也不盡相同，這些差異性會(huì)增加心肌細(xì)胞有效不應(yīng)期的離散，使TDR增大，進(jìn)而更加容易引起MVA[17]，但是各層心肌復(fù)極化不一致的蛋白機(jī)制尚不明確。既往研究發(fā)現(xiàn)，小鼠心肌梗死模型中Cx43含量降低，MVA的發(fā)生率明顯增加，而增加Cx43表達(dá)后，發(fā)生MVA的敏感性減弱[18]。Wu等[19]研究發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組比較，缺血組心肌細(xì)胞活性降低，Cx43含量減少且分布出現(xiàn)異常，MVA發(fā)生的評(píng)分率也增加，而加入增加心肌細(xì)胞Cx43表達(dá)的藥物后，其發(fā)生MVA的機(jī)會(huì)明顯減少。以上結(jié)果均表明，器質(zhì)性心臟病的心肌Cx43表達(dá)水平降低在心律失常的發(fā)生中起到了一定的作用。本研究結(jié)果還發(fā)現(xiàn)，CHF三層心肌Cx43蛋白表達(dá)水平下降的同時(shí)，ΔCx43-pro和ΔCx43-Cq明顯增大，Cx43在心肌各層面上的表達(dá)差異性進(jìn)一步擴(kuò)大，這可能使CHF的TDR增大，從而更易發(fā)生SCD。導(dǎo)致Cx43在各層心肌表達(dá)差異性擴(kuò)大的潛在因素有很多，可能與CHF心肌細(xì)胞之間的Cx43異常表達(dá)造成神經(jīng)體液調(diào)節(jié)失衡、細(xì)胞間的互相制約減弱及心電傳導(dǎo)推遲有關(guān)[20]。有研究發(fā)現(xiàn)，CHF患者血漿中血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)含量升高，而接受血管緊張素受體阻滯劑的患者其血漿中拮抗AngⅡ的物質(zhì)增多[21]。此外AngⅡ可能通過(guò)促進(jìn)心臟成纖維細(xì)胞(CFs)增殖和轉(zhuǎn)化而導(dǎo)致心肌纖維化，降低Cx43的滲透性，從而損害心臟細(xì)胞之間化學(xué)信息的傳遞，造成了心臟電生理障礙[22-23]。

總之，Cx43異質(zhì)性的擴(kuò)大可能會(huì)擾亂左心室心電活動(dòng)的平衡，繼而使心臟發(fā)生MVA的機(jī)會(huì)明顯增高，而具有減輕左心室各層心肌Cx43表達(dá)異常作用的藥物，將能夠減少Cx43三層心肌間復(fù)極的不一致，提高心室顫動(dòng)閾值，減少M(fèi)VA的發(fā)生。本研究的觀察時(shí)間跨度相對(duì)較小，而心肌重塑進(jìn)而形成CHF是一個(gè)長(zhǎng)期的漸進(jìn)性病理過(guò)程，因此，今后的研究可以選擇不同的時(shí)間長(zhǎng)度來(lái)觀察Cx43表達(dá)異質(zhì)性的變化，并進(jìn)一步探討這種異質(zhì)性所引起的心電離子通道改變的機(jī)制。