李貴新 劉錦 王文浩 李爽 于蘊奇

胰腺癌是常見的消化道腫瘤，其惡性程度極高，早期診斷困難，預后多不良[1-2]。尋找更有效、低毒性、特異性強的藥物來治療胰腺癌具有積極的意義。c-Met是肝細胞生長因子（HGF）的受體，屬于酪氨酸激酶受體家族，高表達于多種腫瘤，可結合來源于間質細胞分泌的HGF，激活下游偶聯(lián)的多種信號通路（如PI3KAKT、Ras-Raf-MAPK等）而促進腫瘤細胞增長、侵襲和轉移。胰腺癌患者c-Met陽性表達率隨著病情加重而升高[3-4]。故將HGF/c-Met信號通路作為靶點，采用合適的c-Met抑制劑來抑制腫瘤細胞增殖和侵襲而實現(xiàn)治療的作用。本研究采用不同濃度c-Met抑制劑sull274對人胰腺癌細胞系KP-3進行處理，用westem-blot方法檢測c-Met蛋白的表達量，以探討c-Met抑制劑對胰腺癌細胞系增殖和遷移能力的影響。

1 材料和方法

1.1 材料

本研究實施于2015年1—12月。人胰腺癌細胞系中國科學院細胞庫（KP-3），MTT（四甲基偶氮唑藍）和DMSO（二甲基亞砜）（sigma公司），胎牛血清和DMEM培養(yǎng)基（上海玉博生物科技有限公司），sull274（上海吉瑪生物科技有限公司），Transwell侵襲小室（美國Corning公司），Matrigel膠（BD公司）。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)與分組處理 取KP-3細胞加入含10%胎牛血清的DMEM，置于37℃、5%二氧化碳的培養(yǎng)箱內培養(yǎng)，每3天傳代1次，取對數(shù)增殖期細胞進行實驗。sull274溶于DMSO中，制成0.1 mmol/L濃度原液，以DMEM稀釋獲得所需濃度，并使DMSO終濃度為0.1%。將培養(yǎng)的細胞分別對照組和干預組。對照組采用0.1%終濃度的DMSO處理，干預組分別用DMEM中sull274終濃度為0 μmol/L、20 μmol/L、60 μmol/L和100 μmol/L進行處理。

1.2.2 MTT增殖實驗 用DMEM培養(yǎng)液加入處理過的胰腺癌細胞，使其濃度為105/ml，向96孔板各孔加100 μL，次日吸出DMEM培養(yǎng)基，每組設3個復孔。在培養(yǎng)箱內分別培養(yǎng)24小時、48小時、72小時后，各孔加MTT溶液20 μL，避光培養(yǎng)4小時后棄掉培養(yǎng)液，各孔加DMSO溶液150 μL，振蕩，用酶標儀測定490 nm處的A值。

1.2.3 Trallswell assay檢測細胞遷移 按1：5比例用無血清DMEM稀釋Matrigel，Trallswell小室上層濾膜上各孔加入75 μl稀釋后的Matrigel，37℃過夜，次日Matrigel形成膠以備后續(xù)實驗使用。收集對數(shù)生長期細胞，用DMEM培養(yǎng)液加入處理過的胰腺癌細胞，使其濃度為105/ml，上室加200 μl含sull 274的DMEM，下室加600 μl培養(yǎng)基，分對照組，和0 μmol/L、20 μmol/L、60 μmol/L和100μmol/L組，每組設3個復孔。培養(yǎng)24小時后取出上室，PBS清洗，4%甲醛固定，12孔板中加入結晶紫，小室置于其中維持30分鐘，取出小室鏡下觀察，隨機取5個視野計算細胞數(shù)，用侵襲細胞數(shù)目評定細胞的侵襲遷移能力。

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 c-Met抑制劑sull274對胰腺癌細胞系KP-3增殖能力的影響

