施善芬，黎良達(dá)，潘翠萍，單愛琴，何永平

系統(tǒng)性紅斑狼瘡(Systemic lupus erythematosus，SLE)是一種常見的慢性自身免疫性疾病[1]，SLE患者免疫細(xì)胞自噬功能出現(xiàn)異常，導(dǎo)致患者自身抗體對(duì)自身抗原產(chǎn)生高度特異性反應(yīng)[2-3]，從而導(dǎo)致全身多器官臟器受累，嚴(yán)重者出現(xiàn)器官衰竭而死亡。SLE的確切病因尚未完全闡明，但相關(guān)研究指出，SLE具有明顯家族聚集性[4]，說明SLE發(fā)病與基因變異及異常表達(dá)有關(guān)聯(lián)。miRNA在轉(zhuǎn)錄后水平對(duì)靶基因進(jìn)行表達(dá)調(diào)控[5-6]，有研究[7]指出miRNA-451a通過靶向IFN調(diào)節(jié)因子8而促進(jìn)SLE發(fā)生。miRNA-199a-3p廣泛參與多種腫瘤細(xì)胞的增殖和凋亡等過程[8]，其能夠調(diào)節(jié)mTOR等多條信號(hào)通路[9]，因此miRNA-199a-3p可能成為SLE發(fā)病的關(guān)鍵點(diǎn)。本研究探究miRNA-199a-3p在SLE外周血單個(gè)核細(xì)胞的表達(dá)水平以及與疾病進(jìn)展的關(guān)系，同時(shí)探究miRNA-199a-3p在SLE發(fā)病機(jī)制中的作用。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2015年6月至2018年1月在本院診治的50例SLE患者，其中30例處于活動(dòng)期的SLE患者作為活動(dòng)期組(ASLE)，20例處于緩解期的SLE患者作為緩解期組(RSLE)，同時(shí)選取25名健康志愿者作為對(duì)照組(Control)；所有入選患者均符合美國(guó)風(fēng)濕病學(xué)會(huì)制定的系統(tǒng)性紅斑狼瘡診斷標(biāo)準(zhǔn)和本研究的標(biāo)準(zhǔn)要求[10]。活動(dòng)期組患者男3例、女27例；年齡20～65歲，平均(42.4±10.3)歲；病程2～11年、平均(5.5±2.1)年。緩解期組患者男2例、女18例；年齡20～65歲，平均(40.9±11.2)歲；病程2～11年、平均(5.3±2.2)年，對(duì)照組入選者男3例、女22；年齡22～63歲，平均(41.5±9.7)歲。3組入選者年齡、性別等資料比較沒有顯著性差異(P>0.05)。

1.2 方法

1.2.1 入選和排除標(biāo)準(zhǔn)：入選標(biāo)準(zhǔn)：(1)所有入選SLE患者經(jīng)檢測(cè)明確診斷為SLE；(2)入選者均對(duì)本研究?jī)?nèi)容完全了解；(3)本研究?jī)?nèi)容得到本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)；(4)所有入選者均在知情同意書中簽字；(5)所有入選者資料均齊全。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)排除存在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、心腦血管疾病、肝腎功能衰竭、糖尿病、精神疾病等患者；(2)排除處于哺乳期或妊娠的女性患者；(3)排除近期服用對(duì)本研究存在影響的藥物患者。

1.2.2 實(shí)時(shí)定量PCR:分別抽取清晨空腹?fàn)顟B(tài)下3組入選者靜脈血5 ml,并與PBS緩沖液等比例混勻，然后加入5 ml細(xì)胞分離液后，離心收集第二層的單核細(xì)胞，再加入細(xì)胞洗劑并混勻后，離心收集沉淀的外周血單個(gè)核細(xì)胞。運(yùn)用實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)3組入選者外周血單個(gè)核細(xì)胞miRNA-199a-3p的相對(duì)表達(dá)量。利用miRNA分離試劑盒從單核細(xì)胞中進(jìn)行總miRNA提取，利用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄制備cDNA。反應(yīng)條件為：42 ℃反應(yīng)60 min和 70 ℃反應(yīng)10 min。miRNA-199a-3p相對(duì)表達(dá)量檢測(cè)通過實(shí)時(shí)定量PCR(以cDNA為模板)進(jìn)行，并用U6做為內(nèi)參照。反應(yīng)條件：(1)95 ℃條件下預(yù)變性40 sec；(2)95 ℃條件下變性5 sec；(3)60 ℃條件下反應(yīng)30 sec，每個(gè)設(shè)置3個(gè)平行，共循環(huán)40次。結(jié)束后計(jì)算3組樣品中miRNA-199a-3p相對(duì)表達(dá)量。miRNA-199a-3p 上游引物：5′-ACACCAGCTGGGTACAGTAGTCTGCACA-3′, 下游引物：5′-GTGTCGTGGAGTCGGCAATTC-3′；U6上游引物：5′-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3′,下游引物：5′-CGCTTCACGAATTTGCGTGTC AT-3′。

