高秀容，許小紅，楊恒博，張旭，李望，汪少

(成都醫(yī)學院藥學院，成都 610083)

丹參(RadixetRhizomaSalviae Miltiorrhiza)為唇型科植物丹參的干燥根及根莖，作為活血化瘀藥有悠久的臨床應(yīng)用歷史，具有祛疲止痛、活血通經(jīng)、清心除煩的功效[1]。大量研究證實，丹參主要含有脂溶性和水溶性兩大類成分，隱丹參酮、丹參酮Ⅰ及丹參酮ⅡA為脂溶性成分，是丹參中含量最高也是最具代表性的主要成分，丹參藥材中丹參酮ⅡA含量較高，為0.1%～0.9%，因而丹參酮ⅡA曾經(jīng)一直作為丹參有效成分的質(zhì)量控制指標，在《中華人民共和國藥典》2015年版中也以丹參酮ⅡA為丹參藥材和丹參注射液的定性定量控制標準[2-3]。

目前，以脂溶性有效成分為主入藥的丹參口服制劑品種有復(fù)方丹參滴丸、丹參酮片、丹參酮膠囊、丹參酮油、丹參舒心膠囊、丹參舒心片和精制冠心片等[4]。體外溶出行為是口服制劑處方工藝篩選的重要指標，也是有效控制制劑質(zhì)量的重要指標。而丹參脂溶性成分的低水溶性是影響口服固體制劑溶出度的一個重要因素，從而影響丹參口服生物利用度[5-8]，筆者以丹參酮Ⅰ、丹參酮ⅡA及隱丹參酮為指標成分，建立了高效液相色譜(HPLC)法同時測定丹參提取物中丹參酮Ⅰ、丹參酮ⅡA及隱丹參酮含量的方法，考察了丹參脂溶性成分的體外溶出行為，篩選其體外溶出條件，以期為丹參脂溶性成分口服制劑的研究開發(fā)提供參考。

1 儀器與試藥

1.1儀器 戴安高效液相色譜儀(美國，Dionex UltiMate3000，包括四元高壓液相泵、自動進樣器、紫外檢測器)；色譜軟件(戴安液相層析儀軟件Chromeleon 7.1)；電子天平(德國 Sartorius，型號：BS 224S，感量：0.01 mg)；離心機(上海安亭科學儀器廠，型號：TGL-16G)；超聲清洗器(天津市奧特賽斯儀器有限公司，型號：AS5150BD)；純水儀(優(yōu)普超純科技公司，型號：UPT)；電熱鼓風干燥箱(上海一恒科學儀器有限公司，型號：DHG-9013A)；溶出儀(天津市國銘醫(yī)藥設(shè)備有限公司，型號：RC-6)。

1.2試藥 丹參酮Ⅰ對照品(中國食品藥品檢定研究院，含量：99.0%，批號：110867-201607)；丹參酮ⅡA對照品(中國食品藥品檢定研究院，含量：99.0%，批號：110766-201520)；隱丹參酮對照品(中國食品藥品檢定研究院，含量：99.0%，批號：110852-200806)；丹參提取物(陜西慈緣生物技術(shù)有限公司，批號：20140401，20140402，20140413)；十二烷基硫酸鈉(SDS，成都市科龍化工試劑廠，分析純)；磷酸二氫鉀(成都市科龍化工試劑廠，分析純)；甲醇(迪馬公司，色譜純)；乙腈(迪馬公司，色譜純)；無水甲酸(天津市科密歐化學試劑有限公司，色譜純)；其他試劑為分析純，水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1色譜條件 采用Agilent HC-C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)色譜柱；流動相：A(0.1%甲酸)，B(乙腈)，采用梯度洗脫，洗脫順序為：0～30 min，5%→55% B；>30～40 min，55%→75% B；>40～50 min，75% B；>50～55 min，75%→5% B；流速1.0 mL·min-1；檢測波長286 nm；柱溫30 ℃；進樣體積10 μL。