sull274對胰腺癌細胞系KP-3增殖有抑制作用，隨著干預時間延長，其抑制作用越明顯；且隨著濃度的增加，其抑制作用也明顯加強（P＜0.05），見表1。

2.2 c-Met抑制劑sull274對胰腺癌細胞系KP-3遷移能力的影響

sull274對胰腺癌細胞系KP-3遷移距離有抑制作用，隨著干預時間延長，細胞遷移距離逐漸縮短；且隨著濃度的增加，細胞遷移距離逐漸縮短（P＜0.05），見表2。

表1 不用濃度sull274處理不同時間點時KP-3增殖率的變化 （ ±s，%）

表1 不用濃度sull274處理不同時間點時KP-3增殖率的變化 （ ±s，%）

注：a代表對照組，b代表20 μmol/L組，c代表60 μmol/L組，d代表100 μmol/L組

對照組 a 105 98．2±4．1 98．0±3．6 97．9±2．4 0．135 0．812 20μmol/Lb 105 94．2±4．6 86．5±3．9 79．6±2．9 4．625 0．000 60μmol/Lc 105 85．4±4．8 74．2±4．0 66．2±3．5 5．871 0．000 100μmol/Ld 105 60．2±4．3 47．0±4．8 34．5±2．6 6．022 0．000 F/P值 - 9．548/0．000 10．516/0．000 8．284/0．000 - -tb/a/P值 - 20．527/0．000 68．158/0．000 153．733/0．000 - -tc/a/P值 - 64．120/0．000 139．855/0．000 236．221/0．000 - -td/a/P值 - 202．254/0．000 268．794/0．000 566．614/0．000 - -tc/b/P值 - 41．857/0．000 69．624/0．000 93．227/0．000 - -td/b/P值 - 170．748/0．000 201．967/0．000 366．171/0．000 - -td/c/P值 - 123．657/0．000 137．662/0．000 229．916/0．000 - -

表2 不用濃度sull274處理不同時間點時KP-3相對遷移距離的變化（ ±s，mm）

表2 不用濃度sull274處理不同時間點時KP-3相對遷移距離的變化（ ±s，mm）

注：a代表對照組，b代表20 μmol/L組，c代表60 μmol/L組，d代表100 μmol/L組

對照組 a 105 11．4±0．9 12．0±0．8 11．8±0．9 0．315 0．462 20 μmol/Lb 105 9．5±0．7 9．0±0．7 8．4±0．6 4．572 0．000 60 μmol/Lc 105 8．9±0．7 8．5±0．6 8．0±0．5 5．021 0．000 100 μmol/Ld 105 8．0±0．6 7．3±0．5 6．7±0．4 5．534 0．000 F/P值 - 5．021/0．000 5．200/0．000 4．984/0．000 - -tb/a/P值 - 52．697/0．000 89．245/0．000 99．399/0．000 - -tc/a/P值 - 69．338/0．000 110．679/0．000 116．716/0．000 - -td/a/P值 - 99．399/0．000 175．544/0．000 163．751/0．000 - -tc/b/P值 - 19．166/0．000 17．149/0．000 16．196/0．000 - -td/b/P值 - 51．449/0．000 62．493/0．0000 74．549/0．000 - -td/c/P值 - 30．869/0．000 48．587/0．000 64．202/0．000 - -

3 討論

胰腺癌是一種侵襲性極強的消化道惡性腫瘤，大多數(shù)患者確診時已進入中晚期。目前，胰腺癌尚無有效的早期診治手段，因易出現(xiàn)廣泛性轉移而使其5年病死率高達98%[4-6]。故開發(fā)更有效，毒性低、特異性強的靶向藥物治療，對降低胰腺癌患者病死率有著積極意義。

c-Met是HGF受體，是酪氨酸激酶受體家族成員之一，其含有酪氨酸激酶活性結構，廣泛表達于多種上皮細胞及相關來源的腫瘤中，能與由間質細胞分泌的HGF結合而活化下游偶聯(lián)的P13K-AKT、SRC等信號通路來促進腫瘤細胞增殖、侵襲和轉移[7-9]。據(jù)報道，c-Met在胃癌、大腸癌、肝癌、胰腺癌等多種消化道惡性腫瘤中均異常高表達，且隨著腫瘤浸潤深度、臨床分期增加和淋巴結轉移及遠處轉移而升高[10-12]，故將HGF/c-Met信號通路作為靶點，選用合適的c-Met抑制劑來抑制腫瘤細胞增殖和侵襲，從而達到治療的目的。

本實驗先觀察不同濃度c-Met抑制劑sull274對KP-3細胞的體外增殖能力的抑制作用的差異，結果顯示24小時、48小時和72小時后各濃度sull274處理的KP-3細胞增殖率均逐漸降低，且隨著sull274濃度的增加，細胞增殖率降低更明顯，說明c-Met抑制劑對胰腺癌細胞系的增殖能力有抑制作用，且隨著作用時間及濃度增加，其抑制作用逐漸增加。進一步觀察不同濃度c-Met抑制劑sull274對KP-3細胞的體外遷移能力的影響，發(fā)現(xiàn)24小時、48小時和72小時后各濃度sull274處理的KP-3細胞遷移的相對距離逐漸縮短，濃度越高，相對遷移距離越短，表明sull274能抑制胰腺癌細胞系的遷移，且呈濃度依賴性，這與傅俊凱等[13]研究報道一致。

綜上所述，c-Met抑制劑可抑制體外胰腺癌細胞系的增殖和遷移能力，因此可能抑制胰腺癌的發(fā)生和進展，可能為將來開發(fā)新的胰腺癌靶向藥物提供依據(jù)。