1.2.3 熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)：根據(jù)TargetScan靶點(diǎn)預(yù)測(cè)軟件預(yù)測(cè)miRNA-199a-3p的結(jié)合位點(diǎn)。人工合成 mTOR 3′UTR基因片段，根據(jù)野生型(Wild type, WT)序列對(duì)種子序列互補(bǔ)序列的突變位點(diǎn)進(jìn)行設(shè)計(jì)并引入到pMIR-reporter 中，pMIR-reporter質(zhì)粒同時(shí)包含Hind Ⅲ和Spe Ⅰ兩個(gè)內(nèi)切酶位點(diǎn)。經(jīng)限制性內(nèi)切酶和T4 DNA 連接酶處理后的目的片段插入到熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒pMIR-REPORT中。經(jīng)測(cè)序檢測(cè)后將序列正確的WT熒光素酶報(bào)告質(zhì)?；蛘咄蛔冃?mutant type, MUT)熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒與β-半乳糖苷酶表達(dá)質(zhì)粒以及miRNA-199a-3p mimics (miRNA-199a-3p mimics Sense:5′-ACAG UAGUCUGCACAUUGGUUA-3′；Antisense: 5′-ACCA AUGUGCAGACUACUG UUU-3′)或陰性對(duì)照共轉(zhuǎn)染至HEK-293T 細(xì)胞中。收集轉(zhuǎn)染 2 d后的HEK-293T細(xì)胞，裂解處理后利用β-半乳糖苷酶和熒光素酶檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)兩種酶活性，對(duì)相對(duì)熒光素酶活力進(jìn)行計(jì)算。

1.2.4 RNA轉(zhuǎn)染:通過Lipofectamine 2000將miRNA- 199a-3p mimics序列(miRNA-199a-3p mimics Sense:5′-ACAGUA-GUCUGCACAUUGGUU A-3′；Antisense: 5′-ACCAA-UGUGCAGACUACUG UUU-3′)轉(zhuǎn)染至外周血單個(gè)核細(xì)胞，即mimics組，另將僅Lipofectamine 2000處理的外周血單個(gè)核細(xì)胞作為陰性對(duì)照組，未做任何處理的外周血單個(gè)核細(xì)胞作為空白對(duì)照組。轉(zhuǎn)染1～2 d后，收集細(xì)胞進(jìn)行相關(guān)蛋白檢測(cè)。

1.2.5 Western blot 檢測(cè)：收集3組外周血單個(gè)核細(xì)胞，在4 ℃條件下，經(jīng)過RIPA蛋白裂解液裂解 30 min后，收集總蛋白，經(jīng)過考馬斯亮藍(lán)法對(duì)總蛋白進(jìn)行定量后。利用分離膠(8%)以及濃縮膠(5%)對(duì)30 μg蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳。轉(zhuǎn)模和蛋白封閉后，在4℃下孵育鼠單克隆一抗(Abcam)過夜，洗膜處理后進(jìn)行羊抗鼠二抗(Abcam)孵育，然后進(jìn)行顯影和成像，利用Image J軟件進(jìn)行蛋白分析。

