徐姿艷, 潘靜嫻, 錢忠英, 崔麗潔

(上海師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院 植物種質(zhì)資源開發(fā)協(xié)同創(chuàng)新中心,上海 200234)

喜樹(CamptothecaacuminataDecne)是亞熱帶珙桐科(Nyssaceae)喜樹屬(Camptotheca)多年生落葉闊葉樹,是中國特有種[1].喜樹的化學(xué)成分復(fù)雜,Wall等[2]在1966年從喜樹中分離獲得了一種色氨酸-萜烯類生物堿,將其命名為喜樹堿(Camptothecin,CPT),研究結(jié)果顯示喜樹堿在體外對Hela和L1210等細胞會顯示出較強的抗腫瘤活性,從而引起人們的關(guān)注[3].

喜樹堿是目前已發(fā)現(xiàn)的唯一通過抑制拓撲異構(gòu)酶Ⅰ而發(fā)揮細胞毒性的天然植物成分,對卵巢癌、結(jié)腸直腸癌及白血病等多種惡性腫瘤都有較好療效.世界衛(wèi)生組織將喜樹堿及其衍生物作為主要的抗癌藥物進行開發(fā)[4],現(xiàn)已有兩種喜樹堿衍生物——拓樸替康(Topotecan)和依諾替康(Irinotecan)在美國食品和藥物管理局(FDA)獲準用于臨床;20世紀70年代中國科學(xué)家自主研發(fā)的羥基喜樹堿療效可靠,備受關(guān)注[5].目前,全球市場對喜樹堿類的藥物需求量大,其原材料主要源自天然喜樹,受資源少和含量低的限制,喜樹堿類抗癌藥物的價格昂貴,因此尋找有效方法解決此類難題顯得至關(guān)重要.

1 優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)喜樹的獲得

植物次生代謝產(chǎn)物的合成和積累與遺傳有關(guān),受基因調(diào)控,也受樹木發(fā)育期和環(huán)境影響,且在同株植物的不同組織器官中的含量也不同.分析產(chǎn)地、樹齡及不同器官中的靶次生代謝物含量,采取適當策略獲得喜樹堿產(chǎn)品,可以達到較好效果.

1.1 喜樹道地性和器官對喜樹堿含量的影響

喜樹分布于中國長江流域及西南各省[1].王自芬等[6]對來自15個不同產(chǎn)地的喜樹果實進行檢測,發(fā)現(xiàn)不同地理種群的喜樹中的喜樹堿含量存在顯著差異.其中,福建產(chǎn)的喜樹果實中喜樹堿質(zhì)量分數(shù)最高,為0.1902%;貴州產(chǎn)的喜樹果實中喜樹堿質(zhì)量分數(shù)最低,為0.0853%,兩者差異極顯著(P<0.01).王玲麗等[7]通過研究不同種源喜樹幼枝發(fā)現(xiàn),四川成都所產(chǎn)的喜樹幼枝中喜樹堿質(zhì)量分數(shù)最高,為0.163%;安徽合肥所產(chǎn)的喜樹幼枝中喜樹堿質(zhì)量分數(shù)最低,僅為0.034%,兩者差異極顯著(P<0.01).

喜樹各器官中均含有喜樹堿及其衍生物,但不同器官及同一器官不同發(fā)育時期中喜樹堿的含量差異非常大[7].研究表明,越幼嫩的組織中喜樹堿質(zhì)量分數(shù)越高,如幼葉(0.185%)、種子(0.172%)和幼枝(0.159%)[8].其中幼枝因其喜樹堿含量高、產(chǎn)量大以及可重復(fù)采收等優(yōu)點,可作為喜樹堿生產(chǎn)的原料[9].隨著喜樹的生長發(fā)育,喜樹堿的積累也會發(fā)生變化.LIU等[10]通過研究發(fā)現(xiàn),兩年生幼葉中喜樹堿的含量是三年生的兩倍,是四年生的16倍.王玲麗等[7]發(fā)現(xiàn)兩年生幼枝的喜樹堿含量比一年生高,并認為一年生喜樹組織非常幼嫩,主要進行初生代謝,其生物量及次生代謝活動都比較低,而兩年生喜樹生物量大,次生代謝旺盛,生物堿積累也較多.因此生長2～3 a左右的喜樹幼枝可以為喜樹堿生產(chǎn)提供較豐富的原料.

