朱海生 王彬 劉建汀 陳敏氡 李永平 張前榮 溫慶放

摘 要：為了建立一套快速、簡單、準確、高效的西葫蘆種子純度檢測方法，以西葫蘆‘福美1號及其親本為試驗材料，利用SSR 分子標記技術(shù)鑒定雜交種子純度。從114對SSR引物中篩選出了1 對引物（SGSSR25），在雜交種和父、母本之間存在顯著差異的條帶，且雜交種含有父、母本的特異互補帶型。利用該引物對23株‘福美1號雜交種進行純度鑒定，結(jié)果為91.30%，與大田種植鑒定結(jié)果一致，表明該引物可用于‘福美1號雜交一代種子純度的快速檢測和準確鑒定，SSR分子標記技術(shù)應(yīng)用于西葫蘆雜交種子純度檢測具有可行性。

關(guān)鍵詞：西葫蘆;SSR分子標記;種子純度

Analysis of genetic diversity in squash by SSR markers

ZHU Haisheng， WANG Bin， LIU Jianting， CHEN Mindong， LI Yongping， ZHANG Qianrong， WEN Qingfang

（Fujian Engineering Research Center for Vegetables / Vegetable Research Center， Fujian Academy of Agricultural Sciences / Crops Research Institute， Fujian Academy of Agricultural Sciences， Fuzhou 350013， Fujian， China）

Abstact： In order to establish a rapid， simple， accurate and efficient method for detecting the seed purity of Cucurbita pepo， ‘Fumei No. 1 and its parents were used as experimental materials to identify the purity of hybrid seeds with SSR molecular marker technology in this study. One primer pair （SGSSR25） was filtered from 114 SSR primer pairs. Amplification results showed that there were significant different bands between the hybrids and their parents， and the hybrids contained specific complementary bands between the female and male parents. Twenty three individual seeds were tested with the primer， and the seed purity was 91.30%， which was consistent with the result in the field. The results indicated that the primer SGSSR25 could be used for rapid and accurate identification of seed purity of ‘Fumei No. 1 hybrid generation， and SSR molecular marker technology was feasible for purity detection of hybrid seeds in Cucurbita pepo.

Key words： Cucubita pepo L.; SSR molecular marker; Seed purity

西葫蘆（Cucubita pepo L.）是葫蘆科南瓜屬的一個種，為一年生蔓性草本蔬菜作物，也叫美洲南瓜，具有較高的營養(yǎng)價值和保健功能，且具有生長期短、產(chǎn)量高、耐貯運、適宜間作套種等優(yōu)點[1]，深受大眾喜愛。西葫蘆在我國各地均有大面積栽培，已成為我國瓜類蔬菜的主栽品種之一，栽培面積次于黃瓜[2-3]，并有逐年擴大之勢，具有廣闊的應(yīng)用前景和巨大的經(jīng)濟潛力。利用雜種優(yōu)勢，培育一代雜交西葫蘆品種是目前西葫蘆育種的主要方法。在西葫蘆雜交制種過程中，由于人工去雄不徹底或漏去雄等原因，常會出現(xiàn)假雜交種，導(dǎo)致種子純度下降，給生產(chǎn)造成巨大的經(jīng)濟損失。因此，雜交種品種純度和種子真實性的準確、簡便、快速鑒定成為西葫蘆生產(chǎn)中急需解決的問題之一。

隨著生物技術(shù)的快速發(fā)展，從DNA分子水平上對品種種子純度和真實性進行鑒定和分析成為可能，其中，采用分子標記技術(shù)鑒定種子純度是一種快速、準確、便捷、有效的方法。微衛(wèi)星序列即簡單重復(fù)序列（Simple sequence repeat，SSR）分子標記，廣泛存在于真核和原核生物基因組中，SSR分子標記具有重復(fù)性好、穩(wěn)定可靠、位點特異、復(fù)等位、呈共顯性等優(yōu)點，已經(jīng)成為最為廣泛的分子標記之一[4-5]，也是目前作物品種鑒定和種子純度鑒定研究中最常用的標記之一[6-7]。筆者利用SSR分子標記技術(shù)，篩選出特異性SSR引物，建立一套快速檢測西葫蘆種子純度的方法，以期為準確、快速、簡單、高效的西葫蘆雜交種子純度鑒定提供參考。

1 材料與方法

1.1 西葫蘆SSR分子標記數(shù)據(jù)來源與篩選

西葫蘆轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)來源于福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究中心Illumina高通量深度測序結(jié)果。委托北京百邁客生物科技有限公司進行RNA-Seq轉(zhuǎn)錄組測序，利用Primer 3.0對含SSR位點序列進行引物設(shè)計，引物序列長度18～25 bp，擴增產(chǎn)物長度100～280 bp，GC含量40%～60%，退火溫度55～65 ℃，共設(shè)計出引物7 958對。隨機選擇其中20 bp以上SSR序列的150對標記進行合成，進行SSR-PCR擴增以驗證其有效性。

