趙艷輝 張萌 韓瑞 樊婷婷 龐泓

遼寧省沈陽市婦嬰醫(yī)院遺傳科

耳聾位居各類殘疾之首，我國聽力殘疾者高達(dá)2780萬[1]，新生兒耳聾發(fā)生率為1‰-3‰，即以每年新生3萬聾兒的速度增長[2]。耳聾按病因可分為遺傳性和非遺傳性,60%以上的新生聾兒是由遺傳因素導(dǎo)致，涉及常染色體隱性遺傳、常染色體顯性遺傳、線粒體及X連鎖遺傳[3-4]。研究表明：耳聾基因突變熱點(diǎn)在不同種族、不同地區(qū)的人群中有明顯的差異。而中國人群的聾病分子流行病學(xué)調(diào)查顯示：我國常見的耳聾相關(guān)基因包括GJB2、SLC26A4、mt12s rRNA及GJB3[5]。本研究采用耳聾基因芯片技術(shù)對沈陽地區(qū)6278例聽力正常的孕早期婦女進(jìn)行中國人常見的4個(gè)耳聾基因9個(gè)突變位點(diǎn)的檢測及分析，探討遺傳性耳聾基因的突變熱點(diǎn)和各位點(diǎn)突變頻率在本地區(qū)的分布情況，為本地區(qū)開展遺傳咨詢及耳聾的防治工作提供參考。

1 對象和方法

1.1 研究對象

選擇2014年7月-2017年6月至沈陽市婦嬰醫(yī)院就診的孕早期孕婦6278例（24-45歲），抽取靜脈血2-3ml；對檢測到攜帶耳聾基因（GJB2、SLC26A4）突變孕婦的配偶（23-47歲），抽取靜脈血4-6ml。如檢測到夫妻雙方攜帶不同的基因突變，則再次采集孕婦靜脈血4-6ml。所有采血環(huán)節(jié)前均經(jīng)知情選擇后簽署知情同意書。

1.2 研究方法

1.2.1 DNA提取

靜脈血采集后EDTA抗凝，DNA應(yīng)用試劑盒進(jìn)行提?。ū本┛禐槭兰o(jì)生物科技有限公司），提取DNA 使?jié)舛仍?100-200ng/μl，純度 OD260/280在1.7-2.0之間。

1.2.2 聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）

擴(kuò)增針對9個(gè)突變位點(diǎn)的9組引物分成A和B兩個(gè)反應(yīng)體系分別進(jìn)行多重PCR。將晶芯九項(xiàng)遺傳性耳聾基因芯片檢測試劑盒（北京博奧生物有限公司）中的PCR擴(kuò)增引物混合物和試劑混合物分別充分混合（A、B管），分裝，每個(gè)17μl反應(yīng)體系中加入3 ul的樣品DNA。預(yù)變性處理：37℃10min，95℃15min，96℃1min；擴(kuò)增條件：94℃30s、55℃30 s、70℃45s共32個(gè)循環(huán)，60℃10 min。在擴(kuò)增過程中，參數(shù)設(shè)置使溫度以0.4℃/s的速度從94℃降溫至55℃；以0.2℃/s的速度從55℃升溫至70℃。

1.2.3 雜交

PCR產(chǎn)物95℃變性5 min，立即浸入冰水混合物中冰浴3 min。從A、B兩個(gè)擴(kuò)增體系管中各取2.5μl加入到10μl雜交緩沖液管中，充分混勻并瞬離。將混合液通過蓋片加樣孔加到芯片的點(diǎn)樣區(qū)域，此過程不能產(chǎn)生氣泡，封閉雜交盒，然后放入50℃預(yù)熱雜交儀中保溫l h。

1.2.4 洗片

取出芯片，放入芯片架中，在洗片機(jī)中洗滌，程序?yàn)椋合礈煲篒，42℃2 min，洗滌液II，42℃1 min 2次。1 000g離心2 min甩干。

1.2.5 芯片掃描及判讀

用晶芯LuxScan 10K-B微陣列芯片掃描儀對芯片進(jìn)行掃描，針對遺傳性耳聾常見的9個(gè)突變位點(diǎn)，若在同位點(diǎn)中探針W出現(xiàn)陽性信號，判讀為該位點(diǎn)野生型；M出現(xiàn)陽性信號，判讀為該位點(diǎn)純合突變型；兩者均出現(xiàn)陽性信號，判讀為該位點(diǎn)雜合突變型。對于線粒體DNA12SrRNA基因突變位點(diǎn)，M出現(xiàn)陽性信號判讀為同質(zhì)突變，兩者均出現(xiàn)陽性信號判讀為異質(zhì)突變。

