歐陽(yáng)夢(mèng)真 朱磊 孫治強(qiáng) 李勝利 吳幗秀 李陽(yáng) 何富豪 李嚴(yán)曼

摘 要：WRKY轉(zhuǎn)錄因子是植物中所特有的一類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子，以基因家族形式存在，并在植物的生長(zhǎng)發(fā)育和逆境響應(yīng)等過(guò)程中發(fā)揮重要的作用。采用RT-PCR的方法從西瓜中分離得到一條西瓜ClWRKY54基因。序列分析表明，該基因開(kāi)放閱讀框全長(zhǎng)1 428 bp，編碼475個(gè)氨基酸。其編碼蛋白分子量約為51.82 KD，等電點(diǎn)為6.17。該基因蛋白序列中包含2個(gè)WRKY保守結(jié)構(gòu)域，鋅指結(jié)構(gòu)為C2H2型，屬于典型的1類(lèi)WRKY基因。進(jìn)化樹(shù)分析顯示，該基因蛋白序列同葫蘆科作物中的甜瓜、黃瓜、西葫蘆等的WRKY26具有較高的同源性，處于同一分支上。亞細(xì)胞定位分析顯示，該基因編碼蛋白定位于細(xì)胞核中。對(duì)該基因進(jìn)行熒光定量PCR分析研究其表達(dá)特性，結(jié)果顯示該基因在西瓜根、莖、葉中均有表達(dá)，但是在葉片中表達(dá)量最高;H2O2可以誘導(dǎo)該基因的表達(dá)，而乙烯處理可以抑制該基因的表達(dá)，這說(shuō)明該基因可能參與逆境下H2O2和乙烯所介導(dǎo)的信號(hào)途徑。在模擬干旱下，該基因表達(dá)無(wú)變化，說(shuō)明該基因同干旱脅迫抗性不相關(guān)。本研究的結(jié)果將為進(jìn)一步的解析ClWRKY54的功能奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：西瓜;ClWRKY54;亞細(xì)胞定位;表達(dá)分析

Cloning， subcellular localization and expression analysis of ClWRKY54 in Citrullus lanatus

OUYANG Mengzhen， ZHU Lei， SUN Zhiqiang， LI Shengli， WU Guoxiu， LI Yang， HE Fuhao， LI Yanman

（College of Horticulture， Henan Agricultural University， Zhengzhou 450002， Henan， China）

Abstract： The WRKY transcription factors， uniquely existing in plants in the form of gene family， play important roles in plant growth， development and stress responses. In this study， a WRKY transcription factor gene ClWRKY54 was isolated from watermelon （Citrullus lanatus） leaves using reverse transcription PCR. Sequence analysis showed that the full length of the open reading frame of this gene was 1 428 bp， encoding 475 amino acids. The molecular weight of the encoded protein was about 51.82 KD and the isoelectric point was 6.17. The protein sequence of the gene contained two conserved WRKY domains with a C2H2 type zinc finger structure， respectively， which was a typical feature of the WRKY Group 1. Evolutionary tree analysis showed that the protein sequence of the gene was highly homologous with WRKY26 of Cucurbitaceae crops such as melon， cucumber and zucchini. Subcellular localization analysis showed that the ClWRKY54 was located in the nucleus. The expression characteristics of the gene were analyzed by quantitative RT-PCR. Results showed that the gene was expressed in roots， stems and leaves of watermelon， but the highest expression was found in leaves. H2O2 could induced the expression of ClWRKY54， while ethylene treatment could inhibit its expression， indicating that the gene might participate in the signal pathways mediated by hydrogen peroxide and ethylene under stresses. Under drought， the expression of ClWRKY54 remained unchanged， suggesting that it might not be related to drought stress. The results of this study would lay a foundation for further analysis of the functions of ClWRKY54.