1.2 含喜樹堿的物種

喜樹種植分布范圍窄,群體數(shù)量少,生長緩慢,導(dǎo)致喜樹堿的產(chǎn)量偏低.因此,尋找可替代植物,可以解決喜樹堿來源單一、喜樹資源匱乏等問題.目前,已經(jīng)從夾竹桃科的海木狗牙花(Ervatamiaheyneana(Wall.) T.Cooke)茶茱萸科的臭味假柴龍樹(Nothapodytesfoetida(Wight) Sleum)以及茜草科的短小蛇根草(OphiorrhizapumilaChamp.ex Benth)等至少16種植物中相繼檢測到喜樹堿及其類似物[11-12].DIGHE等[13]分析了來自印度Dapoli地區(qū)的海木狗牙花(Ervatamiaheyneana)莖中喜樹堿的質(zhì)量分數(shù)高達0.0413 mg·g-1.LOKESH等[14]檢測發(fā)現(xiàn)印度的臭味假柴龍樹(Nothapodytesfoetida)和蛇根草(OphiorizzaMungos)也能合成喜樹堿,但其含量存在明顯的地域差異.在臭味假柴龍樹中,Amboli地區(qū)的喜樹堿平均質(zhì)量分數(shù)為0.084%,Sagar地區(qū)的喜樹堿平均質(zhì)量分數(shù)為0.018%,Kodchadry地區(qū)產(chǎn)的喜樹堿平均質(zhì)量分數(shù)為0.035%;在蛇根草中,來自Kemmanagundi地區(qū)的喜樹堿平均質(zhì)量分數(shù)為0.036%,來自Karod地區(qū)的喜樹堿平均質(zhì)量分數(shù)為0.010%.從已有研究結(jié)果來看,在這些植物中,臭味假柴龍樹的喜樹堿含量較高,但是仍遠低于喜樹幼嫩組織中喜樹堿的含量.目前尚沒有尋找到一種合適的植物可以完全替代喜樹,因此還需要結(jié)合其他理化或生物技術(shù)手段,對這些植物資源進行改良,為喜樹堿生產(chǎn)提供更好的來源.

2 理化因子對喜樹堿含量的影響

植物的次生代謝產(chǎn)物積累是長期進化過程中與各種因素相互作用的結(jié)果,其對提高植物自身保護和生存競爭能力,及對環(huán)境脅迫的適應(yīng)能力具有重要作用[15],因此次生代謝產(chǎn)物的積累受環(huán)境影響很大.通過改變生長環(huán)境的理化條件可以改變相應(yīng)次生代謝產(chǎn)物的積累.

2.1 物理因素對喜樹堿積累的影響

LIU等[16-17]研究了暗培養(yǎng)及干旱脅迫對喜樹幼苗中喜樹堿含量的影響,結(jié)果表明:在暗培養(yǎng)下,根部的喜樹堿逐漸減少,而莖部的喜樹堿含量則顯著升高;在干旱脅迫下,葉子中的喜樹堿積累明顯增多,說明喜樹堿的合成受干旱脅迫的誘導(dǎo).此外,適合的溫度條件對喜樹堿的生物合成與積累也是有利的,汪貴斌等[18]對喜樹進行處理后發(fā)現(xiàn)喜樹在晝/夜溫度為35 ℃/30 ℃以及40 ℃/35 ℃的條件下生長量較高,且當晝/夜溫度為35 ℃/30 ℃時葉片中喜樹堿質(zhì)量分數(shù)最高,為0.209 mg·g-1.王玲麗等[19]運用UV-B(ultraviolet-B)輻射梯度時間處理喜樹,發(fā)現(xiàn)喜樹堿含量隨著每天UV-B輻射時間的延長呈現(xiàn)增長趨勢,且經(jīng)8 h輻射處理的喜樹喜樹堿質(zhì)量分數(shù)最高,幼葉中的增至0.230%,莖中的為0.064%,根中的增至0.065%.這都說明了適當?shù)母邷亍V-B輻射增強等外界物理條件的影響都會促進喜樹堿的積累[18-19].

