王永強, 李英東, 郭正紅, 王全喜

(上海師范大學 生命科學學院 植物種質資源開發(fā)協(xié)同創(chuàng)新中心,上海 200234)

0 引 言

噴灑農藥可以防治設施蔬菜中的病蟲害,增加作物的產(chǎn)量,但是其殘留卻會破壞生態(tài)環(huán)境,影響人體健康,同時會影響土壤的品質,造成土壤板結,無法再進行種植,其主要原因是農藥會破壞土壤微生物群落結構.OMAR等[1]發(fā)現(xiàn)使用高劑量的溴苯腈后土壤中細菌、放線菌的數(shù)量會降低.ZHANG等[2]報道了施加不同劑量的氯嘧磺隆后,土壤中微生物群落結構出現(xiàn)顯著變化,常年使用該藥會嚴重降低土壤微生物總量,降低真菌與細菌間的比例,改變根際微生物群落結構.

蔬菜根際微生物是農田生態(tài)系統(tǒng)中重要的分解者,是連接地上和地下生態(tài)系統(tǒng)的橋梁[3],它們通過分解有機腐殖質,增加植物對礦物質元素的吸收和運轉,改善植物的營養(yǎng)狀況,增強植物的抗病能力,進而提高作物產(chǎn)量[4].同時根際微生物還可以反映土壤的質量,保持土壤微生物多樣性,對于農業(yè)生產(chǎn)具有重要的意義[5].鑒于此,人們開始關注熏蒸劑對土壤病原菌的防效和土壤微生物群落結構的影響,并發(fā)現(xiàn)了氯化鈷、二甲基二硫等化學物質可以作為熏蒸劑用于防治土壤病原菌[6].

臭氧(O3)是一種公認的廣譜、高效、環(huán)保殺蟲滅菌劑,目前已應用于水溶液消毒、空氣凈化、糧食儲藏[7]、果蔬保鮮[8]、設施農業(yè)植物病蟲害防治[9-11]等領域.KASURINEN等[12]研究發(fā)現(xiàn)臭氧對植物地下部分的影響比對地上部分的出現(xiàn)得早,生物量變化較明顯,并且臭氧使得地下部分出現(xiàn)了積累效應.YU等[13]報道了有關大氣中臭氧濃度的升高對土壤微生物的影響,但尚未有關于臭氧水直接對根際微生物群落結構影響的報道.

本文作者在不同溫度條件下,對比了噴灑相同劑量的清水、臭氧水和“百菌清”對土壤微生物群落結構的影響.同時通過基于序列間相似度的分類單元(OTUS)聚類分析,明確了臭氧能代替農藥并保護土壤微生物菌群的組成,特別是Actionbacteria放線菌等能參與分解有機物的菌屬,進而改善土壤結構.

1 材料與方法

1.1 實驗材料

75%(質量分數(shù))百菌清可濕性粉劑(達科寧);塑料花盆:高35 cm,口徑22 cm;臭氧發(fā)生器,本研究中臭氧氣體的獲取來自于臭氧發(fā)生器(北京山美水美環(huán)保科技有限公司,型號為CF-YG10),主要是通過高壓放電的方法獲取臭氧,產(chǎn)生臭氧的速率為10 g·h-1;噴壺等.

1.2 研究方案

表1 各處理組設計方案表

注:“√”代表處理對象

模擬大棚中的溫度,設置15,25和35 ℃三個溫度,從設施大棚中同一片區(qū)域內選取相同質量的土壤,利用低(質量)濃度(3 mg·L-1)、中濃度(6 mg·L-1)和高濃度(9 mg·L-1)的臭氧水,以百菌清農藥(用水按體積比1∶600稀釋)為實驗組,以清水為對照組.用臭氧水和清水每天噴灑土壤1次,共噴灑15 d;百菌清每隔5 d噴灑1次,共噴灑3次,每個花盆的噴灑劑量為50 mL.表1為各處理組的處理方案.