1.2 材料及其DNA提取

供試材料為西葫蘆‘福美1號雜交種及其父母本為福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院培育的品種?；蚪MDNA提取采用CTAB法進行[8]，選取2～3片嫩葉，加入1～2勺的PVP和液氮，迅速研磨成粉狀，移入1.5 mL的離心管后加入600 μL預(yù)熱至65 ℃的 2% CTAB Buffer和β-琉基乙醇7 μL，充分混勻后，65 ℃水浴1 h，期間多次搖勻;室溫冷卻后加入等體積的氯仿/異戊醇，混勻靜置10 min，在12 000 r·min-1、4 ℃條件下離心10 min;取上清液，加入100 μL 3 mol·L-1 NaAc和300 μL的氯仿/異戊醇充分混勻，離心10 min;再次取上清液，并加入0.6倍體積的異丙醇，混勻至能看到白色絮狀物，在12 000 r·min-1，4 ℃條件下離心10 min，75%的乙醇洗滌DNA 2～3次，風(fēng)干后的DNA溶于100 μL TE溶液，加入2.5 μL RNase A去除RNA，保存于4 ℃或-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3 西葫蘆雜交種‘福美1號純度鑒定及SSR特異引物的篩選

以‘福美1號雜交種及其父母本為模板，利用1.1篩選的引物進行PCR擴增，篩選能區(qū)分‘福美1號雜交種及其父母本的特異性引物。

PCR 擴增時采用的反應(yīng)體系為：50 ng基因組DNA 1 μL，0.2 mmol·L-1 dNTP 1 μL，500 U Taq DNA聚合酶0.3 μL，0.4 μmol·L-1的引物各1 μL，2.5 μL 10×Buffer，加入滅菌的超純水至25 μL。PCR擴增程序為：94 ℃預(yù)變性3 min;35個循環(huán)，每個循環(huán)包括94 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 min;最后72 ℃延伸10 min，反應(yīng)結(jié)束后于4 ℃保存。PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)PAGE膠電泳銀染后觀察拍照。

1.4 西葫蘆雜交種‘福美1號純度鑒定

隨機抽取‘福美1號雜交種，利用篩選出來的SSR特異引物進行鑒定，結(jié)合田間種植鑒定結(jié)果，驗證利用SSR分子標記鑒定種子純度的準確性。只有同時具有親本特異性條帶的單株才為真正的雜交種，缺少其中的任意一條帶記為假雜種，計算種子純度。

2 結(jié)果與分析

2.1 西葫蘆DNA提取與鑒定

應(yīng)用改良后CTAB法提取的DNA，通過濃度為1%的瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，結(jié)果表明：DNA條帶明亮清晰，拖帶現(xiàn)象不明顯，帶形集中。OD260/OD280值在1.7～1.9之間，表示所提取的DNA雜質(zhì)含量少，純度較高， DNA適合做進一步的研究（圖1）。

2.2 西葫蘆SSR分子標記數(shù)據(jù)來源與篩選

西葫蘆轉(zhuǎn)錄組經(jīng)組裝后共獲得83 650條Unigene，對1 kb以上的Unigene進行搜索，其中5 786條Unigene序列中含有7 478個SSR位點。對含SSR位點的5 786條Unigene序列利用Primer 3.0設(shè)計引物，共設(shè)計出引物7 958對。選取長度在20 bp以上SSR序列，合成長度18～25 bp、擴增產(chǎn)物長度100～280 bp的引物150對，進行SSR-PCR擴增有效性檢測。SSR-PCR擴增結(jié)果表明，114對引物實現(xiàn)有效擴增，且?guī)颓逦?、重?fù)性好（圖2）。

2.3 SSR特異引物篩選

利用114對有效擴增SSR引物對‘福美1號雜交種及其父母本進行PCR 擴增及特異引物的篩選。篩選到共顯性差異標記條帶的引物SGSSR25，序列為：SGSSR25-F：5- GGCATTTCCTCCCCATTTAT -3;SGSSR25-R：5- AAATATGTGGCCAGCGACTC -3。該對引物能產(chǎn)生父本特異性標記和母本特異性標記，并在‘福美1號雜交種中擴增出互補條帶（圖3），表明該對引物可用于‘福美1號種子純度的檢測。

2.4 雜交種純度鑒定

從田間隨機選取23株‘福美1號西葫蘆，利用篩選得到的特異性引物對SGSSR25進行純度檢測，PCR 擴增結(jié)果表明，21株能清晰地擴增出與親本互補的條帶，擴增出父母本特異條帶各 1株（圖4），種子純度為91.30%，與田間檢測結(jié)果一致。

