韓雨希，姜軒，葛秀國(guó)，安曉康，朱子達(dá)，趙瑞利，通信作者，馬吉飛，李玥，王聰，徐良麟

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天津地區(qū)警犬點(diǎn)滴復(fù)膜酵母菌的流行病學(xué)調(diào)查及致病性研究

韓雨希1，姜軒1，葛秀國(guó)1，安曉康1，朱子達(dá)1，趙瑞利1，通信作者，馬吉飛1，李玥2，王聰1，徐良麟1

（1. 天津農(nóng)學(xué)院 動(dòng)物科學(xué)與動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，天津 300384；2. 天津農(nóng)學(xué)院 附屬動(dòng)物醫(yī)院，天津 300384）

為研究點(diǎn)滴復(fù)膜酵母菌（）分子流行病學(xué)及對(duì)犬腸道的致病性，試驗(yàn)從天津地區(qū)3個(gè)大型警犬基地分批次采集約222份糞便樣本，對(duì)糞便樣本中疑似點(diǎn)滴復(fù)膜酵母菌進(jìn)行鏡檢、分離培養(yǎng)、染色鑒定、酵母菌基因組提取及18S rRNA基因鑒定，并對(duì)分離的菌株進(jìn)行犬致病性研究。結(jié)果顯示，警犬基地一警犬點(diǎn)滴復(fù)膜酵母菌陽(yáng)性樣本35個(gè)，陽(yáng)性攜帶率約 15.77%；通過(guò)染色確定該酵母菌的增殖方式為出芽生殖性；通過(guò)18S rRNA基因擴(kuò)增出目的條帶約400 bp；實(shí)驗(yàn)犬6只，進(jìn)行犬點(diǎn)滴復(fù)膜酵母菌的致病性研究，結(jié)果2只犬出現(xiàn)腹瀉血便癥狀，糞便鏡檢發(fā)現(xiàn)點(diǎn)滴復(fù)膜酵母或疑似酵母菌孢子，點(diǎn)滴復(fù)膜酵母菌對(duì)犬可能作為一種機(jī)會(huì)致病菌，在一定條件下可引起犬的腸道感染。

警犬；點(diǎn)滴腹膜酵母菌；流行病學(xué)；致病性

點(diǎn)滴復(fù)膜酵母菌（）屬于真菌，是構(gòu)成嚙齒類動(dòng)物如兔子等腸道的正常菌群，目前國(guó)內(nèi)外針對(duì)點(diǎn)滴復(fù)膜酵母菌對(duì)寵物犬或警犬致病性方面的報(bào)道很少，其致病性在不同種屬間存在爭(zhēng)議[1]。 有研究報(bào)道，在慢性腹瀉犬的糞便中檢出大量脫落的點(diǎn)滴復(fù)膜酵母菌，由于具體腹瀉原因并未發(fā)現(xiàn)，但在正常犬體內(nèi)也能找到點(diǎn)滴復(fù)膜酵母菌，雖然沒(méi)有直接證據(jù)證明點(diǎn)滴復(fù)膜酵母菌導(dǎo)致犬腹瀉、便血，但其很有可能成為機(jī)會(huì)性致病菌[2]。

與犬相關(guān)的大多數(shù)酵母菌種與正常犬類動(dòng)物共生，其中包括假絲酵母菌屬（）、釀酒酵母（）和紅酵母屬（spp.）[3]。盡管如此，這些屬的酵母菌也被報(bào)道為人和犬等各種動(dòng)物的局部和系統(tǒng)感染的病原體，最常見(jiàn)的原因是宿主物理化學(xué)或免疫防御障礙的干擾而導(dǎo)致微生物大量繁殖[4]。Winston等[5]報(bào)道，犬在確診感染點(diǎn)滴復(fù)膜酵母菌后，出現(xiàn)慢性腹瀉的癥狀。而自荷蘭研究人員報(bào)道，酵母菌大量存在于當(dāng)?shù)馗篂a的貓和狗中[6-7]?，F(xiàn)從天津地區(qū)某警犬基地共采集約222份糞便樣本，對(duì)糞便樣本進(jìn)行顯微鏡檢測(cè)，對(duì)其進(jìn)行點(diǎn)滴復(fù)膜酵母菌的檢出率統(tǒng)計(jì)，并進(jìn)行犬的致病性研究，為點(diǎn)滴復(fù)膜酵母菌與犬腹瀉在臨床上關(guān)聯(lián)提供理論依據(jù)。