Key words： Citrullus lanatus; ClWRKY54; Subcellular localization; Expression analysis

植物在生長(zhǎng)過(guò)程中會(huì)遭受到各種類(lèi)型的生物和非生物脅迫。為了抵御環(huán)境脅迫，植物在長(zhǎng)期的進(jìn)化過(guò)程中形成了一系列復(fù)雜的保護(hù)機(jī)制。通過(guò)這種機(jī)制，植物迅速感受和傳遞逆境信號(hào)，然后激活一系列抗性基因來(lái)提高自身對(duì)逆境的抵御能力。近年來(lái)，基因組測(cè)序工作的完成極大方便了人們對(duì)逆境脅迫相關(guān)基因的研究。目前已經(jīng)有許多與逆境相關(guān)的基因被分離出來(lái)，尤其是WRKY、NAC、MYB、ERF等各種轉(zhuǎn)錄因子。對(duì)這些基因功能的解析將有助于我們揭示植物響應(yīng)逆境的各種調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。

WRKY轉(zhuǎn)錄因子是植物所特有的一類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子，以基因家族形式存在。目前WRKY轉(zhuǎn)錄因子的基因已經(jīng)陸續(xù)在不同作物中被分離和鑒定出來(lái)，包括葡萄、番茄、水稻、黃瓜等[1-4]。在不同的植物中WRKY家族所包含的基因數(shù)目不一樣，例如番茄中包含81個(gè)WRKY轉(zhuǎn)錄因子[2]，而水稻含有100多個(gè)[5]，在西瓜中分離到了57個(gè)WRKY轉(zhuǎn)錄因子基因[6]。所有的WRKY轉(zhuǎn)錄因子基因蛋白序列中包含1個(gè)或2個(gè)有60個(gè)氨基酸的WRKY結(jié)構(gòu)域，其C端含有C2H2或者C2HC類(lèi)型的鋅指結(jié)構(gòu)[7]。許多研究表明，WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族基因在植物對(duì)逆境的響應(yīng)過(guò)程中發(fā)揮重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，過(guò)量表達(dá)黃瓜CsWRKY46的擬南芥植株同對(duì)照相比，其耐低溫能力得到了顯著提高，同時(shí)其能通過(guò)ABA信號(hào)途徑來(lái)調(diào)控植物的耐低溫性[8]。棉花中的研究發(fā)現(xiàn)，GhWRKY3可以被各種逆境信號(hào)分子（SA、MeJA、ABA、GAs 和ET）、機(jī)械損傷以及病原菌侵染等所誘導(dǎo)表達(dá)，而6-BA、生長(zhǎng)素、干旱、NaCl和低溫（4 ℃）處理對(duì)其表達(dá)卻沒(méi)有影響[9]。過(guò)表達(dá)菊花DgWRKY1的煙草植株表現(xiàn)出較強(qiáng)的耐鹽性[10]。PEG、NaCl、低溫和H2O2均可以誘導(dǎo)水稻中的TaWRKY10基因表達(dá)，其在煙草中的過(guò)量表達(dá)可以提高煙草的耐鹽和耐旱性[11]。這些研究說(shuō)明，WRKY家族基因可能在多種逆境中發(fā)揮重要的調(diào)控作用，同時(shí)可能參與多種逆境信號(hào)途徑。

西瓜（Citrullus lanatus），屬于葫蘆科西瓜屬，一年生蔓生藤本。由于營(yíng)養(yǎng)豐富和美味，廣受世界各地消費(fèi)者的喜愛(ài)，而我國(guó)是世界上西瓜種植面積最大的國(guó)家。西瓜在生長(zhǎng)過(guò)程中容易受到各種逆境的影響，極大影響其產(chǎn)量和品質(zhì)，因此對(duì)于西瓜抗逆性的研究具有重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。前期研究中，根據(jù)西瓜基因組測(cè)序信息，已經(jīng)將西瓜中所有的WRKY基因序列下載下來(lái)，對(duì)所有WRKY家族基因進(jìn)行鑒定、分類(lèi)和命名，并系統(tǒng)分析了所有西瓜WRKY家族基因?qū)Φ蜏氐捻憫?yīng)情況[6]。筆者以西瓜葉片為材料，利用RT-PCR將ClWRKY54克隆出來(lái)，通過(guò)構(gòu)建GFP和ClWRKY54的融合表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化煙草對(duì)該基因編碼蛋白進(jìn)行亞細(xì)胞定位分析，采用熒光定量PCR（qRT-PCR）的方法研究該基因在不同組織中的表達(dá)情況，以及在逆境脅迫和信號(hào)分子作用下，該基因在西瓜葉片中的響應(yīng)特點(diǎn)，可以為下一步通過(guò)轉(zhuǎn)基因的方法揭示ClWRKY54在西瓜逆境調(diào)控中的作用機(jī)制奠定一定的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