1.2.6 凋亡檢測(cè)：收集轉(zhuǎn)染mimics的單個(gè)核細(xì)胞、陰性對(duì)照組細(xì)胞和空白對(duì)照組細(xì)胞，經(jīng)PBS清洗后加入結(jié)合緩沖液100 μl以及Annexin-V 2 μl，避光室溫下孵育30 min后，加入碘化丙啶(PI)2 μl，進(jìn)一步避光室溫下孵育2 min，注入結(jié)合緩沖液400 μl，收集細(xì)胞并利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)凋亡率。

1.2.7 觀察指標(biāo):對(duì)入選的SLE患者進(jìn)行SLE疾病活動(dòng)度指數(shù)(systemic lupus erythematosus disease activity index,SLEDAI)評(píng)分，SLEDAI≥5的患者處于活動(dòng)期，SLEDAI<5的患者處于緩解期。

活動(dòng)期患者：因SLE疾病活動(dòng)而門診診治或住院7 d內(nèi)的患者；緩解期患者：相距第一個(gè)觀察時(shí)間點(diǎn)后第12個(gè)月，處于疾病緩解期的患者。統(tǒng)計(jì)入選患者臟器受累(漿膜炎、血尿、皮疹、白細(xì)胞降低、血管炎、腎炎、脫發(fā)和光過敏)情況，并分析有與無以上臟器受累患者miRNA-199a-3p表達(dá)水平。SLE皮膚血管炎相關(guān)診斷包括皮膚紅斑(面部及其他部位)，潰瘍，雷諾現(xiàn)象，網(wǎng)狀青斑，結(jié)節(jié)紅斑，皮膚紫癜；SLE腎臟病變指標(biāo)包括血尿(尿相差提示為腎小球源性)、蛋白尿、管型尿。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 3組入選者外周血單個(gè)核細(xì)胞中miRNA-199a-3p表達(dá)

圖1 健康志愿者、緩解期和活動(dòng)期SLE患者外周血單個(gè)核細(xì)胞miRNA-199a-3p擴(kuò)增曲線Fig 1 Amplification curve of miRNA-199a-3p in peripheral blood mononuclear cells of healthy volunteers, remission and acute SLE patients

qRT-PCR各組基因擴(kuò)增圖形均呈S形(圖1)，擴(kuò)增正常。健康志愿者外周血單個(gè)核細(xì)胞miRNA-199a-3p相對(duì)表達(dá)量為2.38±0.24，顯著高于緩解期SLE患者(1.25±0.19)(P<0.05)；與緩解期相比，活動(dòng)期SLE患者外周血單個(gè)核細(xì)胞miRNA-199a-3p相對(duì)表達(dá)量(0.34±0.07)顯著降低(P<0.05)；且活動(dòng)期SLE患者外周血單個(gè)核細(xì)胞的miRNA-199a-3p相對(duì)表達(dá)量顯著低于調(diào)節(jié)性B細(xì)胞(Bregs)和CD4+T淋巴細(xì)胞(CD4+T)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(圖2)。

2.2 miRNA-199a-3p表達(dá)與 SLE 疾病活動(dòng)度的關(guān)系

Pearson相關(guān)分析表明，miRNA-199a-3p相對(duì)表達(dá)水平與 SLEDAI評(píng)分間呈負(fù)相關(guān)性(R=-0.704，P<0.05)(圖3)。

2.3 SLE患者外周血單個(gè)核細(xì)胞miRNA-199a-3p表達(dá)與臟器受累的相關(guān)性

漿膜炎、血尿、血管炎、脫發(fā)和光過敏患者外周血單個(gè)核細(xì)胞miRNA-199a-3p表達(dá)水平與無以上臨床表現(xiàn)患者表達(dá)相近(P>0.05)；而皮疹、白細(xì)胞降低和腎炎患者miRNA-199a-3p表達(dá)水平顯著高于無以上臨床表現(xiàn)患者(P<0.05)(表1)。

圖 2 外周血單個(gè)核細(xì)胞miRNA-199a-3p的相對(duì)表達(dá)量Fig 2 Relative expression level of miRNA-199a-3p in peripheral blood mononuclear cells

圖 3 miRNA-199a-3p相對(duì)表達(dá)量與SLEDAI評(píng)分間的相關(guān)性Fig 3 Correlation of miRNA-199a-3p relative expression level and SLEDAI score