2.2 化學(xué)因子對喜樹堿積累的影響

植物細胞培養(yǎng)法生產(chǎn)喜樹堿被認為是很有希望的替代途徑.研究表明,在培養(yǎng)基中添加誘導(dǎo)因子可使喜樹愈傷組織中喜樹堿的含量增加.顧青等[20-21]在培養(yǎng)基中添加CuCl2導(dǎo)致愈傷組織中的喜樹堿含量比未誘導(dǎo)前增加了約30倍,添加L-色氨酸可使喜樹堿含量增加3倍.董妍玲等[22]發(fā)現(xiàn)殼聚糖誘導(dǎo)子的刺激能使喜樹懸浮培養(yǎng)細胞中喜樹堿的生物合成含量提高 6.18倍.有研究表明酵母粉、茉莉酸以及茉莉酸甲酯、真菌誘導(dǎo)子和抗褐變劑等的添加也可顯著增加喜樹愈傷組織中喜樹堿的含量[23-24].

目前關(guān)于誘導(dǎo)子在體外培養(yǎng)的植物細胞中具體的作用機制尚未形成完善的理論體系,但已有許多研究發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)子可能是通過影響相關(guān)酶,最終影響次生代謝產(chǎn)物的合成.酶在植物次生代謝途徑中有著重要的作用,利用基因工程技術(shù)影響相關(guān)酶的活動,可以從根本上解決喜樹堿等次生代謝產(chǎn)物產(chǎn)量低的問題.

3 基因工程手段提高喜樹堿含量

植物次生代謝的基因工程,是利用基因工程技術(shù)對植物次生代謝途徑的遺傳特性進行改造,進而改變植物次生代謝產(chǎn)物的品質(zhì)、產(chǎn)率的技術(shù),它主要包括關(guān)鍵酶基因工程及其轉(zhuǎn)錄因子或調(diào)節(jié)基因兩個方面[25].

3.1 喜樹堿生物合成途徑及關(guān)鍵酶

喜樹堿在結(jié)構(gòu)上屬于喹啉生物堿,其生物合成來自單萜吲哚生物堿(MIAs)[26].萜類吲哚生物堿具有普遍的前體物質(zhì)異胡豆苷[27].如果以異胡豆苷的生成為分界線,可以將MIAs合成途徑分為上游途徑和下游途徑.目前,以長春堿為代表的MIAs合成途徑的上游途徑已經(jīng)有了研究結(jié)果,該途徑主要包括甲羥戊酸(MVA)途徑、磷酸甲基赤蘚醇(MEP)途徑、裂環(huán)烯醚萜(secoiridoid)途徑和莽草酸(shikimate)途徑.MVA、MEP和裂環(huán)烯醚萜途徑提供MIAs合成前體裂環(huán)馬錢子苷類似物,這些途徑中的關(guān)鍵限速酶為香葉醇-10-脫氫酶(G10H).莽草酸途徑提供合成前體色胺(tryptamine),該途徑中的關(guān)鍵限速酶為色氨酸脫羧酶(TDC).而色胺和裂環(huán)馬錢子苷在異胡豆苷合成酶(STR)作用下合成異胡豆苷.而從異胡豆苷之后開始,不同MIAs生物合成開始分化.異胡豆苷經(jīng)過幾步酶促反應(yīng)后生成包括喜樹堿、長春堿等在內(nèi)的各種萜類吲哚生物堿[11,28].早期的研究認為喜樹堿來自于異胡豆苷[27,29-30],但最新研究報道稱在喜樹中并未檢測到裂環(huán)馬錢子苷和異胡豆苷[27],由此推測喜樹堿合成和長春堿合成的上游途徑不完全相同.目前研究認為喜樹在裂環(huán)烯醚萜途徑催化過程中,產(chǎn)生裂環(huán)馬錢子苷類似物——裂環(huán)馬錢子酸,為喜樹堿的合成提供了前體(圖1).喜樹堿是以色胺和裂環(huán)馬錢子酸為前體在異胡豆苷酸合成酶(STRAS)的作用下合成異胡豆苷酸[31],之前曾有研究報道稱在短小蛇根草中也存在異胡豆苷酸[29],因此異胡豆苷酸才可能是喜樹堿合成過程中的核心中間體[28].異胡豆苷酸經(jīng)過一系列脫水、氧化及還原反應(yīng)形成喜樹堿,部分喜樹堿在細胞色素P450單加氧酶催化下合成10-羥基喜樹堿,繼續(xù)在10-羥基喜樹堿O-甲基轉(zhuǎn)移酶(Ca10OMT)催化下合成10-甲氧基喜樹堿[32].目前關(guān)于喜樹堿合成途徑的推測僅建立在代謝物檢測數(shù)據(jù)基礎(chǔ)上,后續(xù)尚需要進行體外生物催化以及植物體內(nèi)轉(zhuǎn)基因驗證,對該生物合成途徑作進一步的確認.