3 討論與結(jié)論

近些年，隨著分子標記技術(shù)的研究深入，利用分子標記對西葫蘆種子進行純度鑒定成為了一種快速、準確的方法?；谵D(zhuǎn)錄組的SSR分子標記較一般的分子標記具有信息量大、通用性好、在基因組序列中分布廣泛等優(yōu)勢，在雜交種的鑒定和種子純度檢測方面具有很大優(yōu)越性，已在多種植物中廣泛應(yīng)用[9-10]?，F(xiàn)有的西葫蘆SSR分子標記數(shù)量有限，大量開發(fā)SSR標記仍是目前研究的重要工作之一。筆者利用西葫蘆轉(zhuǎn)錄組測序獲得了SSR標記，篩選出有效擴增且?guī)颓逦?、重?fù)性好的SSR引物，為后期西葫蘆雜交種子純度鑒定提供了參考。

傳統(tǒng)的田間性狀鑒定種子純度所需周期長、成本高、工作量大，且以播種后植株的田間形態(tài)觀察為依據(jù)，易受外界環(huán)境和檢測人員水平等因素影響，導(dǎo)致結(jié)果存在偏差[11]。分子標記技術(shù)較田間形態(tài)學(xué)鑒定能有效減少鑒定的周期和成本，能快速準確地鑒定雜交F1代種子純度。SSR分子標記技術(shù)直接反映不同品種的遺傳基礎(chǔ)差異，為種子純度鑒定提供了一種更準確、快速、簡便、高效的方法。SSR標記數(shù)量多，帶型易于區(qū)分判斷，能區(qū)分純合基因型和雜合基因型，是一項很有潛力的技術(shù)，在黃瓜、青花菜、甘藍等[12-14]蔬菜中都有相關(guān)報道，但是利用SSR分子標記技術(shù)鑒定種子純度時，前提條件是篩選出能特異、清晰地擴增出雙親的特異性條帶，且在子代中雙親互補的SSR引物。筆者從114對引物中篩選出1條特異性強的引物SGSSR25，引物SGSSR25能產(chǎn)生父本特異性標記和母本特異性標記，可將西葫蘆雜交種子與其父母本區(qū)分開來，快速檢測出雜交種子的純度，具有準確、低成本、操作方便等優(yōu)勢，能夠代替?zhèn)鹘y(tǒng)雜交種子純度鑒定的方法，具有較高的商業(yè)應(yīng)用價值，為西葫蘆種子質(zhì)量控制和純度鑒定提供了參考依據(jù)。

參考文獻

[1] KAZMINSKA K，HALLMANN E，RUSACZONEK A，et al.Genetic mapping of ovary colour and quantitative trait loci for carotenoid content in the fruit of Cucurbita maxima Duchesne[J].Molecular Breeding，2018，https：//doi.org/10.1007/s11032-018-0869-z.

[2] 王朝陽，程永安，張恩慧，等.西葫蘆花蕾縱橫徑長度與小孢子發(fā)育關(guān)系研究[J].西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版），2012，40（5）：92-98.

[3] 宋金亮，朱磊，賈聖風(fēng)，等.西葫蘆胚囊再生植株快速繁殖及倍性鑒定[J].河南農(nóng)業(yè)科學(xué)，2018，47（1）：78-83.

[4] KALIA R K，RAI M K，KALIA S，et al.Microsatellite markers：An overview of the recent progress in plants[J].Euphytica，2011，177（3）：309-34.

[5] KUMAR B，KUMAR U，YADAV H K.Identification of EST-SSRs and molecular diversity analysis in Mentha piperita[J].The Crop Journal，2015，3（4）：335-342.

[6] 李麗，張萬清，劉玲，等.SSR標記對甜瓜品種純度和真實性的鑒定[J].分子植物育種， 2015，13（11）：2522-2530.

[7] 石星星，紀小紅，張磊，等.利用SSR標記鑒定結(jié)球甘藍雜交種真實性及純度[J].分子植物育種，2015，13（2）：331-337.

[8] 盧麗芳，朱海生，溫慶放，等.南瓜SRAP反應(yīng)體系的建立與優(yōu)化[J].福建農(nóng)業(yè)學(xué)報，2014，29（1）：40-46.

[9] 李海梅，沈佳，趙娟，等.黃瓜線粒體基因組SSR 標記開發(fā)及其在種子純度鑒定中的應(yīng)用[J].南京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2015，38（5）：764-771.

[10] 周志成，王惠林，王賢磊，等.SSR 標記鑒定甜瓜品種‘紅月亮種子純度[J].中國瓜菜，2014，27（1）：21-24.

[11] 李陽，范夢偉，季曉坤，等.利用SSR 技術(shù)鑒定玉米雜交種‘家佳榮2號的種子純度[J].西南農(nóng)業(yè)學(xué)報，2018，31（7）：1349-1354.

[12] 崔興華，韓毅科，杜勝利，等.黃瓜新品種‘津優(yōu)401種子純度的SSR鑒定[J].中國瓜菜，2015，28（3）：38-39.

[13] 江漢民，文正華，劉莉莉，等.SSR 分子標記鑒定青花菜雜交種‘津青一號的純度[J].天津農(nóng)業(yè)科學(xué)，2016，22（12）：57-59.

[14] 陳琛，莊木，李康寧，等.甘藍EST-SSR 標記的開發(fā)與應(yīng)用[J].園藝學(xué)報，2010，37（2）：221-228.