2.4 miRNA-199a-3p對(duì)單個(gè)核細(xì)胞凋亡的影響

結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染 miRNA-199a-3p mimics后，單個(gè)核細(xì)胞凋亡率顯著高于陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組，差異存在顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(圖4)。

2.5 miRNA-199a-3p的結(jié)合位點(diǎn)

Targetscan7.1生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)mTOR mRNA的 3′UTR存在miRNA-199a-3p結(jié)合位點(diǎn)，即mTORmRNA是 miRNA-199a-3p的靶點(diǎn)(圖5A)。熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證靶點(diǎn)結(jié)果顯示， 與miRNA 陰性對(duì)照組(miRNA NC組)相比，miRNA-199a-3p mimics可顯著抑制mTOR野生型 3′UTR的熒光素酶活性，而對(duì)突變型的 3′UTR熒光素酶活性未見顯著的抑制作用(圖5B)。

表1 SLE患者臟器受累與miRNA-199a-3p水平的相關(guān)性Table 1 Correlation between organ involvement and miRNA-199a-3p level in SLE patients

2.6 PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)

轉(zhuǎn)染miRNA-199a-3p mimics并檢測(cè)相關(guān)蛋白發(fā)現(xiàn)：外周血單個(gè)核細(xì)胞轉(zhuǎn)染miRNA-199a-3p mimics后，mTOR、PI3K、pAKt和Bcl-2水平顯著低于陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組(P<0.05)，而bax與caspase-3表達(dá)水平明顯高于陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組(P<0.05)(圖6A,B)。

3 討論

SLE作為一種慢性自身免疫性疾病常出現(xiàn)免疫耐受功能紊亂、炎癥因子異?；罨?，導(dǎo)致患者出現(xiàn)全身多器官臟器受累[11-12]。目前，SLE發(fā)病原因尚未完全闡明，但相關(guān)研究指出，SLE發(fā)病多與基因變異及異常表達(dá)相關(guān)[13]。miRNA-199a-3p作為一種非編碼RNA廣泛參與細(xì)胞增殖、炎癥反應(yīng)、自噬、氧化應(yīng)激反應(yīng)等生物過程[14-15]。有研究發(fā)現(xiàn)miRNA-199a-3p在骨肉瘤細(xì)胞中低表達(dá)[16]，而Nan等[17]發(fā)現(xiàn)miRNA-199a-3p在脂肪細(xì)胞中高表達(dá)，表明miRNA-199a-3p在不同的組織中表達(dá)水平不同。萬小平等[9]研究發(fā)現(xiàn)miRNA-199a-3p能夠通過mTOR信號(hào)通路而抑制子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的增殖和促凋亡， mTOR信號(hào)通路在免疫細(xì)胞分化、自噬、炎性細(xì)胞因子分泌、氧化應(yīng)激等過程中具有重要影響[18]。而miRNA-199a-3p 在SLE患者的表達(dá)以及miRNA-199a-3p對(duì)SLE患者mTOR信號(hào)通路的調(diào)節(jié)尚未見報(bào)道。

圖 4 miRNA-199a-3p對(duì)單個(gè)核細(xì)胞凋亡的影響Fig 4 Effect of miRNA-199a-3p on apoptosis of mononuclear cells

圖 5 miRNA-199a-3p靶點(diǎn)預(yù)測(cè)及熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證Fig 5 miRNA-199a-3p target prediction and luciferase reporter test

圖 6 外周血單個(gè)核細(xì)胞PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)情況Fig 6 Expression of PI3K/Akt/mTOR signaling pathway related proteins in peripheral blood mononuclear cells