圖1 喜樹堿合成途徑[27-28,31].Camptothecin synthesis pathway TDC:色氨酸脫羧酶;IPI:異戊烯基二磷酸異構(gòu)酶;GPPS:香葉基二磷酸合酶:G8O:香葉醇-8-脫氫酶;8-HGO:8-羥基香葉醇氧化還原酶;CYC1:環(huán)烯醚萜合酶/環(huán)化酶;7-DLS:7-脫氧基酸合成酶;7-DLGT:7-脫氧葡萄糖酸葡糖基轉(zhuǎn)移酶;7-DLH:7-脫氧鳥嘌呤羥化酶;SLAS:裂環(huán)馬錢子酸合成酶;STRAS:異胡豆苷酸合成酶;DH:脫水;RD:還原;P450:細胞色素P450單加氧酶;Ca10OMT:喜樹(Camptotheca acuminata)10-羥基喜樹堿O-甲基轉(zhuǎn)移酶.TDC:tryptoophan decarboxylase;IPI:isopentenyl diphosphate isomerase;GPPS:geranyl diphosphate synthase;G8O:geraniol-8-dehydrogenase;8-HGO:8-hydroxygeraniol oxidoreductase;CYC1:iridoid synthase/cyclase;7-DLS:7-deoxyloganetic acid synthase;7-DLGT:7-deoxyloganetic acid glucosyltransferase;7-DLH:7-deoxyloganic acid hydroxylase;SLAS:secologanic acid synthase;STRAS:strictosidinic acid synthase;DH:dehydration;RD:reduction;P450:cytochrome P450 monooxygenase;Ca10OMT:Camptotheca acuminate10-hydroxycamptothecin O-methyltransferase

3.2 喜樹堿合成途徑關(guān)鍵酶改造

3.2.1 喜 樹

根據(jù)已知的喜樹堿合成途徑,可以通過改變關(guān)鍵酶的表達來影響喜樹堿的生物合成.沈少華[32]利用葉盤法將細胞凋亡因子Bax基因轉(zhuǎn)入到喜樹中,發(fā)現(xiàn)在轉(zhuǎn)基因愈傷中喜樹堿以及10-羥基喜樹堿的含量分別提高了4.4倍和2.1倍,表明雖然Bax會促進細胞凋亡,但是同時也激發(fā)了植物的次生代謝合成,最終導(dǎo)致次生代謝產(chǎn)物的積累;測定了獲得TDC過表達轉(zhuǎn)基因的細胞株中的喜樹堿含量,發(fā)現(xiàn)TDC可以在一定程度上提高喜樹堿的含量.閆通帥[33]通過病毒誘導(dǎo)的基因沉默(VIGS)技術(shù)誘導(dǎo)喜樹內(nèi)源位于上合成途徑的G10H、HGO、TDC1和STR的沉默.基因沉默后,喜樹堿含量有一定程度的下降,降幅為30%～40%.SADRE等[28]利用RNA干擾技術(shù),對喜樹體內(nèi)的TDC1和CYC1基因的表達進行了抑制,結(jié)果發(fā)現(xiàn)基因抑制株系中的喜樹堿含量大幅度下降.當TDC1在喜樹中表達水平下降到對照株系的3%時,喜樹堿含量只有對照株系的1/1000.此外還可以通過轉(zhuǎn)入外源關(guān)鍵酶基因來影響喜樹堿的合成.開國銀等[34]將來自長春花的STR和G10H基因轉(zhuǎn)入喜樹的毛狀根,將喜樹堿含量提高了3.8倍.從目前的研究報道來看,利用吲哚生物堿合成途徑中關(guān)鍵酶基因?qū)ο矘溥M行改造可以有效提高喜樹堿含量.喜樹作為木本植物,其遺傳轉(zhuǎn)化周期長且難度大,且無法獲得足夠的生物量進行后續(xù)研究,因此目前喜樹基因工程研究停滯不前,急需開發(fā)含喜樹堿的其他資源植物,來進行深入和有效的生物工程研究.