1 材料

1.1 樣本來(lái)源

分別從天津地區(qū)3個(gè)警犬基地共采集約222份糞便樣本。

1.2 試驗(yàn)動(dòng)物

試驗(yàn)犬（田園犬）共6只，年齡約1歲，體重約7 kg，雄性2只，雌性4只。

1.3 主要試劑

沙堡羅葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（環(huán)凱微生物科技有限公司）；孔雀石綠染液、復(fù)紅染液（南京建成科技有限公司）；酵母基因組DNA提取試劑盒（天根生化科技有限公司）；DNA-Marker（DL 2000）、5×Loading Buffer、2×Master Mix（上海捷瑞生物工程有限公司）；瓊脂糖、1×TAE（上海捷瑞生物工程有限公司）；核酸染色劑（北京索萊寶生物科技有限公司）。18P1：GCATCGATGAAGA ACGCAGC；18P2：TCCTCCGCTTATTGATATGC（引物由蘇州金唯智生物科技有限公司合成）。

1.4 主要儀器設(shè)備

恒溫培養(yǎng)箱（上海?，攲?shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）、生物顯微鏡（重慶奧特光學(xué)儀器有限公司）、自動(dòng)內(nèi)校電子分析天平（上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司）、超凈工作臺(tái)（江蘇蘇凈集團(tuán)有限公司）、 PCR 儀、S1000 凝膠成像系統(tǒng)（伯樂(lè)生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品有限公司）、穩(wěn)壓溫流電泳儀（北京君意東方電泳設(shè)備有限公司）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 糞便樣本采集及鏡檢

從天津3個(gè)大型警犬基地采集糞便樣本222份，保存于糞便采集袋中，實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行顯微鏡鏡檢。

2.2 沙堡羅葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)

對(duì)初步鏡檢點(diǎn)滴腹膜酵母菌陽(yáng)性的糞便樣本用沙堡羅葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)2～3 d，觀察菌落特征。

2.3 水浸片鏡檢

用接種環(huán)在培養(yǎng)基中挑取少量帶有孢子的菌絲，用50%乙醇浸潤(rùn)，用蒸餾水將菌絲浸泡，將菌絲分散開(kāi)，蓋上蓋玻片，低倍鏡觀察。

2.4 染色劑染色鏡檢

用接種環(huán)挑取菌絲于潔凈的載玻片上，與載玻片上的一滴蒸餾水充分混合，晾干后火焰烤干固定，加孔雀石綠染液染片5 min，再用復(fù)紅染液復(fù)染1 min，干燥后鏡檢觀察形態(tài)。

2.5 酵母菌基因組DNA提取及18S rRNA基因檢測(cè)

利用酵母菌基因組提取試劑盒提取點(diǎn)滴復(fù)膜酵母菌的DNA，提取過(guò)程中注意酵母菌細(xì)胞壁的破碎，DNA產(chǎn)物保存于-20 ℃。設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增體系為：DNA 模板 5 μL，10×buffer 2.5 μL，MgCl21 μL，dNTP（2.5 mmol/L）1 μL，上、下游引物各 2 μL，0.5 μL，用 ddH2O 補(bǔ)體系至 25 μL。PCR 擴(kuò)增程序：94 ℃ 4 min；94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，共30個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。以1%瓊脂糖核酸凝膠電泳檢測(cè) PCR 產(chǎn)物[8]。

2.6 點(diǎn)滴腹膜酵母菌犬的致病性試驗(yàn)

用沙堡羅葡萄糖液體培養(yǎng)基搖取菌液，并用細(xì)胞計(jì)數(shù)板按下式計(jì)數(shù)細(xì)胞懸液的密度：細(xì)胞密度＝（4個(gè)大格細(xì)胞總數(shù)/4）×104個(gè)/mL。濃度達(dá)到109時(shí)，在每只犬飼料中混合10 mL菌液飼喂4只，另外2只作為空白對(duì)照飼喂等量的生理鹽水[9]。試驗(yàn)開(kāi)始后每天采集糞便，稀釋后鏡下觀察點(diǎn)滴復(fù)膜酵母菌是否存在，以及粗略估計(jì)存在量，并且持續(xù)觀察犬糞便狀況并檢查糞便中點(diǎn)滴復(fù)膜酵母菌孢子的數(shù)量。同時(shí)觀察實(shí)驗(yàn)過(guò)程中犬有無(wú)異常現(xiàn)象，如精神不振、食欲下降等，觀察糞便有無(wú)稀便、水樣便、血樣便等情況。

3 結(jié)果與分析

3.1 樣本采集及鏡檢

對(duì)天津市3個(gè)大型警犬基地的糞便采集及初步鏡檢，結(jié)果見(jiàn)表1、圖1。

表1 糞便樣本采集及點(diǎn)滴復(fù)膜酵母菌帶菌情況

由表1可看出，天津市警犬基地一點(diǎn)滴復(fù)膜酵母菌檢出率較高，達(dá)到15.77%，大多數(shù)警犬都伴有腹瀉，其他兩個(gè)警犬基地未檢出點(diǎn)滴復(fù)膜酵母菌。

