許桂麗 段靖 劉梅 魯毅 楊波 周燕萍 王亞威

助孕丸為我院自制制劑，由熟地黃、赤芍、白芍、當(dāng)歸等十九味中藥材組成，其功能主治為養(yǎng)血活血，益腎健脾；用于黃體功能缺陷，子宮發(fā)育不良等癥的治療。在現(xiàn)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中，僅對(duì)赤芍、熟地黃兩味藥材進(jìn)行定性鑒別，難以全面控制制劑質(zhì)量。本次試驗(yàn)修訂了現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)中的TLC方法，并新建了白芍、當(dāng)歸、川芎的薄層鑒別方法；赤芍、白芍均為方中主要藥材，芍藥苷為其共有活性成分，本試驗(yàn)采用高相液相色譜法測(cè)量制劑助孕丸中芍藥苷的含量，為整體控制該產(chǎn)品質(zhì)量提供標(biāo)準(zhǔn)和技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 儀器

安捷倫1260高效液相色譜儀（Agilent ）、KH-100超聲清洗器（昆山禾創(chuàng)）、FA-2004N電子分析天平（上海精科）、DZF-6050真空干燥箱（上海精宏）、CPA225D電子分析天平（Sartorius）。

1.2 試藥

熟地黃對(duì)照藥材（生產(chǎn)批號(hào)：121196-201406）；赤芍對(duì)照藥材（生產(chǎn)批號(hào)：121093-201303）；白芍對(duì)照藥材（生產(chǎn)批號(hào)：120905-201610）川芎對(duì)照藥材（生產(chǎn)批號(hào)：120918-201612）；當(dāng)歸對(duì)照藥材（生產(chǎn)批號(hào)：120927-201617）；芍藥苷對(duì)照品（生產(chǎn)批號(hào)：110736-201842），購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；助孕丸（200 g/袋，中國(guó)人民解放軍第454醫(yī)院）；乙腈是色譜純，其他為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 TLC鑒別

2.1.1 熟地黃的薄層色譜鑒別 稱取助孕丸5 g，研至細(xì)粉，加水50 ml，微熱使充分溶散，煮沸，放冷后使用濾紙過(guò)濾，乙酸乙酯提取2次，每次用量為30 ml，合并兩次提取液，蒸干溶劑后加甲醇1 ml將殘?jiān)芙?，制備出供試品溶液。? g熟地黃對(duì)照藥材，加水50 ml，煎煮30分鐘后冷卻，同法完成對(duì)照藥材溶液制備。取除去熟地黃藥材的其他藥材制成的陰性制劑，同法獲得陰性對(duì)照溶液。照TLC法《中國(guó)藥典》2015年版四部通則0502）試驗(yàn)，量取以上溶液各10 μl，在同一硅膠G薄層板上分別點(diǎn)樣，選用乙酸乙酯-二甲苯（1：1）作為展開(kāi)劑，待展開(kāi)后取出薄層板，自然晾干，用二硝基苯肼乙醇試液噴灑顯色。觀察結(jié)果，供試品色譜中，與熟地黃對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，有相同的淡黃色斑點(diǎn)出現(xiàn)[1-3]，陰性對(duì)照色譜無(wú)此斑點(diǎn)。見(jiàn)圖1。

2.1.2 赤芍、白芍的TLC鑒別 取助孕丸5 g，研碎，加乙醇30 ml，振搖10分鐘，過(guò)濾，蒸至溶劑剩余約1 ml，制備出供試品溶液。取白芍、赤芍對(duì)照藥材各0.6 g，混合，加乙醇20 ml，同法完成對(duì)照藥材溶液制備。取除去赤芍、白芍藥材的其他藥材制成的陰性制劑，同法完成陰性對(duì)照溶液制備。照TLC法試驗(yàn)，分別量取所制溶液各10 μl，點(diǎn)于同一塊硅膠G薄層板上，選用三氯甲烷－甲醇－乙酸乙酯－甲酸（40：10：5：0.2）為展開(kāi)劑，待展開(kāi)后取出薄層板，自然晾干，用香草醛硫酸溶液（5%）噴灑顯色，放于烘箱加熱至105℃，待顯示出清晰斑點(diǎn)。結(jié)果顯示，供試品色譜中，和混合對(duì)照藥材TLC色譜相應(yīng)的位置上，有相同的藍(lán)紫色斑點(diǎn)出現(xiàn)[4-7]，陰性對(duì)照色譜無(wú)此斑點(diǎn)，見(jiàn)圖2。