1.3 根際微生物群落總數(shù)測定

稱取10 g根際土壤,移至裝有90 mL無菌水的三角瓶中,在搖床中以150 r·min-1的轉速搖30 min,使細菌充分懸浮于水溶液中,用移液槍吸取1 mL上清液,加入已裝有9 mL 無菌水的試管中,按照稀釋分離程序制成不同生物量濃度的菌液(1×105CFU·mL-1和1×106CFU·mL-1);分別取 100 mL菌懸液涂布于Luria-Bertani培養(yǎng)基上,每種濃度做2個平行實驗,在37 ℃ 的培養(yǎng)箱中培養(yǎng),待菌落產(chǎn)生,按菌落形態(tài)和顏色特征歸類,統(tǒng)一編號,并記錄菌落數(shù)量,進行計算.計算公式為:

其中,N為樣品中菌落數(shù),CTOTOL為平板菌落數(shù)之和,n1為菌液中細菌的生物量濃度為1×105CFU·mL-1的平板數(shù),n2為菌液中細菌的生物量濃度為1×106CFU·mL-1的平板數(shù),d為較低的生物量濃度.

1.4 土壤的總DNA提取

為研究臭氧水和百菌清對土壤微生物群落多樣性的具體影響,分別從不同的實驗組和對照組中提取5 g土樣,溶解到無菌水中.并以孔徑為0.22 μm的微孔過濾器濾菌.用強力土壤DNA提取試劑盒(美國MoBio公司)按操作要求提取DNA.以1.2%(體積分數(shù))瓊脂糖檢驗所提取的DNA的濃度和純度.

1.5 各處理組中聚合酶鏈式反應(PCR)擴增和Illumina高通量測序

基于所有門類在常規(guī)和宏基因組研究中的高覆蓋率[14-16].用通用引物515 F (GTGCCAGCMGCCGCGGTAA) and 926 R (CCGTCAATTCMTTTRAGTTT)進行16s rDNA的序列擴增.此引物同樣用于16 s rRNA同源分析,以及Illumina平臺的5′端序列的兩步擴增子庫的建設.按照對懸序列的操作說明進行分析.在25 μL反應體系中加入1 μL DNA底物,1 μL物質的量濃度為250 μmol·L-1的三磷酸脫氧核苷酸(dNTPs),1 μL物質的量濃度為0.25 μmol·L-1的引物,1倍擴增緩沖液,0.5 U Phusion DNA聚合酶(New England Biolabs,USA),進行初次PCR.PCR循環(huán)參數(shù):94 ℃ 預變性 2 min;54 ℃退火 30 s,72 ℃延伸30 s,循環(huán)25次;72 ℃最終延伸5 min.用雙8條帶的NextEra XT指標試劑盒(Illumina Inc.,San Diego.CA,USA)進行復用.循環(huán)條件包括1次94 ℃、3 min,8次94 ℃、30 s,56 ℃、30 s,72 ℃、30 s,72 ℃、1 min,循環(huán),最終延伸5 min.在library pooling數(shù)據(jù)庫連接池分析之前,用DNA凝膠提取試劑盒(Axygen,China)純化PCR產(chǎn)物條帶,Qubit dsDNA HS (Life Technologies,Carlsbad,CA,USA)分析試劑盒進行核酸定量.通過微基生物技術公司(上海)在MiSeq平臺上用MiSeq v3試劑盒進行2×300 bp的雙端測序,并建立文庫.

1.6 生物信息學分析

原始序列被分在不同的實驗組,每個樣本的正反序列都生成一個FASTQ文件.利用QIIME軟件在MISeqf分析說明書的指導下對序列進行預處理.通過FASTA格式的文件將序列進行拼接,并過濾掉歧義片段和小于200 bp或大于600 bp的片段.剩余序列用 “unique.seqs”命令簡化組成一組獨特序列,在SILVA數(shù)據(jù)庫version 119[17]內比對.嵌合序列通過缺省參數(shù)在“chimera.uchime”命令下移除.預選序列在“classify.seqs”命令(Wang approach)下按80%置信區(qū)間進行分類.清除所有與真核生物、線粒體、葉綠體相似以及未知的序列.最終按照97%的一致性聚集成OTUS.通過“classify.otu”命令進行所用OTUS的聚類分析.覆蓋率計算公式為:

其中,nOTUS為OTUS出現(xiàn)次數(shù),N為總克隆分株數(shù).

本研究中數(shù)據(jù)預處理以及OTUS分析均在MOTHUR上進行.將不同對照組、實驗組中的優(yōu)勢菌群分離,按照由DNA序列數(shù)量得到的相對豐度進行物種分類,并標出未知序列.利用MOTHUR制作文氏圖顯示獨特和共有的OTUS.