圖1 糞便樣本鏡檢結(jié)果（40×）

注：A、B均為點(diǎn)滴復(fù)膜酵母陽(yáng)性糞便涂片觀察結(jié)果

3.2 沙堡羅葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)

對(duì)糞便初步鏡檢點(diǎn)滴復(fù)膜酵母陽(yáng)性的糞便樣本劃線培養(yǎng)于沙堡羅葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，培養(yǎng)結(jié)果如圖2。

圖2 沙堡羅葡萄糖培養(yǎng)基培養(yǎng)結(jié)果

注：A為培養(yǎng)2 d結(jié)果；B為培養(yǎng)3 d結(jié)果；C為培養(yǎng)4 d結(jié)果

3.3 水浸片鏡檢

從沙堡羅葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上挑取真菌菌絲進(jìn)行水浸片鏡檢，結(jié)果如圖3。

圖3 水浸片鏡檢結(jié)果（40×）

注：A、B分別為點(diǎn)滴復(fù)膜酵母菌絲水浸片鏡檢結(jié)果

3.4 染色劑染色鏡檢

用孔雀石綠染液-復(fù)紅染液對(duì)點(diǎn)滴復(fù)膜酵母菌進(jìn)行染色，在顯微鏡下可觀察到長(zhǎng)柱狀細(xì)胞連接成的菌絲、突出的呈球狀的紫紅色孢子囊以及孢囊孢子，說(shuō)明該酵母菌為出芽生殖性酵母菌，染色結(jié)果如圖4。

圖4 孔雀石綠-復(fù)紅染色結(jié)果（40×）

注：A、B均為點(diǎn)滴復(fù)膜酵母菌染色結(jié)果

3.5 酵母基因組DNA提取及18S rRNA基因檢測(cè)

用提取出的酵母菌DNA產(chǎn)物進(jìn)行18S rRNA基因檢測(cè)，得到大約400 bp條帶，與預(yù)期目的條帶大小相符。電泳結(jié)果如圖5。

圖5 18S rRNA基因電泳結(jié)果

注：M為DL-2000 Marker；1為陰性對(duì)照；2為18S rRNA基因目的條帶（400 bp）

3.6 犬致病性試驗(yàn)

通過(guò)連續(xù)給4只試驗(yàn)犬飼喂點(diǎn)滴復(fù)膜酵母菌，一周后1只試驗(yàn)犬精神萎靡、飲食下降、被毛蓬亂，并開(kāi)始便血；間隔2 d后另1只試驗(yàn)犬腹瀉伴紅褐色血液。每天對(duì)2只便血犬糞便分別進(jìn)行鏡檢，發(fā)現(xiàn)大量紅細(xì)胞及點(diǎn)滴復(fù)膜酵母菌、淀粉顆粒及疑似脂肪滴。鏡檢發(fā)現(xiàn)點(diǎn)滴復(fù)膜酵母菌及疑似酵母菌的孢子（圖6）。其他2只試驗(yàn)犬，除有輕微精神不振外，無(wú)其他明顯癥狀，對(duì)其糞便鏡檢觀察無(wú)點(diǎn)滴復(fù)膜酵母菌存在。

圖6 糞便鏡檢圖片（40×）

注：A、B、C、D均為點(diǎn)滴復(fù)膜酵母菌陽(yáng)性糞便涂片鏡檢結(jié)果

4 討論

通過(guò)對(duì)天津市3個(gè)大型警犬基地分批次采集的約222份糞便樣本中點(diǎn)滴復(fù)膜酵母菌進(jìn)行鏡檢、分離培養(yǎng)、染色鑒定、酵母菌基因組提取及18S rRNA基因鑒定，并對(duì)分離的菌株進(jìn)行犬致病性研究調(diào)查，結(jié)果只在天津市警犬基地一發(fā)現(xiàn)點(diǎn)滴復(fù)膜酵母菌陽(yáng)性檢出率較高，約15.77%，并伴有不同程度的慢性腹瀉，原因可能是天津市警犬基地一的病犬年齡均為6歲以上，屬于老齡犬，而另兩個(gè)警犬基地的警犬都為青壯犬；在警犬基地一對(duì)病犬的親系進(jìn)行調(diào)查，并未檢出點(diǎn)滴復(fù)膜酵母菌，說(shuō)明該酵母菌可能為機(jī)會(huì)性致病菌。