2.1.3 川芎、當(dāng)歸的TLC鑒別 取助孕丸粉末10 g，加乙醚60 ml，振搖10分鐘后濾紙過(guò)濾，蒸干，取1 ml乙醇將殘?jiān)芙?，制備出供試品溶液。取川芎、?dāng)歸對(duì)照藥材各1 g，加乙醚20 ml，同法完成混合對(duì)照藥材溶液制備。取除去赤芍、白芍藥材的其他藥材制成的陰性制劑，同法完成陰性對(duì)照溶液制備。照薄層色譜法試驗(yàn)，量取所制溶液各10 μl，同一硅膠G薄層板上分別點(diǎn)樣，選擇正己烷-乙酸乙酯（4：1）為展開(kāi)劑，待展開(kāi)后取出薄層板，自然晾干，放于紫外光燈（365 nm）下查看結(jié)果。供試品色譜中，與混合對(duì)照藥材色譜相應(yīng)位置上，有相同顏色熒光斑點(diǎn)出現(xiàn)[8-11]，陰性對(duì)照色譜無(wú)對(duì)應(yīng)的斑點(diǎn)。見(jiàn)圖3。

2.2 芍藥苷的含量測(cè)定

2.2.1 色譜條件 色譜柱為：InertSustain C18（5 μm，4.6×250 mm），乙腈-0.1%磷酸溶液（13：87）為流動(dòng)相，流速為1.0 ml/min。檢驗(yàn)波長(zhǎng)為230 nm[12-14]。理論塔板數(shù)按芍藥苷峰計(jì)算應(yīng)不低于2 000。

2.2.2 溶液的制備 對(duì)照品溶液制備 精密量取芍藥苷對(duì)照品適量，甲醇溶解，制成每1 ml含芍藥苷0.53 mg的溶液，即得。

供試品溶液制備 精密稱取助孕丸7.0 g，放于具塞錐形瓶中，精確加入50 ml甲醇，密塞并稱定重量，浸泡3.5 h后超聲處理60分鐘，放冷，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減少的重量，搖勻后用濾紙過(guò)濾，取續(xù)濾液，即得。

陰性對(duì)照溶液制備 取2.1.3中陰性制劑適量，同法完成陰性對(duì)照溶液制備。

2.2.3 專屬性試驗(yàn) 按2.2.1色譜條件取助孕丸供試品、芍藥苷對(duì)照品、陰性對(duì)照溶液各10 μl進(jìn)樣，陰性對(duì)照色譜中，在芍藥苷相應(yīng)的出峰時(shí)間處無(wú)干擾峰出現(xiàn)。見(jiàn)圖4。

圖1 熟地黃的TLC圖譜

圖2 赤芍、白芍的薄層色譜鑒別圖

圖3 川芎、當(dāng)歸的薄層色譜鑒別圖

表1 助孕丸加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n=6）

表2 助孕丸中芍藥苷含量

圖4 助孕丸HPLC

2.2.4 線性關(guān)系考察 分別量取“2.2.2”項(xiàng)下芍藥苷對(duì)照品溶液2 ml、4 ml、6 ml、8 ml、10 ml，放于10 ml量瓶中，甲醇稀釋至刻度，搖勻，制備出對(duì)照品溶液。取上述對(duì)照品溶液各10 μl，精密稱定，按2.2.1色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖。以進(jìn)樣量（X）為橫坐標(biāo)，峰面積（Y）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程Y=1 050.9X+154.0，r=0.999 9；結(jié)果表明芍藥苷在1.06～5.30 μg范圍內(nèi)與峰面積有良好的線性關(guān)系。