西瓜材料‘砧木西瓜（ZXG01016）種子由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院鄭州果樹(shù)研究所提供。2018年5月于河南農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院人工氣候室進(jìn)行育苗。

1.2 方法

1.2.1 西瓜ClWRKY54基因的CDS克隆 采用北京華越洋生物的快速通用植物RNA提取試劑盒3.0提取西瓜葉片總RNA，然后采用ABM公司的5X All-In-One RT MasterMix （with AccuRT Genomic DNA Removal Kit）試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄cDNA。根據(jù)前期從西瓜數(shù)據(jù)庫(kù)中下載的ClWRKY54基因（Gene ID：Cla018026）序列設(shè)計(jì)特異性引物（ClWRKY54-CDS-F：5′-ATGAATAACATAAATCAAACGA-3′;ClWRKY54-CDS-F-R：5′-CTAA

GATAGAAATGAGTTGATGAA-3′）。以西瓜葉片cDNA為模板進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄PCR擴(kuò)增，將ClWRKY54基因的CDS區(qū)域克隆出來(lái)。PCR反應(yīng)體系為25 ?L，Prime STAR MAX Premix（2×）12.5 ?L，模板cDNA 1 ?L，上下游引物各1 ?L，dd H2O 9.5 ?L，總體積為25 ?L。PCR擴(kuò)增程序?yàn)?4 ℃ 4 min;94 ℃ 30 s，50 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min 30 s，35個(gè)循環(huán);72 ℃ 10 min，4 ℃保存。

1.2.2 西瓜ClWRKY54基因的生物信息學(xué)分析 通過(guò)ExPASy軟件（https：//web.expasy.org/cgi-bin/protparam/Protparam）進(jìn)行蛋白質(zhì)分子量和等電點(diǎn)的預(yù)測(cè)。利用在線軟件Plant-PLoc（http：//www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/plant-multi/）預(yù)測(cè)其編碼蛋白的亞細(xì)胞位置。通過(guò) MEGA 6.0軟件進(jìn)行不同序列的進(jìn)化樹(shù)分析，采用的方法是Neighbor-joining。通過(guò)Clustalx 2對(duì)不同序列進(jìn)行多重比對(duì)分析。

1.2.3 西瓜ClWRKY54基因編碼蛋白的亞細(xì)胞定位 亞細(xì)胞定位所用的載體為pH7LIC5.0-ccdB rc-N-eGFP載體。首選將GFP載體進(jìn)行Stu I酶切，獲得線性化片段。通過(guò)ClWRKY54特異引物和高保真酶Prime STAR MAX進(jìn)行擴(kuò)增獲得ClWRKY54基因的CDS序列，并送樣測(cè)序。選取測(cè)序正確的菌液為模板，在ClWRKY54特異引物的前端加上15個(gè)GFP載體同源序列（wrky54-GFP-F：TACGCCGAGGCCTGCATGAATAACATAAATCAAAC;wrky54-GFP-R：TTAGGGAAGAGGCCTCTAAGATAGAAATGAGTTGATGA），然后采用高保真酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得帶有Stu I酶切位點(diǎn)的ClWRKY54序列。將獲得的載體線性化片段和帶有Stu I酶切位點(diǎn)的ClWRKY54基因的PCR產(chǎn)物，進(jìn)行純化回收。按照摩爾比1︰2的比例，并利用In-Fusion的同源重組技術(shù)進(jìn)行連接反應(yīng)，轉(zhuǎn)化DH5a菌株，擴(kuò)繁和檢測(cè)陽(yáng)性克隆。最后提取質(zhì)粒，并進(jìn)行檢測(cè)。將GFP和ClWRKY54重組載體轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌GV3101后，于28 ℃ YEB培養(yǎng)基中揺培，離心后用農(nóng)桿菌滲透液重懸菌體，最終使OD600值達(dá)到0.8，25 ℃黑暗放置2～3 h。選取長(zhǎng)勢(shì)良好的本氏煙植株，將上述菌體懸浮液用2.5 mL的一次性注射器吸取出來(lái)，從煙草葉片下表皮慢慢注射，讓菌液充滿(mǎn)整個(gè)煙草葉片，黑暗培養(yǎng)2 d后使用激光共聚焦顯微鏡觀察煙草葉片中綠色熒光蛋白的表達(dá)情況。