1.2.6 基因測序（PCR產(chǎn)物直接測序）

根據(jù)芯片結(jié)果，對適用人群針對GJB2和SLC26A4基因進(jìn)行測序。PCR產(chǎn)物純化采用Exo-SAP-IT酶處理。去除多余游離PCR引物和底物dNTPs；即在每個(gè)反應(yīng)管中加入3ul ExoSAP-IT，低速離心混合后，置PCR儀37℃30min→80℃15 min→4℃，純化處理后的產(chǎn)物作為測序反應(yīng)模板。測序反應(yīng)采用10 ul反應(yīng)體系，包含8ul測序引物和2 ul經(jīng)ExoSAP-IT處理過的PCR產(chǎn)物，反應(yīng)條件為：96℃20 s、50℃30 s、60℃2 min共25個(gè)循環(huán)。測序反應(yīng)的產(chǎn)物用醋酸鈉/乙醇法沉淀。加入15ul甲酰胺溶液（Hi-Di Formam-ide），在PCR儀上95℃變性3 min。反應(yīng)產(chǎn)物采用雙脫氧鏈終止法在測序儀（Applied Bio systems 3130，美國）上進(jìn)行測序，將測序結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)序列進(jìn)行比對。

2 結(jié)果

2.1 孕婦基因芯片檢測結(jié)果

6278例正常聽力孕早期婦女中，檢出常見耳聾基因突變者294例（實(shí)際孕婦人數(shù)為292例，其中2例患者為GJB2基因和SLC26A4基因的雙雜合突變攜帶者）。突變攜帶率4.68%，其中GJB2基因154例（2.46%，154/6278）、GJB3基因18例（0.29%，18/6278）、SLC26A4基因 110例（1.75%，110/6278）和線粒體12S rRNA基因12例（0.18%，12/6278），各個(gè)基因位點(diǎn)突變的分布情況見表1。

2.2 配偶相應(yīng)基因測序結(jié)果

290例孕婦的配偶需要進(jìn)行相關(guān)基因的測序檢測，實(shí)際進(jìn)行檢測的配偶人數(shù)為187例，檢測到基因突變攜帶者20例（見表2）。根據(jù)丈夫測序結(jié)果，需要孕婦再次采血進(jìn)行相關(guān)基因測序檢測的孕婦人數(shù)為9例，實(shí)際檢測人數(shù)9例，均未檢測到芯片結(jié)果以外的位點(diǎn)突變。

2.3 產(chǎn)前診斷結(jié)果

經(jīng)上述檢測，發(fā)現(xiàn)基因型沖突的家庭共11組，經(jīng)充分遺傳咨詢，夫婦知情選擇后，進(jìn)行產(chǎn)前診斷的家庭5組，檢測到胎兒攜帶同一基因純合突變/復(fù)合雜合突變者2例，胎兒攜帶雜合突變者2例；胎兒未攜帶突變者1例。具體情況見表3?；颊叩臏y序結(jié)果及基因芯片檢測結(jié)果見圖1、圖2。

圖1 產(chǎn)前診斷家庭7 SLC26A4基因測序結(jié)果圖Fig.1 SLC26A4 gene sequencing.Results of family 7

表1 294例正常聽力孕早期婦女各個(gè)基因位點(diǎn)突變種類、例數(shù)及占比Table 1 Mutation types,number and proportion of each gene locus in 294 normal hearing women in early pregnancy

表2 20例攜帶基因突變的孕婦丈夫相關(guān)基因測序情況Table 2 Related gene sequencing.Results of husbands of pregnant women with gene mutation

圖2 產(chǎn)前診斷家庭8 SLC26A4基因測序結(jié)果圖Fig.2 SLC26A4 gene sequencing.Results of family 8

2.4 隨訪結(jié)果

2.4.1 在隨訪到的孕婦攜帶基因突變、而丈夫相應(yīng)基因檢測結(jié)果未見異?；蛘煞蛲蛔兓蚺c孕婦本人不同的患者中，暫未發(fā)現(xiàn)新生兒有聽力異常者。

2.4.2 在已進(jìn)行產(chǎn)前診斷的患者中，胎兒產(chǎn)前診斷結(jié)果為單一位點(diǎn)雜合突變或未攜帶基因突變的3例新生兒中，生后聽力暫未見異常。

2.4.3 在6例孕婦與丈夫基因型沖突、但孕婦拒絕產(chǎn)前診斷的患者中，2例拒絕隨訪；在4例隨訪患者中，后續(xù)發(fā)生自然流產(chǎn)1例；聽力篩查未通過、后診斷為大前庭水管1例，已進(jìn)行人工耳蝸植入；另外2例新生兒暫未見異常。