2.2.5 精密度試驗(yàn) 精密吸取芍藥苷對(duì)照品溶液10 μl，連續(xù)進(jìn)樣6次，對(duì)照品溶液峰面積的RSD為0.60%，表明精密度良好。

2.2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一助孕丸供試品溶液，分別在0、8、16、24、48 h各進(jìn)樣10 μl，測(cè)定峰面積，考察溶液穩(wěn)定性，RSD為1.20%，表明供試品溶液至少在48小時(shí)內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.7 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一供試品，按“2.2.2”項(xiàng)方法平行制備6份供試品溶液，依次測(cè)定，得出助孕丸中芍藥苷含量，RSD為1.00%，結(jié)果表明重復(fù)性良好。

2.2.8 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取已知含量的助孕丸供試品（2.21 mg/g）2.00 g，6份，分別精密加入芍藥苷4.40 mg，依法檢測(cè)，算出回收率，結(jié)果見(jiàn)表1。

2.2.9 供試品含量測(cè)定 按“2.2.2”項(xiàng)方法制得助孕丸供試品溶液10批，按上述色譜條件測(cè)定，計(jì)算其所含芍藥苷量，結(jié)果見(jiàn)表2。由表2可知，助孕丸中芍藥苷含量最低2.14 mg/g，以最低測(cè)定值的80%為限，故擬助孕丸中含芍藥苷不得低于1.71 mg/g。

3 討論

3.1 定性物質(zhì)的選擇

助孕丸處方包含十九味中藥材，成分繁雜，薄層鑒別干擾因素眾多，參考同類試驗(yàn)相關(guān)資料及摸索試驗(yàn)步驟，篩選出薄層色譜效果較好的熟地黃、赤芍、白芍、當(dāng)歸和川芎，故選擇該5種藥材作為薄層色譜鑒別成分。由于當(dāng)歸和川芎中都存在活性成分-蒿苯內(nèi)酯，如果分開(kāi)點(diǎn)樣陰性對(duì)照會(huì)相互干擾，現(xiàn)將當(dāng)歸、川芎兩種藥材合并鑒別，當(dāng)歸、川芎使用雙陰性對(duì)照進(jìn)行薄層鑒別的方法在藥典中早有收載[15]。

3.2 定量物質(zhì)的選擇

赤芍和白芍均為方中主要藥味，兩者都含有芍藥苷，芍藥苷具有擴(kuò)張血管；鎮(zhèn)痛鎮(zhèn)靜；抗炎抗?jié)兊茸饔?。參考相關(guān)文獻(xiàn)和中華人民共和國(guó)藥典（2015年版），均采用芍藥苷作為赤芍和白芍的定量物質(zhì)，判斷其藥材優(yōu)劣的重要指標(biāo)。本實(shí)驗(yàn)選擇芍藥苷作為助孕丸的定量物質(zhì)，以期對(duì)制劑質(zhì)量作出全面的評(píng)價(jià)。

3.3 供試品提取方法的選擇

甲醇作為提取助孕丸中芍藥苷的溶劑，比較超聲處理30 min、60 min和90 min時(shí)提取效果。其他條件相同，超聲時(shí)間為60 min、90 min時(shí)，助孕丸中芍藥苷成分能充分提取。故本試驗(yàn)選擇甲醇作為提取溶劑、超聲處理60 min作為供試品的提取方法。

3.4 流動(dòng)相的選擇

查閱參考文獻(xiàn)[12-14]，流動(dòng)相中乙腈含量高時(shí)，芍藥苷分離效果不明顯；適當(dāng)降低乙腈比例，選用乙腈-0.1%磷酸（13：87）、流速1 ml/min作為流動(dòng)相時(shí)，芍藥苷與其他組分可完全分離，達(dá)到較佳的結(jié)果。

TLC法可鑒別助孕丸中的熟地黃、赤芍、白芍、當(dāng)歸和川芎等五種藥材，操作方法簡(jiǎn)便可行，可成為助孕丸的定性鑒別方法；HPLC法測(cè)定助孕丸中芍藥苷的含量，操作簡(jiǎn)單易行，結(jié)果穩(wěn)定準(zhǔn)確，可作為助孕丸的含量測(cè)定方法。