1.2.4 ClWRKY54基因熒光定量PCR分析 西瓜幼苗長(zhǎng)至2葉1心時(shí)，選取生長(zhǎng)一致的西瓜，分別進(jìn)行模擬干旱和信號(hào)（乙烯和H2O2）分子處理。干旱處理為將苗的根部浸入400 mmol·L-1的甘露醇溶液中。乙烯和H2O2處理分別為對(duì)西瓜全株噴灑濃度為5 mmol·L-1的乙烯和10 mmol·L-1的H2O2溶液。在0、6、12、24和48 h分別采集各處理下的葉片樣品。將清水處理的西瓜幼苗葉片設(shè)置為對(duì)照。為了分析ClWRKY54基因的組織表達(dá)特性，分別采集2葉1心時(shí)期西瓜根、莖、葉的部分組織。采集的樣品用液氮速凍，-80 ℃冰箱備用。每個(gè)處理設(shè) 3 次重復(fù)，每次重復(fù)3株幼苗。

采用北京華越洋生物的快速通用植物RNA提取試劑盒3提取西瓜葉片的總RNA，然后采用Takara公司PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser（Perfect Real Time）試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。以elongation factor 1-a作為內(nèi)參基因[12]。ClWRKY54熒光定量PCR引物為ClWRKY54-F：CATCGGTA

GTCATTCTTTCC;ClWRKY54-R：TATGTCATCTCTGGCTTCTT。采用ABM公司EvaGreen 2X qPCR MasterMix熒光定量試劑盒，在Applied Biosystems StepOne and StepOnePlus Real-Time PCR Systems（ABI，美國(guó)）進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)。熒光定量采用20 ?L PCR反應(yīng)體系：cDNA模板2 ?L，F(xiàn)orward primer 1 ?L，Reverse primer 1 ?L，Premix TaqTM 10 ?L，ddH2O 6 ?L。反應(yīng)程序?yàn)?5 ℃，30 s;95 ℃，30 s;60 ℃，20 s;72 ℃，延伸30 s;40個(gè)循環(huán)。熒光定量試驗(yàn)結(jié)果最后采用2?ΔΔCT的方法進(jìn)行計(jì)算[13]。具體計(jì)算過(guò)程如下：用目的基因Ct值減去自身內(nèi)參基因Ct值，得到的數(shù)就是ΔCt;用所有樣本的ΔCt減去對(duì)照組樣本的ΔCt，得到ΔΔCt;對(duì)所有ΔΔCt結(jié)果前面加上負(fù)號(hào)即取負(fù)數(shù)，得到的結(jié)果就是-ΔΔCt。最后，對(duì)-ΔΔCt進(jìn)行2的冪運(yùn)算，即2-ΔΔCt。

2 結(jié)果與分析

2.1 西瓜ClWRKY54基因的CDS克隆

前期研究中，筆者已經(jīng)根據(jù)西瓜基因組測(cè)序信息下載下來(lái)西瓜WRKY基因家族所有基因序列，并根據(jù)染色體分布位置將57個(gè)家族基因分別進(jìn)行命名，根據(jù)其中的ClWRKY54序列設(shè)計(jì)特異性引物，以西瓜葉片cDNA為模板進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，得到西瓜ClWRKY54基因的ORF全長(zhǎng)序列（圖1）。其ORF全長(zhǎng)1 428 bp，編碼475個(gè)氨基酸。通過(guò)軟件進(jìn)行預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)其編碼蛋白分子質(zhì)量約為51.82 kD，等電點(diǎn)為6.17。將ClWRKY54在NCBI上進(jìn)行Blastx比對(duì)，發(fā)現(xiàn)與其他物種的WRKY26和WRKY33具有較高的相似性。與甜瓜（Cucumis melo）、黃瓜（Cucumis sativus）、西葫蘆（Cucurbita pepo subsp. pepo）等的WRKY26相似性達(dá)到86%以上。

2.2 西瓜ClWRKY54的同源性分析

將ClWRKY54蛋白序列與在NCBI上與其相似性相對(duì)較高的WRKY基因編碼的蛋白質(zhì)序列進(jìn)行多序列比對(duì)（圖2）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，這些蛋白均具有WRKY基因家族中第1類(lèi)WRKY轉(zhuǎn)錄因子的典型特征，序列中均含有2個(gè)WRKY蛋白結(jié)構(gòu)域，其鋅指結(jié)構(gòu)類(lèi)型均為C2H2類(lèi)型。同時(shí)不同物種WRKY蛋白序列在N和C末端相對(duì)來(lái)說(shuō)保守性較差，而在WRKY結(jié)構(gòu)域保守性卻非常高。