3 討論

耳聾依據(jù)是否伴有耳外組織的異?；虿∽兛蓪⑵浞譃榫C合征性耳聾(syndromic hearing loss,SHL)和非綜合征性耳聾(non-syndromic hearing loss,NSHL),NSHL占70%以上[5]。目前已明確的耳聾基因位點(diǎn)有307個(gè)[6]，定位了近200個(gè)NSHL相關(guān)位點(diǎn),涉及66個(gè)常染色體隱性基因、36個(gè)常染色體顯性基因、5個(gè)X連鎖基因[7]。在我國，常見的耳聾相關(guān)基因及突變熱點(diǎn)包括GJB2(35delG、176del16bP、235delC 及 299-300delAT)、SLC26A4(c.919-2 A＞G、2168A＞G）、GJB3(538C＞T)和線粒體DNA12SrRNA(A1555G），導(dǎo)致的耳聾病例占30%-40%左右[8]。

GJB2基因主要生物學(xué)功能為編碼縫隙連接蛋白26，發(fā)生突變后產(chǎn)生了沒有生物活性的蛋白質(zhì)，從而影響縫隙連接蛋白所組成通道的正常功能，導(dǎo)致細(xì)胞間信息的傳遞受阻，細(xì)胞外鉀離子回流受到影響，進(jìn)而影響了耳蝸毛細(xì)胞的電生理活動(dòng)，從而導(dǎo)致聽力下降[9-11]。SLC26A4基因突變是僅次于GJB2突變引起的常染色體隱性遺傳耳聾的病因，是內(nèi)耳最常見畸形——大前庭水管的致病原因。該基因編碼離子轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)蛋白，在機(jī)體離子成分平衡的維持中發(fā)揮重要作用[12-13]。本研究發(fā)現(xiàn)本地區(qū)育齡婦女中，GJB2基因突變的攜帶率為2.45%，以235 del C（115例，1.83%）最多，符合235delC為國內(nèi)最常見基因突變的結(jié)論[14-16]；SLC26A4基因在聽力正常孕婦人群的突變攜帶率為1.74%，以c.919-2 A＞G突變最常見（94例，1.50%），均與文獻(xiàn)報(bào)道相似[16-18]。同時(shí)，在對攜帶GJB2基因及SLC26A4基因突變的孕婦配偶的基因檢測中，除了發(fā)現(xiàn)常見位點(diǎn)的突變外，我們還發(fā)現(xiàn)了GJB2基因109G＞A突變及SLC26A4基因IVS15+5G＞A的突變，前者與遲發(fā)型耳聾密切相關(guān)，提示攜帶者應(yīng)進(jìn)行聽力的保護(hù)及監(jiān)測，避免或延緩耳聾的發(fā)生；后者引起SLC26A4基因編碼的mRNA發(fā)生剪接位點(diǎn)的改變，從而導(dǎo)致耳聾的發(fā)生。這一結(jié)果也提示我們：拓展耳聾基因檢測的位點(diǎn)，有望進(jìn)一步提高耳聾相關(guān)基因突變的檢出率，從而更好地對孕婦及家庭進(jìn)行指導(dǎo)[19]。

表3 需進(jìn)行產(chǎn)前診斷家庭基因型分布情況及部分產(chǎn)前診斷結(jié)果Table 3 Genotype distribution of Prenatal diagnosis is needed for family and partial prenatal diagnosis.Results

GJB3基因是1998年我國科學(xué)家夏家輝院士克隆的第一個(gè)“本土基因”[20]，該基因538C＞T位點(diǎn)的突變被認(rèn)為與顯性遺傳高頻聽力下降有關(guān)。線粒體作為真核細(xì)胞的能量中心，在細(xì)胞生理活動(dòng)中發(fā)揮著重要的作用，在耳蝸的外毛細(xì)胞、支持細(xì)胞中都含有大量的線粒體,當(dāng)發(fā)生1555A＞G或1494C＞T突變后，使得線粒體12SrRNA高度保守編碼區(qū)域的結(jié)構(gòu)發(fā)生了改變，使得它更像細(xì)菌核糖體基因，從而導(dǎo)致它與氨基糖甙類抗生素結(jié)合能力增強(qiáng)，阻礙了線粒體核糖體蛋白質(zhì)的合成，使氧化磷酸化過程受阻，進(jìn)而導(dǎo)致聽毛細(xì)胞逐漸死亡，結(jié)果引起永久性聾[21]。本研究人群中線粒體基因突變的檢出率為0.18%，均為異質(zhì)性，以1555A＞G突變最為常見（7例，0.11%），略低于柳紅杰[18]研究結(jié)果0.24%（13/5 338）。對篩查出的12例線粒體12SrRNA突變者，均告知患者本人及所有母系家庭成員終生不能使用氨基糖苷類藥物，避免發(fā)生“一針致聾”的悲劇。同時(shí)也提示臨床醫(yī)生在使用氨基糖苷類藥物前檢測線粒體12SrRNA是否存在突變非常必要。