2.2對照品溶液的制備 分別精密稱取干燥至恒重的各對照品適量于5 mL棕色量瓶，甲醇定容，得到貯備液備用。取各儲備液適量于25 mL量瓶，甲醇定容得到各對照品的混合標準溶液，其中各對照品濃度分別為丹參酮Ⅰ93.00 μg· mL-1，丹參酮ⅡA 82.50 μg· mL-1，隱丹參酮57.50 μg· mL-1，冷藏、避光備用。

2.3供試品溶液的制備 精密稱取一定量丹參提取物至10 mL 量瓶內(nèi)，加入一定量甲醇，超聲使其完全溶解，10 000 r·min-1(r=8.0 cm)離心5 min以除去不溶物，甲醇定容后，上清液經(jīng)孔徑0.22 μm 微孔濾膜濾過后進樣。

2.4方法學考察

2.4.1方法專屬性考察 按“2.1”項色譜條件，分別取空白甲醇溶液、對照品溶液和供試品溶液，記錄色譜圖(圖1)，丹參酮Ⅰ、丹參酮ⅡA和隱丹參酮保留時間分別約為39，40和46 min，丹參酮Ⅰ和丹參酮ⅡA分離度為1.2，隱丹參酮分離度大于1.5。可見，空白溶液對各成分無干擾，各成分與雜質(zhì)峰分離度較好。

2.4.2線性關(guān)系考察 取“2.2”項配制的混合標準溶液，用甲醇依次稀釋，得以下混合標準品的標準曲線溶液：丹參酮Ⅰ標準曲線濃度為93.00，46.50，23.25，11.63，5.81，2.91，1.45 μg· mL-1，丹參酮ⅡA標準曲線濃度為82.50，41.25，20.63，10.31，5.16，2.58，1.29 μg· mL-1，隱丹參酮標準曲線濃度為57.50，28.75，14.38，7.19，3.59，1.80，0.90 μg· mL-1。 按“2.1”項色譜條件進樣20 μL，以色譜峰面積(Y) 對藥物濃度(X)進行線性回歸，繪制標準曲線。

丹參酮Ⅰ回歸方程為Y=0.202 3X+0.296 7(R2=0.999 2)，線性范圍1.45～93.00 μg· mL-1；丹參酮ⅡA回歸方程為Y=0.445 6X+0.527 2(R2=0.999 4)，線性范圍1.29～82.50 μg· mL-1；隱丹參酮回歸方程為Y=0.131 8X+0.000 2(R2=1.000)，線性范圍0.90～57.50 μg· mL-1。結(jié)果表明各標準品在考察濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.4.3精密度實驗 取高、中、低濃度混合對照品溶液，其中丹參酮Ⅰ高、中、低濃度分別為46.50，11.63，2.91 μg· mL-1，丹參酮ⅡA高中低濃度分別為41.25，10.31，2.58 μg· mL-1，隱丹參酮高、中、低濃度分別為28.75，7.19，1.80 μg· mL-1，在上述色譜條件下，連續(xù)進樣5次，記錄峰面積，分別計算峰面積的RSD。 結(jié)果丹參酮Ⅰ高、中、低濃度的峰積RSD分別為0.36%，0.54%，0.55%；丹參酮ⅡA高中低濃度的峰面積RSD分別為0.50%，0.14%，0.32%；隱丹參酮高中低濃度的峰面積RSD 分別為0.66%，0.28%，0.45%；說明各成分精密度良好。

A.空白甲醇溶液；B.對照品溶液；C.供試品溶液；1.丹參酮Ⅰ；2.丹參酮ⅡA；3.隱丹參酮

圖13種溶液的HPLC圖譜

A.methanol solution；B.reference solution ；C.sample solution；1.tanshinoneⅠ；2 tanshinonⅡA；3.cryptotanshinone