將其他物種中與ClWRKY54相似性較高的18個(gè)蛋白序列下載下來(lái)，將ClWRKY54蛋白序列與這18個(gè)基因編碼的氨基酸序列一起進(jìn)行進(jìn)化分析，構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)（圖3）。進(jìn)化樹(shù)分析表明，所有序列明顯分為2個(gè)大類(lèi)，其中所有的WRKY33和辣椒的CaWRKY26位于一個(gè)大的分支上，而西瓜ClWRKY54與苦瓜McWRKY26、甜瓜CmWRKY26、黃瓜CsWRKY26、南瓜CmWRKY26位于另一個(gè)分支上，這些同屬于葫蘆科植物，說(shuō)明ClWRKY54同這些基因的氨基酸序列具有較近的親緣關(guān)系，同時(shí)說(shuō)明ClWRKY54可能同這些基因具有相似的功能。

2.3 西瓜ClWRKY54的亞細(xì)胞定位分析

首先通過(guò)Plant-PLoc軟件預(yù)測(cè)了ClWRKY54編碼蛋白的亞細(xì)胞位置，結(jié)果定位于細(xì)胞核中。為了驗(yàn)證預(yù)測(cè)的結(jié)果，構(gòu)建35S：ClWRKY54-GFP的融合表達(dá)載體，注射到煙草下表皮細(xì)胞中，在激光共聚焦顯微鏡上觀察綠色熒光蛋白在細(xì)胞中的位置，發(fā)現(xiàn)重組質(zhì)粒侵染的細(xì)胞，只有在細(xì)胞核上可以觀測(cè)到熒光信號(hào)。這說(shuō)明ClWRKY54是一個(gè)核定位蛋白，這與其作為轉(zhuǎn)錄因子的功能特點(diǎn)相符（圖4）。

2.4 西瓜ClWRKY54的表達(dá)分析

由圖5可以看出，西瓜ClWRKY54在干旱條件下表達(dá)量同對(duì)照相比沒(méi)有顯著差異。植物信號(hào)分子在植物對(duì)逆境的響應(yīng)過(guò)程中參與復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，為了研究ClWRKY54可能參與的信號(hào)途徑，分析了該基因在乙烯和H2O2處理下的表達(dá)情況，結(jié)果表明，H2O2早期可以顯著誘導(dǎo)ClWRKY54基因表達(dá)，而乙烯可以顯著抑制ClWRKY54基因表達(dá)。對(duì)ClWRKY54基因進(jìn)行組織表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)，ClWRKY54在西瓜不同組織中均有表達(dá)，在葉片中表達(dá)量最高，其次是莖和根。

3 討論與結(jié)論

WRKY轉(zhuǎn)錄因子是植物所特有的一類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子，WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族也是包含基因最多的轉(zhuǎn)錄因子家族之一。其家族基因不僅在植物的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮著重要作用，同時(shí)也參與植物對(duì)各種逆境的抗性反應(yīng)過(guò)程[14-16]。目前關(guān)于WRKY轉(zhuǎn)錄因子的功能也是研究的熱點(diǎn)，在許多植物中的生物學(xué)功能已經(jīng)得到了廣泛的研究和闡述，而關(guān)于西瓜WRKY基因家族基因功能的研究相對(duì)較少。西瓜是我國(guó)重要的經(jīng)濟(jì)作物，其產(chǎn)量和品質(zhì)在生產(chǎn)中常常受到各種環(huán)境因子的影響。前期研究中，筆者對(duì)西瓜的WRKY家族基因進(jìn)行了鑒定、分類(lèi)、命名及低溫表達(dá)分析，其中ClWRKY54是一條對(duì)低溫響應(yīng)較為敏感的基因[6]，因此在本研究中對(duì)西瓜ClWRKY54的生物學(xué)功能進(jìn)行重點(diǎn)研究。