2 結果與分析

2.1 各處理組土壤中微生物群落總數(shù)

表2為在不同溫度條件下清水、不同濃度的臭氧水和百菌清對土壤微生物群落總數(shù)的影響.由表2可知,在相同的溫度條件下,清水噴灑的對照組和臭氧水噴灑的實驗組中的土壤微生物群落總數(shù)都明顯大于噴灑農藥的實驗組,說明臭氧水較農藥對設施植物根際微生物群落多樣性的影響較小.在相同條件下,較低濃度的臭氧可能會導致較高的微生物群落總數(shù).本實驗中當溫度為25 ℃時,臭氧水的最適質量濃度為6 mg·L-1.值得關注的是,噴灑臭氧水和清水的微生物群落總數(shù)在不同的溫度下都顯示出了較顯著的差異,這表明溫度對微生物群落總數(shù)有較大調節(jié)作用.而噴灑百菌清的微生物群落總數(shù)在高溫條件下較高,原因可能是溫度的升高導致了百菌清成分的分解,使藥效降低.總的來看,當溫度為25 ℃時,百菌清較臭氧水會大大降低土壤中的微生物多樣性.陳展等[18]通過升高臭氧濃度檢測了臭氧對土壤微生物功能變化的影響,結果表明適當濃度的臭氧對土壤微生物的多樣性和豐富度沒有顯著影響.

表2 各組微生物群落總數(shù)測定結果 CFU·mL-1

2.2 各處理組土壤總DNA的提取及PCR擴增

圖1 不同處理組中的PCR產(chǎn)物.1～11分別代表在不同溫度條件下噴灑不同的溶液.1:15 ℃,清水;2:15 ℃,6 mg·L-1臭氧水;3:15 ℃,百菌清;4:25 ℃,清水;5:25 ℃,3 mg·L-1臭氧水;6:25 ℃,6 mg·L-1臭氧水;7:25 ℃,9 mg·L-1臭氧水;8:25 ℃,百菌清;9:35 ℃,清水;10:35 ℃,6 mg·L-1臭氧水;11:35 ℃,百菌清

對各處理組分別進行取樣,用孔徑為0.22 μm的微孔過濾器濾菌.用強力土壤DNA提取試劑盒(美國MoBio公司)按操作要求提取DNA并檢測其純度,共得到11組DNA.利用通用引物進行16s rRNA的序列擴增,結果如圖1所示.與Marker進行對比,各處理組均擴增出大小一致的條帶,可進行高通量測序并將測序后的結果進行分析.

2.3 微生物豐度

通過測序數(shù)據(jù),得到各組土壤中微生物的種類,數(shù)據(jù)處理時引入微生物豐度與香農指數(shù)來描述土壤中微生物群落特征.對比在不同溫度條件下噴灑純水和農藥的處理組可以發(fā)現(xiàn):相同溫度條件下,純水組的微生物豐度均大于農藥組的,純水的處理保護了更多微生物不受到損傷,如圖2(a)所示.由圖2(b)可知,不同溫度下質量濃度為6 mg·L-1的臭氧水對微生物豐度的影響也十分明顯.實驗中,大多微生物豐度會隨著溫度的上升而上升,而當溫度為25 ℃時,實驗組的微生物豐度會隨著臭氧濃度的上升而減小.其原因可能為:臭氧水處理土壤時,當溫度升高,臭氧水隨著溫度的升高而揮發(fā)較快,微生物多樣性可能增加.圖2(c)為將不同溫度下的測序數(shù)據(jù)按處理方法進行的擬合分析.由圖2(c)可知,農藥的使用極大影響了土壤中的微生物豐度,使得土壤的種植肥力受到了影響,與之相比,臭氧水和純水處理組都有較好的微生物豐度保存能力,進而保存了土壤的種植肥力.在不同的實驗組中,盡管溫度和臭氧水濃度可能會引起香農指數(shù)的波動,但相較于其他實驗處理方法,臭氧水在提高微生物多樣性方面仍更勝一籌.通過測序,也為在不同溫度下確定最合適的臭氧水濃度以代替農藥提供了有力的依據(jù).

圖2 土壤微生物豐度的香農曲線.(a) 不同溫度下,水和農藥中微生物豐度的比較;(b) 臭氧水在不同溫度下對微生物豐度的影響;(c) 比較3個處理組中微生物豐度的變化

