徐瑩梅，俞 靜

(安徽林業(yè)職業(yè)技術(shù)學院，安徽 安肥 230031)

1 引言

微生物是一類肉眼不可見的微小生物的總稱，其中包括病毒、藍細菌、細菌、放線菌、粘菌、霉菌、藻類和原生動物等[1]。它們種類龐雜，姿態(tài)萬千，相互作用也錯綜復雜。茶園是以茶樹為主要栽培對象的經(jīng)濟灌木園,園中不同空間部位棲居有不同的真菌群落,病害真菌也是此真菌群落的重要成員[2]。從茶園的真菌群落進行調(diào)查研究,弄清茶園真菌種類,這對于探索茶園病害發(fā)生機理及微生態(tài)防治措施具有重要意義[3]。茶園屬于一個小的生態(tài)環(huán)境，因此微生物在茶園里分布極為廣泛，有些微生物能引起茶樹的病害，在這一方面，已有工作者的調(diào)查研究，并有效地開展防治工作。但是為什么在同一塊茶園里，有些葉片幾乎是處于同一生態(tài)環(huán)境下，有的發(fā)病，有的卻不發(fā)病。是不是因為在這些茶樹葉面有抵制有害微生物的有益微生物呢？目前，這一方面的研究工作做的不多，因此筆者對茶園葉面微生物區(qū)系做了部分研究工作，主要研究了真菌的分離和鑒定。

2 材料和方法

2.1 材料

打孔器(Φ為0.8 mm)；CHA-S振蕩器(農(nóng)業(yè)部重點實驗室提供)；馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基；滅菌培養(yǎng)皿6套、滅菌吸管2支(2 mL、三角玻璃涂棒；無菌水2瓶(250 mL三角瓶裝100 mL)；顯微鏡。

2.2 方法

2.2.1 采樣

于2017年3月17日，在安農(nóng)大茶園用五點采樣法采摘中、上部葉各五片，供分離用。

2.2.2 玻璃器皿的滅菌

將需用的培養(yǎng)皿、三角玻棒、吸管(2 mL)洗凈、晾干、包裝就緒后，放入烘箱中加熱至160 ℃,處理1 h。

2.2.3 固體培養(yǎng)基的配制

取200 g去皮新鮮馬鈴薯切碎，加水100 mL煮沸0.5 h,用紗布濾去馬鈴薯，加水補足100 mL,然后加20 g葡萄糖、20 g瓊脂。加熱使瓊脂完全熔化后，乘熱用紗布過濾，而后分裝三角瓶、試管(每支約10 mL)，同時將2瓶裝有200 mL水的三角瓶一起放入高壓滅菌器中，在15磅蒸汽壓下處理25 min,待用。

2.2.4 菌液配制

把采摘的葉片以小水流沖凈、晾干，用打孔器取20個圓形葉片(為0.8 mm)并投入無菌水三角瓶中，隨后分別在兩瓶上作“上”、“中”標記并放入CHA-S型振蕩器中在20 ℃溫度下高速振搖1 h,以使真菌的孢子分散。取6套培養(yǎng)皿，分別在皿底外面編號上1、上2、上3、中1中2中3，然后將熔化后的培養(yǎng)基冷卻至45 ℃左右時，分別以無菌操作的方法傾入已編號的培養(yǎng)皿中，凝固待用。在無菌室中用吸管分別吸取2 mL菌液移入其相應編號的培養(yǎng)基上，并用三角涂棒輕輕涂勻(注意：三角涂棒每次使用前要在火焰上滅菌)幾個處理的操作完畢后，將培養(yǎng)皿倒置于26 ℃恒溫箱中培養(yǎng)。3 d后，用肉眼觀察菌落 的生長情況，7 d后用顯微鏡檢察各菌落菌絲和子實體(分生孢子梗、分生孢子)的情況，并對此進行鑒定，一般僅鑒定到屬。所鑒定的真菌均移至斜面培養(yǎng)基上進行菌種保存。

3 結(jié)果與分析

3.1 分離的真菌種類及性狀描述

鏈格孢屬(Alternaria) 孢子梗不分枝，長短不一，分生孢子暗色，有縱橫分隔，長卵形，成串形，成鏈形。

曲霉屬(Aspergillus) 菌絲有隔，無色，分生孢子梗無隔，頂端膨大呈球形，球形表面長出小梗，小梗有分枝，頂端串生分生孢子，圓球形。

尾孢屬(Cercosporasp) 分生孢子梗不分枝，略彎曲，黃褐色，分生孢子鞭狀，基部較粗，頂端漸系細，有5～9個分隔，且分隔明顯[5]。

頭孢屬(Cephalosporium)菌絲上長出的分生孢子梗直立短小，頂端著生球形的分生孢子，單胞無色，并由分泌物粘在一起形成球狀。

枝孢屬(Cladosporium)孢梗橄欖色，近端或中部分枝，分生孢子褐綠色，單胞或雙胞，卵圓形。

鐮孢屬(Fusarium)分生孢子梗單生，分生孢子多細胞，鐮刀形，兩端形尖，彎曲顯著。培養(yǎng)基中產(chǎn)生大量的氣生菌絲，呈絮狀。菌絲到后期呈黃色。