Fig.1HPLCchromatogramsofthreekindsofsolution

2.4.4穩(wěn)定性實驗 取兩種濃度混合對照品溶液，其中丹參酮Ⅰ高、低濃度分別為46.50，2.91 μg· mL-1，丹參酮ⅡA高、低濃度分別為41.25，2.58 μg· mL-1，隱丹參酮高、低濃度分別為28.75，1.80 μg· mL-1，將該混合對照品溶液置于37 ℃恒溫水浴鍋中，于0，2，4，6，8，12，24，36 h取樣，在上述色譜條件下進樣，記錄峰面積。結(jié)果丹參酮Ⅰ高、低濃度RSD分別為1.15%，1.02%；丹參酮ⅡA高、低濃度RSD分別為1.01%，0.66%；隱丹參酮高、低濃度RSD分別為0.65%，1.16%，可見，各成分在37 ℃下36 h穩(wěn)定。

2.4.5加樣回收率實驗 取已知含量的提取物，精密稱定27份，分成9組，每組3份。分別加入高、中、低濃度的混合對照品溶液，其中丹參酮Ⅰ高、中、低濃度分別為46.50，11.63，2.91 μg· mL-1，丹參酮ⅡA高、中、低濃度分別為41.25，10.31，2.58 μg· mL-1，隱丹參酮高、中、低濃度分別為28.75，7.19，1.80 μg· mL-1，按“2.3”項下方法處理，在上述色譜條件下測定。結(jié)果丹參酮Ⅰ高、中、低濃度平均加樣回收率為(99.85±0.034)%(n=3)，丹參酮ⅡA高、中、低濃度平均加樣回收率為(100.35±0.019)%(n=3)，隱丹參酮高、中、低濃度平均加樣回收率為(100.74±0.026)%(n=3)，符合要求。

2.5丹參提取物中各成分含量測定 取3個批號丹參提取物，每個批號分別按“2.3”項下方法平行制備3個樣品，進行含量測定，在上述色譜條件下測定，記錄色譜峰面積，按外標法計算各成分的含量，結(jié)果見表1。

表1丹參提取物中各成分含量測定結(jié)果

提取物批號丹參酮Ⅰ丹參酮ⅡA隱丹參酮201404010.332±0.0540.954±0.0680.544±0.010201404020.345±0.0330.886±0.0740.532±0.021201404130.310±0.0120.827±0.0510.478±0.038

2.6提取物中各成分體外溶出行為考察 溶出條件：由于丹參脂溶性成分均為水難溶性成分，故選擇《中華人民共和國藥典》收載的第三法(小杯法)進行溶出實驗。釋放介質(zhì)體積為250 mL，為純水或不同pH值緩沖液，溶出溫度為(37.0±0.5)℃，取樣時間點為0，2，4，6，8，10，12 h，每次吸取溶出液3 mL，取出后及時補加新鮮空白溶出介質(zhì)3 mL，溶出液以孔徑0.45 μm濾膜過濾，續(xù)濾液用HPLC法進行測定。

2.6.1SDS對丹參提取物成分溶出行為的影響 對于水溶性較差的藥物，可在釋放介質(zhì)中加入表面活性劑促進藥物溶出[5]，故本實驗考察了0.0%，0.3%，0.5%，0.7%和0.9% SDS對丹參脂溶性成分丹參酮Ⅰ、丹參酮ⅡA和隱丹參酮溶出行為的影響。釋放介質(zhì)為pH值6.8磷酸鹽緩沖液，轉(zhuǎn)速75 r·min-1，實驗結(jié)果見圖2～4。

由圖2～4可知，當溶出液中不加入SDS時(即SDS濃度0.0%)，溶出液中未能檢測上述3種成分；隨著溶出液中SDS濃度增加，3種脂溶性成分溶出度逐漸增加，可見SDS對上述3種成分溶出行為有顯著影響。由于一般要求溶出介質(zhì)中SDS濃度<0.5%，故在后續(xù)實驗中選擇SDS濃度為0.5%繼續(xù)進行考察。

圖2 不同濃度SDS對丹參酮Ⅰ溶出行為的影響

Fig.2EffectofdifferentconcentrationsofSDSonthedissolutionbehavioroftanshinoneⅠ

圖3 不同濃度SDS對丹參酮ⅡA溶出行為的影響

Fig.3EffectofdifferentconcentrationsofSDSonthedissolutionbehavioroftanshinonⅡA

圖4 不同濃度SDS對隱丹參酮溶出行為的影響

Fig.4EffectofdifferentconcentrationsofSDSonthedissolutionbehaviorofcryptotanshinone