對(duì)蛋白質(zhì)序列進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，ClWRKY54具有典型的WRKY家族結(jié)構(gòu)特征，包含2個(gè)WRKY結(jié)構(gòu)域，屬于WRKY家族I家族的成員。進(jìn)化樹(shù)分析顯示，ClWRKY54同葫蘆科作物植物中的苦瓜McWRKY26、甜瓜CmWRKY26、黃瓜CsWRKY26、南瓜CmWRKY26表現(xiàn)出較高的相似性，這說(shuō)明ClWRKY54可能與這些基因具有相似的功能。筆者首先通過(guò)Plant-PLoc軟件預(yù)測(cè)了ClWRKY54蛋白的亞細(xì)胞位置，結(jié)果顯示其可能位于細(xì)胞核中。為了進(jìn)一步驗(yàn)證預(yù)測(cè)結(jié)果，通過(guò)GFP熒光定位方法對(duì)其進(jìn)行亞細(xì)胞定位，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其位于細(xì)胞核中。這與許多前人研究結(jié)果一致[8，10]。作為一種轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，WRKY可能是通過(guò)與其他基因的啟動(dòng)子區(qū)域進(jìn)行結(jié)合而調(diào)節(jié)其他基因的表達(dá)。

雖然很多研究表明WRKY廣泛參與植物對(duì)逆境的抗性反應(yīng)，同時(shí)調(diào)節(jié)植物的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程。但是WRKY家族中每個(gè)基因功能各異。因此，為了進(jìn)一步研究其功能，筆者采用熒光定量PCR分析了ClWRKY54基因的表達(dá)特性，實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果表明，在干旱條件下，ClWRKY54基因表達(dá)無(wú)顯著變化，表明ClWRKY54可能不參與植物對(duì)干旱脅迫的抗性。同時(shí)許多研究發(fā)現(xiàn)，WRKY受各種信號(hào)分子的誘導(dǎo)，參與植物對(duì)逆境響應(yīng)的各種信號(hào)途徑[9]。活性氧（ROS）可以影響許多基因的表達(dá)，進(jìn)而影響植物對(duì)逆境的響應(yīng)，而H2O2是其中一個(gè)關(guān)鍵的信號(hào)分子[17-18]。乙烯是一種重要的逆境響應(yīng)信號(hào)分子，可以調(diào)控植物對(duì)逆境的抗性反應(yīng)[19]。棉花中的研究發(fā)現(xiàn)，乙烯和H2O2均可以誘導(dǎo)GhWRKY3基因的表達(dá)[9]，葡萄的乙烯響應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子VaERF092可以通過(guò)結(jié)合到VaWRKY33啟動(dòng)子區(qū)域從而調(diào)控其表達(dá)，進(jìn)而提高植物的抗冷性[20]。水稻中的研究發(fā)現(xiàn)，TaWRKY51轉(zhuǎn)錄因子可以通過(guò)負(fù)調(diào)控乙烯的生物合成進(jìn)而影響側(cè)根的形成[21]。因此，本研究中筆者分析了其對(duì)H2O2和乙烯的響應(yīng)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，H2O2在早期可以誘導(dǎo)其表達(dá)，說(shuō)明其可能參與H2O2所有誘導(dǎo)的信號(hào)途徑。乙烯處理卻可以顯著抑制ClWRKY54表達(dá)，這表明ClWRKY54基因可能同乙烯信號(hào)途徑存在負(fù)調(diào)控關(guān)系，具體功能還需進(jìn)一步的研究確定。對(duì)ClWRKY54基因進(jìn)行組織表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)，其在根、莖、葉中均有表達(dá)，在葉片中的表達(dá)量最高，而在根中的表達(dá)量最低，說(shuō)明該基因在不同組織中的表達(dá)具有差異，這與在其他植物中的研究結(jié)果相一致[8，22]，同時(shí)說(shuō)明該基因的功能可能涉及到多個(gè)方面。

綜上所述，筆者從西瓜葉片克隆到西瓜的ClWRKY54基因，其蛋白序列中包含2個(gè)WRKY結(jié)構(gòu)域，同時(shí)其鋅指結(jié)構(gòu)類(lèi)型均為C2H2，屬于WRKY基因家族中1類(lèi)家族的典型特征。該基因編碼蛋白定位于細(xì)胞核中?；虮磉_(dá)分析顯示，該基因在根、莖、葉中均有表達(dá)，在葉中表達(dá)量最高。該基因表達(dá)受乙烯抑制，受H2O2誘導(dǎo)，ClWRKY54可能參與多種逆境信號(hào)途徑，干旱模擬對(duì)其表達(dá)無(wú)影響。

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