3.2.2 蛇根草

蛇根草喜樹堿含量比喜樹等其他植物略低[35-36],但作為草本植物,其具有易獲得[37-38]和便于進行基因技術(shù)操作的優(yōu)勢[39-40].對蛇根草中喜樹堿合成的研究起步較晚,相關(guān)報道較少.目前僅CUI等[41]在短小蛇根草毛狀根中同時過表達CrG10H和CrSTR基因,結(jié)果發(fā)現(xiàn)此過表達毛狀根的喜樹堿產(chǎn)量平均提高了56%.而ASANO等[42]通過RNA干擾技術(shù),抑制了短小蛇根草毛狀根內(nèi)源TDC和裂環(huán)馬錢子苷合成酶(SLS)的表達,導(dǎo)致喜樹堿和一些中間產(chǎn)物含量明顯降低.

與喜樹堿合成途徑研究相比,對長春花中的萜類吲哚生物堿合成途徑的研究結(jié)果更顯著和深入,不同酶對萜類吲哚生物堿合成的影響不同[43-46].可以預(yù)期,隨著對喜樹堿合成途徑以及關(guān)鍵酶基因序列不斷深入的研究,利用基因技術(shù)對短小蛇根草中其他關(guān)鍵酶進行改造,將為喜樹堿生產(chǎn)提供高質(zhì)量的植物品種資源.

3.3 喜樹堿合成相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子研究

轉(zhuǎn)錄因子是能夠識別并結(jié)合啟動子區(qū)的元件達到調(diào)控基因表達作用的一類蛋白質(zhì)分子.利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子,通常可以同時調(diào)節(jié)多個關(guān)鍵酶基因的轉(zhuǎn)錄,從而改變植物的表達性狀,影響植物中次生代謝產(chǎn)物的合成[47].到目前為止,已經(jīng)發(fā)現(xiàn)bHLH、MYB、WD40等轉(zhuǎn)錄因子參與調(diào)控黃酮類代謝;長春花中有CrORCAs、CrMYCs、CrZCTs、CrWRKYs等轉(zhuǎn)錄因子參與生物堿的次生代謝;AP2/ERF類、WRKY、bZIP以及鋅指類轉(zhuǎn)錄因子參與調(diào)控萜類合成[48-49].目前對于參與喜樹堿生物合成的轉(zhuǎn)錄因子的研究很少.