2.6.2不同pH值對丹參提取物溶出行為的影響 考察丹參酮Ⅰ、丹參酮ⅡA和隱丹參酮在純化水、pH值4.0、pH值6.8和pH值7.4磷酸鹽緩沖液中的溶出行為。釋放介質(zhì)SDS濃度為0.5%、轉(zhuǎn)速75 r·min-1時實驗結(jié)果見圖5～7。

由圖5～7可知，溶出介質(zhì)的pH值對丹參酮Ⅰ、丹參酮ⅡA和隱丹參酮的溶出行為無顯著影響，美國食品藥品管理局(FDA)規(guī)定，以pH值6.8與人體腸液相似，此pH值更符合藥物經(jīng)口服后的體內(nèi)環(huán)境[9]，故在后續(xù)實驗中采用pH值6.8磷酸鹽緩沖液為溶出介質(zhì)。

圖5 不同pH值溶出液對丹參酮Ⅰ溶出行為的影響

Fig.5EffectofdifferentpHsolutiononthedissolutionbehavioroftanshinoneⅠ

圖6 不同pH值溶出液對丹參酮ⅡA溶出行為的影響

Fig.6EffectofdifferentpHsolutiononthedissolutionbehavioroftanshinonⅡA

圖7 不同pH值溶出液對隱丹參酮溶出行為的影響

Fig.7EffectofdifferentpHsolutiononthedissolutionbehaviorofcryptotanshinone

2.6.3轉(zhuǎn)速的影響 由于丹參脂溶性成分均為水難溶性成分，本實驗采用提高溶出儀轉(zhuǎn)速的方法提高其溶出度，分別考察3種成分在50，75和100 r·min-1條件下的溶出行為，結(jié)果見圖8～10。

由圖8～10可知，溶出儀轉(zhuǎn)速對丹參酮Ⅰ、丹參酮ⅡA和隱丹參酮的溶出行為無顯著影響，說明這3種成分的溶出特性受釋放介質(zhì)流動狀態(tài)影響較小。

3 討論

由于丹參3種脂溶性成分結(jié)構(gòu)相似，尤其是隱丹參酮和丹參酮，所以HPLC很難將二者達到基線分離，所以本實驗采用梯度洗脫的方法，最終分離度良好，成功對三者進行分析。

圖8 不同轉(zhuǎn)速對丹參酮Ⅰ溶出行為的影響

Fig.8EffectofdifferentrotationalspeedonthedissolutionbehavioroftanshinoneⅠ

圖9 不同轉(zhuǎn)速對丹參酮ⅡA溶出行為的影響

Fig.9EffectofdifferentrotationalspeedonthedissolutionbehavioroftanshinonⅡA

圖10 不同轉(zhuǎn)速對隱丹參酮溶出行為的影響

Fig.10Effectofdifferentrotationalspeedonthedissolutionbehaviorofcryptotanshinone

由于丹參脂溶性成分均為水難溶性成分，在溶出介質(zhì)中濃度較低，故選擇《中華人民共和國藥典》2015年版收載的第三法——小杯法進行溶出實驗，實驗結(jié)果顯示，該方法適宜作為丹參脂溶性成分溶出行為的研究。

在實驗中，曾考察除SDS之外的其他表面活性劑對丹參3種脂溶性成分的溶出行為的影響，如聚山梨酯-80，結(jié)果顯示聚山梨酯-80對3種成分溶出行為無影響(數(shù)據(jù)未列出)，最終篩選出SDS為作為溶出介質(zhì)。

本實驗以丹參酮Ⅰ、丹參酮ⅡA及隱丹參酮為丹參脂溶性成分的指標成分，成功建立了HPLC方法同時測定丹參提取物中丹參酮Ⅰ、丹參酮ⅡA及隱丹參酮含量，考察了丹參脂溶性成分的體外溶出行為，篩選其體外溶出條件，為丹參脂溶性成分口服制劑的研究開發(fā)提供研究基礎(chǔ)。