2.4 菌種熱圖分析

通過篩選測序數(shù)據(jù)中的菌種能夠鑒別到種數(shù)前50的菌種,將其繪制成熱圖分析圖(圖3),顏色深淺對應了二維矩陣中各類菌株的含量:紅色代表菌株含量多,綠色代表菌株的含量較少.分析圖反映出各實驗組中的差異菌株,明顯看出X8農藥實驗組中具有與其他實驗組差異較大的菌種,表明百菌清噴灑后造成土壤中微生物群落的改變,破壞了土壤中的微生物結構,通過查找文獻能確定百菌清對這些菌種的降解力.比較了臭氧水實驗組和農藥實驗組在菌種含量上的差別,確定了這些含量有差異的菌種對植物生長的促進作用,進一步證明了臭氧水噴灑優(yōu)于農藥噴灑.并將熱圖與OTUS聚類分析圖對應,以表示不同的UUTs含量.由圖3可知,X8的微生物群落與其他實驗組明顯不同.X8實驗組即25 ℃下的百菌清實驗組,此溫度條件下農藥對土壤微生物群落組成影響最大,而這一溫度正是設施大棚中持續(xù)時間最長的溫度.X8中的立克次體、鞘氨醇單胞菌、Delftla、多嗜菌、不動桿菌、短波單胞菌和甲基菌屬的數(shù)目較多,而尼龍菌、Chitinophaga、Mucilaginibacter、鏈霉菌、柄桿菌、伯克氏菌屬和黃桿菌屬的數(shù)目則較少,而這些菌落多數(shù)參與有機磷、原油、有機農藥的分解等土壤生態(tài)系統(tǒng)的能量流動和物質循環(huán)[19-21].然而,其他百菌清實驗組在15 ℃和35 ℃溫度中表現(xiàn)出相似的微生物群落結構和微生物豐度,說明在25 ℃時百菌清對土壤微生物群落的傷害最大,15 ℃時,可能由于溫度過低,農藥還沒有發(fā)揮藥效,而35 ℃時,又由于溫度過高,農藥揮發(fā)得過快.圖3中各臭氧水實驗組中的微生物組成變化不大,表明臭氧水能夠在很大的溫度跨度內保護土壤的微生物多樣性.

圖3 各實驗組中微生物種類差異的熱圖

2.5 菌種差異性分析結果

將所有比率大于0.001的農藥實驗組和臭氧測序數(shù)據(jù)篩選出來,進行差異性分析,結果如圖4所示.具體缺失的菌種通過紅色標注出來并注釋,可以看出主要缺失了Actinobacteria屬的細菌.由圖4可知,相比臭氧水實驗組,百菌清實驗組缺失了12種菌類,經(jīng)分析,這12種細菌多數(shù)屬于放線菌屬.放線菌會參與有機物分解、物質循環(huán),也能促進土壤形成團粒結構而改善土壤質量[22-23],還能夠產(chǎn)生大量抗生素、酶及其抑制劑等具有活性的物質[24].放線菌的存在還會促進農作物連作與土壤修復,刺激作物根系的生長代謝能力[25].陸啟環(huán)等[26]研究發(fā)現(xiàn),用質量濃度為1 mg·L-1的臭氧水澆灌草莓的幼苗,會顯著增加土壤中大量N和P元素及微量元素Zn的含量,增加草莓幼苗根系活力和葉片的抗氧化酶的活性,還能增加草莓幼苗的抗逆性.具有強氧化性的臭氧將土壤中的有機物質氧化成無機鹽,能為土壤提供更多的無機元素,降低土壤的有機質.

圖4 臭氧水和農藥實驗組中微生物種類的差異

3 結 論

本研究以噴水臭氧水和農藥為對照,分別通過不同濃度的臭氧水對土壤作用.利用MisSeq 2×300 bp高通量測序分析噴灑臭氧水對土壤微生物多樣性的影響,得到以下結論:

1) 不同溫度,相同臭氧水濃度條件下,臭氧水對微生物豐度的影響比較顯著,土壤中微生物的豐度隨著溫度的上升而上升;

2)在相同的溫度條件下,清水噴灑的對照組和臭氧水噴灑的實驗組中的土壤微生物群落總數(shù)都明顯大于噴灑百菌清的實驗組的說明臭氧水對設施植物根際微生物群落多樣性影響不大,而百菌清會大大降低土壤中的微生物多樣性.盡管溫度和臭氧濃度可能會引起香農指數(shù)的波動,但相較于其他實驗處理方法,臭氧水在保護微生物多樣性方面仍更勝一籌;

3)相比臭氧實驗組,百菌清實驗組的土壤中缺失了可以改善土壤肥力的放線菌(Actinobacteria),降低了土壤的肥力.

總體而言,在設施蔬菜種植過程中,噴灑臭氧水以取代農藥對病蟲害進行防止,有利于保持土壤中的微生物群落的多樣性與微生物總量,進而保持土壤的肥力.