SIRIKANTARAM A S等[11]在蛇根草毛狀根中過表達OpMYB1.OpMYB1作為一個負調(diào)節(jié)因子,會降低OpTDC的表達,導(dǎo)致喜樹堿產(chǎn)量降低.此外還可以通過轉(zhuǎn)入外源轉(zhuǎn)錄因子來影響喜樹堿的合成,比如來自長春花的轉(zhuǎn)錄因子ORCA3,是一種響應(yīng)于茉莉酮酸的APETALA2(AP2)結(jié)構(gòu)域的基因,能夠增強萜類吲哚生物堿的生物合成途徑中部分關(guān)鍵基因的轉(zhuǎn)錄.由于長春花和喜樹具有類似的MIAs生物合成途徑,所以NI等[50]將ORCA3基因引入到喜樹毛狀根中,并將喜樹堿的產(chǎn)量提高了1.5倍.隨著喜樹堿合成途徑的進一步解密,和對轉(zhuǎn)錄調(diào)控研究的深入,利用轉(zhuǎn)錄因子實現(xiàn)對喜樹堿合成的調(diào)控,選育優(yōu)良的轉(zhuǎn)基因株系替代野生資源生產(chǎn)喜樹堿,將具有廣闊的應(yīng)用前景.

4 合成喜樹堿其他策略

癌癥發(fā)病率越來越高,喜樹堿類抗癌藥物的需求也在逐年增長,供不應(yīng)求的矛盾日益突出.除了擴大藥源以及提高藥源中喜樹堿的含量外,利用化學(xué)合成、內(nèi)生真菌,生物反應(yīng)器等的研究都為提高喜樹堿的產(chǎn)量提供可能.1975年美國哈佛大學(xué)Corey 研究組[51]首次報道了手性全合成喜樹堿的方法,此后EJIMA[52]等,COMINS[53]等,FORTUNAK等[54]報道了更加簡單快速的喜樹堿合成方法.此外喜樹堿衍生物,如:10-羥基喜樹堿,CPT-ll,9-硝基喜樹堿和9-氨基喜樹堿的化學(xué)合成方法也取得了巨大進展.但是由于途徑長、成本高、產(chǎn)率低,這些化學(xué)合成途徑均未實現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化,喜樹堿類藥物生產(chǎn)仍然嚴重依賴植物原材料.喜樹內(nèi)生真菌的研究也取得了進展.陳賢興等[55]首次從喜樹種子中分離得到1株產(chǎn)喜樹堿內(nèi)生真菌.KUSARI 等[56]從喜樹樹皮中分離到1株Fusariumsolani(鐮刀菌屬),并在該菌株中同時檢測到了喜樹堿、10-羥基喜樹堿和9-甲氧基喜樹堿.盛貽林等[57]從喜樹的果實、樹皮、葉片中分離篩選得到1株能夠產(chǎn)生喜樹堿的菌株(JH001),喜樹堿產(chǎn)量達到227 μg·L-1.此外,研究人員在紫龍樹(Apodytesdimidiata)、青脆枝(Nothapodytesnimmoniana)、大葉鹿角藤(Chonemorphafragrans)中也分離得到了產(chǎn)喜樹堿的內(nèi)生真菌.但是目前關(guān)于這些內(nèi)生真菌的報道僅限于實驗室研究,要真正應(yīng)用于喜樹堿生產(chǎn)尚有許多技術(shù)問題需要解決.

5 結(jié) 語

隨著癌癥發(fā)病率越來越高,喜樹堿類抗癌藥物的需求也在逐年增長,臨床供應(yīng)是急待解決的關(guān)鍵問題.利用現(xiàn)代生物技術(shù)提高喜樹堿產(chǎn)量,具有十分廣泛的應(yīng)用前景.自然界的植物資源豐富,可以擴大植物資源研究調(diào)查,繼續(xù)尋找潛在的喜樹堿生物資源.喜樹堿等次生代謝產(chǎn)物對外界環(huán)境的改變比較敏感,研究不同環(huán)境因素及誘導(dǎo)子,可以借助外界因子對次生代謝產(chǎn)物的影響,提高目的產(chǎn)物的積累.喜樹堿的生物合成途徑的解析,可為發(fā)展相關(guān)基因工程,培育優(yōu)良的植物品種作為替代產(chǎn)品提供基礎(chǔ).擴大篩選產(chǎn)喜樹堿及其類似物內(nèi)生真菌的植物范圍,篩選更穩(wěn)定和更高效的產(chǎn)喜樹堿菌株,可以大幅度降低喜樹堿合成成本.任何一方面的研究突破,都將會有效緩解目前市場上的喜樹堿的供需矛盾,造福癌癥患者.