長孺孢屬(Helminthosporiuim) 孢子梗較長，暗色有橫隔，稍彎曲，分生孢子亦有隔，橢圓形。

大莖點屬(Macrophoma) 孢子梗單生，短而細，分生孢子單胞，無色，卵圓形。

青霉屬(Penicillium) 菌落墨綠色，分生孢子梗從菌絲上垂直生出，端生帚狀分枝，頂生小梗，小梗上著生鏈狀的分生孢子，單胞，卵圓形，數(shù)量非常多。

擬盤多毛孢屬(Pestalotiopsis) 分生孢子四分隔5細胞，中間3胞黃褐色，兩端細胞無色，頂端有2～3根附屬絲。

茶葉點霉(Phyllostictatheaefolia) 分生孢子器球形，分生孢子無色，微小，單胞，卵形。

白色不產(chǎn)孢絲狀真菌，白色菌絲，絮狀，不產(chǎn)孢(表1)。

3.2 分離密度和分離相對頻率

分離密度=(平均菌落數(shù)×(1 mL/0.2 mL)×100 mL)/(0.42π×20×2)(面)

相對分離頻率=(各菌分離的菌落數(shù)/總菌落數(shù)) ×100%

表1 春季菜園真菌種群趨勢

4 春季茶園真菌種群趨勢簡析

由表1中的數(shù)據(jù)可知，3月中下旬從茶樹葉面上分離到的真菌有尾孢屬、青霉屬和擬盤多毛孢屬等6種真菌，其中尾孢屬、青霉屬真菌分離的相對頻率較高，密度也較大，它們分別為66%、6101.6cfu/cm2和 24%、2211.2cfu/cm2；至4月下旬，尾孢屬和青霉屬的出現(xiàn)頻率、分離密度都有一定程度的提高 ，分別達70.4%、6257.8cfu/cm2和33.7%、2992.2cfu/cm2,白色絮狀真菌、鏈格孢屬的頻率和密度亦有一定的提高，同時，4月下旬又分離到葉點霉屬，枝孢屬和大莖點屬三類真菌，3月份出現(xiàn)的頭孢屬和擬盤多毛孢屬這次又未分離到，這些情況的出現(xiàn)，表明春季茶園隨著溫度、濕度和其它生態(tài)環(huán)境的變化，真菌微生物不僅在數(shù)量上會發(fā)生變化，而且在種類上也會發(fā)生較大的變化，從5月上旬分離到的9個屬的真菌來看，這種情況表現(xiàn)得更加明顯，首先鏈格孢屬、白色絮狀真菌、青霉屬出現(xiàn)的頻率和密度均大幅度下降，同時又出現(xiàn)了幾類新的真菌，如長孺孢屬、鐮孢屬、曲霉屬等，特別是曲霉屬剛一出現(xiàn)就有較高的分離頻率和密度，為21%和1604cfu/cm2,此時的葉點霉屬已升至最高。

從總的趨勢來看，春季茶園的葉面真菌微生物種類較多，有的從3～5月份不僅始終能分離到，且種群數(shù)量能維持在較高的水平上，如青霉屬、鏈格孢屬、白色絮狀菌絲等，種類上也有一定的變化，3月份僅分離到6種，5月份分離到9種，出現(xiàn)了長孺孢屬、鐮孢屬、曲霉屬等。在這些分離到的真菌屬中，有的包括著茶樹的病后菌如葉點霉屬就包含著茶樹上3種病原物(茶芽枯病菌、茶白星病菌、茶赤葉斑病菌)；尾孢屬(茶褐色葉斑病菌)，擬盤多毛孢屬(茶輪斑病菌)等，這些真菌如出現(xiàn)的頻率高，密度大，就預示著有病害流行的可能，還有一些屬的真菌的出現(xiàn)并非是茶樹葉片病原物，如：青霉屬、頭孢屬、曲霉屬等。它們既然在茶樹葉面上出現(xiàn)，且密度較大，必然有它存在的生態(tài)意義，它們于一定時間內(nèi)在葉面上占據(jù)一定的空間位置，可能對病原菌具有一定的抑制作用，這些均有待進一步的研究。

5 結(jié)語

本實驗是于3～5月間進行的，時間較短，僅對春季茶園內(nèi)真菌種群做了大致的了解，并不全面，這項工作應繼續(xù)進行下去，摸清茶園內(nèi)全年種群數(shù)量及分布特點，對于維護茶園生態(tài)平衡和有害生物的綜合治理必將產(chǎn)生深遠的影響。