由于77%的NSHL為常染色體隱性遺傳方式，很多無耳聾家族史的人群為隱性耳聾基因攜帶人群，所以對聽力正常生育年齡人群進(jìn)行常見耳聾基因篩查非常必要。首先對育齡婦女進(jìn)行常見非綜合征性耳聾基因突變檢測，通過耳聾高危人群配偶的篩查與診斷、遺傳咨詢，必要時(shí)進(jìn)行植入前診斷，可以根本上降低先天性耳聾患兒的發(fā)生率。因?yàn)楸狙芯恐?個(gè)家庭選擇放棄產(chǎn)前診斷，暫時(shí)無法獲知胎兒耳聾風(fēng)險(xiǎn)，由于尚未分娩，暫時(shí)亦無法獲知生后聽力情況。篩查高風(fēng)險(xiǎn)人群的產(chǎn)前診斷率僅為45.45%（5/11），在進(jìn)行常見耳聾基因產(chǎn)前診斷的家庭中，發(fā)現(xiàn)胎兒耳聾風(fēng)險(xiǎn)100%的家庭高達(dá)40%（2/5）。結(jié)合后續(xù)隨訪結(jié)果，在高風(fēng)險(xiǎn)人群中，胎兒發(fā)生耳聾的比例為33.33%（3/9）。所以，加大對耳聾高風(fēng)險(xiǎn)人群的宣教、咨詢力度，使他們對遺傳性耳聾有一個(gè)清楚地認(rèn)知、對進(jìn)行產(chǎn)前診斷的必要性有更深入的了解非常必要。

先天性耳聾的危害不僅在于致“聾”，更在于致“啞”。因先天性耳聾患兒在語言發(fā)育的關(guān)鍵時(shí)期缺乏聽覺刺激，導(dǎo)致發(fā)音、構(gòu)音障礙，進(jìn)一步影響語言、智力、情感等心理發(fā)育和社會交往能力，給患兒家庭及社會帶來沉重的負(fù)擔(dān)[22]。所以，做好耳聾的三級防控工作至關(guān)重要。研究表明：如果能夠在先天性耳聾兒童出生后6個(gè)月內(nèi)發(fā)現(xiàn)并適當(dāng)干預(yù)，患兒語言功能基本不受影響[23,24]。因此，做好耳聾的三級預(yù)防環(huán)節(jié)，在語言發(fā)育關(guān)鍵期之前實(shí)施干預(yù)和康復(fù)等非常必要，可以降低致殘率。作為出生缺陷二級預(yù)防,通過對高危孕產(chǎn)婦進(jìn)行產(chǎn)前耳聾基因篩查和診斷，可以早期預(yù)警遺傳性耳聾，早診斷、早干預(yù)、早治療，給家庭一個(gè)知情選擇的機(jī)會，也為家庭接受耳聾患兒提供準(zhǔn)備的時(shí)間，包括思想上的接受及治療經(jīng)費(fèi)上的準(zhǔn)備等等，為及早干預(yù)提供有利條件，并為防止語前聾、降低耳聾出生缺陷奠定基礎(chǔ)；另一方面可以預(yù)警藥物性耳聾，從而避免因接觸耳毒性藥物所致聽力損失的發(fā)生[25，26]。

近年來，隨著技術(shù)不斷更新，檢測基因及熱點(diǎn)位點(diǎn)逐漸增加，將會對攜帶者檢出率大大提高，從而提高耳聾的檢出率，更好的明確耳聾致病基因。同時(shí)隨著高通量測序技術(shù)的快速發(fā)展，大規(guī)模耳聾基因平行測序技術(shù)為臨床耳聾基因診斷帶來了革命性的發(fā)展機(jī)遇，可一次性針對絕大多數(shù)已知耳聾基因進(jìn)行高通量全序列突變檢測?；诖笠?guī)模測序的遺傳性聾精準(zhǔn)診斷面臨著一系列問題，如測序發(fā)現(xiàn)的大量基因變異與耳聾表型的相關(guān)性有待深入研究[27]；結(jié)果需要其他方法驗(yàn)證；而且靈敏度、特異度有待提高，尚無法大規(guī)模用于臨床檢測[28]。目前，中國的科學(xué)家們正致力于建立大規(guī)模的中國耳聾人群基因變異數(shù)據(jù)庫，建立適用于中國人群耳聾基因大規(guī)模平行測序診斷流程，通過大樣本的測序發(fā)現(xiàn)和彌補(bǔ)大規(guī)模平行測序的不足，相信會為今后耳聾基因研究和臨床基因診斷的發(fā)展和完善提供可靠的技術(shù)保證。