本研究對(duì)30例活動(dòng)期SLE患者、20例緩解期SLE患者以及25例健康志愿者外周血單個(gè)核細(xì)胞的miRNA-199a-3p進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)，結(jié)果顯示：miRNA-199a-3p表達(dá)水平在健康志愿者、緩解期患者和活動(dòng)期患者中依次顯著降低，說明SLE發(fā)病可能與miRNA-199a-3p表達(dá)抑制有關(guān)。SLE的病因和發(fā)病機(jī)制十分復(fù)雜，患者常出現(xiàn)關(guān)節(jié)炎、脫發(fā)、血尿等臨床癥狀[19]，目前國(guó)際上應(yīng)用最廣的活動(dòng)性判斷標(biāo)準(zhǔn)為SLEDAI 評(píng)分。SLEDAI 評(píng)分能夠反映患者病情，并能夠幫助醫(yī)務(wù)工作者判斷患者病情嚴(yán)重程度和指導(dǎo)用藥劑量的選擇。本研究分析miRNA-199a-3p表達(dá)水平與SLE疾病活動(dòng)度的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)miRNA-199a-3p表達(dá)水平與 SLEDAI 評(píng)分間存在負(fù)相關(guān)關(guān)系。提示miRNA-199a-3p表達(dá)水平能夠反映SLE患者活動(dòng)程度。進(jìn)一步對(duì)miRNA-199a-3p表達(dá)水平與臟器受累的關(guān)系進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)皮疹、白細(xì)胞降低和腎炎SLE患者具有較高的miRNA-199a-3p表達(dá)水平。miRNA-199a-3p表達(dá)水平和 SLEDAI 評(píng)分、臟器受累間的關(guān)系為miRNA-199a-3p作為SLE病情評(píng)估指標(biāo)提供了理論基礎(chǔ)。

MiRNA通過與mRNA的3′URL區(qū)結(jié)合而降解mRNA或促進(jìn)mRNA翻譯，從而影響細(xì)胞增殖、分化、自噬、氧化應(yīng)激反應(yīng)等[20]。用Targetscan7.1生物信息學(xué)軟件和熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)對(duì)miRNA-199a-3p靶點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測(cè)和驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)miRNA-199a-3p的靶點(diǎn)為mTOR mRNA 3′UTR，其能夠抑制mTOR mRNA的翻譯，與Wu等[21]報(bào)道相一致。為進(jìn)一步探究miRNA-199a-3p在SLE發(fā)病機(jī)制中的作用，對(duì)外周血單個(gè)核細(xì)胞進(jìn)行了miRNA-199a-3p mimics轉(zhuǎn)染，并檢測(cè)PIAK/Akt/mTOR信號(hào)通路中相關(guān)蛋白水平。WB檢測(cè)結(jié)果顯示：加入miRNA-199a-3p mimics能夠降低mTOR、PI3K、pAKt和Bcl-2水平同時(shí)上調(diào)Bax與caspase-3表達(dá)水平。有研究報(bào)道m(xù)TOR能夠促進(jìn)AtgI3磷酸化，并導(dǎo)致其從AtgI復(fù)合物上脫落而抑制自噬[22]。miRNA-199a-3p降低mTOR表達(dá)水平有利于AtgI和磷酸化的AtgI3結(jié)合，促進(jìn)代謝重新激活進(jìn)而誘導(dǎo)自噬的產(chǎn)生。miRNA-199a-3p降低mTOR表達(dá)水平也進(jìn)一步導(dǎo)致了PI3K和Akt表達(dá)水平變化，其可能原因?yàn)椋航?jīng)targetscan預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，miRNA-199a-3p可能調(diào)節(jié)513個(gè)靶點(diǎn)基因，miRNA-199a-3p水平升高，可能導(dǎo)致某靶點(diǎn)蛋白異常表達(dá)，從而進(jìn)一步影響PI3K和Akt表達(dá)水平。Bax與caspase-3為凋亡相關(guān)蛋白。miRNA-199a-3p提高Bax與caspase-3表達(dá)水平，從而可促進(jìn)外周血單個(gè)核細(xì)胞的凋亡。本研究結(jié)果證明上調(diào)miRNA-199a-3p導(dǎo)致單個(gè)核細(xì)胞凋亡率明顯增加，而凋亡和自噬能力提高可減少死亡細(xì)胞和細(xì)胞器的積累，從而減少自身抗原抗體的產(chǎn)生和炎癥因子的爆發(fā)，而減緩SLE病情。

綜上所述，miRNA-199a-3p對(duì)SLE病情評(píng)估及發(fā)病機(jī)制探究具有一定意義，但由于本研究樣本較少、作用機(jī)制研究不深入，后續(xù)仍要擴(kuò)大樣本并對(duì)miRNA-199a-3p作用機(jī)制進(jìn)行深入研究。