犬腹瀉性疾病的常見(jiàn)致病菌為大腸桿菌、沙門氏菌、耶爾森菌、變形桿菌等[9]，點(diǎn)滴復(fù)膜酵母菌是否會(huì)致犬腹瀉并無(wú)確切論證，但其作為兔腸道正常菌且無(wú)致病性已被石團(tuán)員等人驗(yàn)證[10]。本試驗(yàn)進(jìn)行點(diǎn)滴復(fù)膜酵母菌犬的致病性試驗(yàn)，結(jié)果有兩例犬出現(xiàn)腹瀉及便血癥狀，對(duì)其鏡檢發(fā)現(xiàn)點(diǎn)滴復(fù)膜酵母菌及疑似酵母菌孢子，其他試驗(yàn)犬未出現(xiàn)腹瀉癥狀及鏡檢未見(jiàn)點(diǎn)滴復(fù)膜酵母菌。進(jìn)一步研究應(yīng)增加試驗(yàn)犬的數(shù)量，對(duì)點(diǎn)滴復(fù)膜酵母菌的致病性進(jìn)行研究。

通過(guò)對(duì)本次檢出的點(diǎn)滴復(fù)膜酵母菌進(jìn)行染色鏡檢，確定該酵母菌為出芽生殖性酵母菌。目前，臨床對(duì)于鏡檢點(diǎn)滴復(fù)膜酵母菌的腹瀉及便血犬，應(yīng)及時(shí)給予伊曲康唑等治療。本研究的警犬基地一給予抗真菌藥物的治療后，病犬的慢性腹瀉及便血癥狀消失。該菌雖被認(rèn)為是機(jī)會(huì)致病菌，但不能忽視其致病性，由該酵母菌引起的腹瀉通常伴有便血的特點(diǎn)，容易與其他病混淆，造成誤診，耽誤病情。通過(guò)本次對(duì)天津市警犬糞便樣本檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)點(diǎn)滴復(fù)膜酵母菌大量存在于犬的腸道，并有機(jī)會(huì)成為致病菌，本試驗(yàn)為點(diǎn)滴復(fù)膜酵母菌的致病性研究提供了參考依據(jù)。

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責(zé)任編輯：張愛(ài)婷

The epidemiological investigation and pathogenicity study onof police dogs inTianjin area

HAN Yu-xi1, JIANG Xuan1,GE Xiu-guo1, AN Xiao-kang1, ZHU Zi-da1, ZHAO Rui-li1,Corresponding Author, MA Ji-fei1, LI Yue2,WANG Cong1, XU Liang-lin1

（1. College of Animal Science and Veterinary Medicine, Tianjin Agricultural University, Tianjin 300384, China; 2. Animal Hospital Affiliated to Tianjin Agricultural University, Tianjin 300384, China）

To study the molecular epidemiology ofand its pathogenicity to dog intestine, 222 fecal samples were collected from three large police dogs bases in Tianjin area. Microscope examination, separated culture, dyeing identification, yeast genome extraction and 18S rRNA gene identification ofin the fecal samples were carried out, and the isolated strains were studied for the pathogenicity of the dogs. Results showed that there were 35positive samples from the police dog base in Xiqing, and the positive rate was about 15.77%. The proliferation mode of the yeast was identified as germ producing yeast by dyeing. The target band was amplified by 18S rRNA gene to get about 400 bp, and 6 experimental dogs were studied for the pathogenicity. The symptoms of diarrhea and stool were found in two dogs. By fecal microscopic examination droppings of yeast or yeast spore were found. Therefore, themay be as an opportunistic pathogenic bacteria, which can cause intestinal infection under certain conditions in dogs.

police dog;; epidemiology; pathogenicity

1008-5394（2018）04-0044-04

10.19640/j.cnki.jtau.2018.04.010

S852.611

A

2018-06-03

天津市大學(xué)生創(chuàng)新訓(xùn)練項(xiàng)目（201610061004）；天津市高校“中青年骨干創(chuàng)新人才培養(yǎng)計(jì)劃”項(xiàng)目（無(wú)編號(hào)）；天津市“131”創(chuàng)新型人才資助項(xiàng)目（無(wú)編號(hào)）；天津農(nóng)學(xué)院附屬動(dòng)物醫(yī)院關(guān)鍵技術(shù)集成與學(xué)生綜合能力提升（ZH004901）；天津市生豬產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)-豬細(xì)菌病崗位項(xiàng)目（ITTPRS2017004）

韓雨希（1996-），女，本科在讀，研究方向：小動(dòng)物醫(yī)學(xué)。E-mail：1027397853@qq.com。

趙瑞利（1979-），女，副教授，博士，研究方向：分子病原細(xì)菌學(xué)。E-mail：zhaoruili1109@126.com。