石 磊，李 禤，李有全，殷 宏，羅建勛

(1.中國農業(yè)科學院蘭州獸醫(yī)研究所,甘肅 蘭州 730046；2.青海省海南州動物疫病預防控制中心，青海 海南州 813000)

1940年，Stockstadt首次發(fā)現(xiàn)抗生素對畜禽具有促進生長作用。隨后，抗生素作為飼料添加劑在畜禽養(yǎng)殖中逐步得到廣泛應用。近年來，由于抗生素的濫用導致了諸多副作用，如耐藥性、藥物殘留、動物內源性感染以及破壞微生態(tài)平衡等[1]。因此，由于抗藥性耐藥病原菌的出現(xiàn)，導致人們越來越關注食品安全與衛(wèi)生[2]。2006年，歐盟全面停止使用任何抗生素生長促進劑[3]。2020年國家規(guī)定藥物飼料添加劑全部退出，養(yǎng)殖端也進入減抗和限抗時代。因此，尋找某種生物制劑來替代抗生素已成為人類生存和發(fā)展的緊迫任務。

益生菌是一種通過改善腸道菌群平衡而對動物產生有利影響的活的微生物，具有抑制病原微生物、調節(jié)胃腸道微生物區(qū)系、增強免疫應答，有效預防腹瀉，促進動物生長發(fā)育，提高飼料利用率等多種功能[4-5]。益生菌作為一種重要的替抗(或減抗)產品，以其無耐藥性、無毒副作用、無藥物殘留等優(yōu)點日益受到人們的關注，目前已成各國科學家關注的研究熱點。

董曉麗證實，在哺乳期犢牛代乳品中添加益生菌能夠增加日增重，有改善犢牛生長性能的趨勢，且減輕了犢牛的腹瀉狀況[6]。在斷奶犢牛日糧中添加益生菌，能夠改善斷奶前期犢牛的飼料轉化率，并影響斷奶后犢牛的瘤胃微生物區(qū)系。代乳粉或日糧中添加益生菌對哺乳期犢牛和斷奶后犢牛的血液生化指標均無顯著影響，說明添加益生菌不會影響犢牛的代謝[6]。Bayatkouhsar等研究表明，給初生犢牛飼喂乳酸桿菌后，犢牛的采食量和日增重都有增加的趨勢，而且犢牛的最終體重也顯著增加[7]；乳酸菌能夠代替抗生素作為犢牛的生長促進劑，并取得較好效果[8]。梁海威等研究證實，在雞飼料中添加植物乳桿菌能提高1-42日齡肉雞的生長性能，改善血清生化指標，修復攻毒肉雞的組織器官損傷，降低血清尿素氮水平[9]。Riddell等研究表明,飼喂益生菌的犢牛日增重、飼料轉化率、采食量在很大程度上高于未飼喂益生菌的犢牛[10]；口服羅伊氏乳桿菌能夠促進腸道蠕動，改善兒童慢性便秘癥狀，同時對嬰兒疝氣的治療有明顯的效果[11-12]。在飼料中添加屎腸球菌能夠改善仔豬生長性能，防治仔豬腹瀉及提高仔豬的免疫能力[13]。

本研究的目的是通過厭氧培養(yǎng)、形態(tài)學觀察以及分子鑒定技術從健康牦犢牛糞便中分離和鑒定益生菌株，了解犢牛腸道內益生菌的分布種類，為治療犢牛腹瀉、改善犢牛生長性能及提高犢牛的免疫力提供更多的候選菌種。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 分離用培養(yǎng)基為MRS培養(yǎng)基；革蘭染色試劑盒；微量生化試驗鑒定試劑盒；Taq酶、回收試劑盒等。

1.2 主要儀器 厭氧培養(yǎng)箱；超凈工作臺；PCR儀。

1.3 樣品采集 在青海省共和縣江西溝鄉(xiāng)，隨機采集20頭幼齡健康牦牛的新鮮糞便，裝入50 mL無菌離心管，編號并置于-20 ℃保存。

1.4 乳酸菌的初篩 無菌條件下稱取糞便樣品1 g，加入9 mL分離稀釋液，振蕩混勻，用6層紗布過濾去除雜質。將濾液作為原液，依次進行10倍遞增稀釋，取100 μL稀釋液均勻涂布于MRS固體培養(yǎng)基平板上，厭氧條件下37 ℃培養(yǎng)24-48 h。用接種針挑去疑似乳酸菌的白色或乳白色的溶鈣菌落，進行下一步的劃線純化。

1.5 菌種的純化與保存 將1.4中疑似乳酸菌進行劃線純化培養(yǎng)，連續(xù)重復3次以上，最后一次劃線后若平板上菌落大小形態(tài)一致，無雜菌出現(xiàn)則純化成功。挑取單個菌落接種于MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)24 h，離心，用適宜體積的含30%甘油的MRS液體培養(yǎng)液混勻，分裝于凍存管置-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 菌種的鑒定

1.6.1 形態(tài)學觀察 進行單一菌種的菌落形態(tài)大小、光澤等觀察。革蘭染色，鏡檢觀察其菌體形態(tài)和大小等特征。

1.6.2 生化試驗鑒定 使用微量生化試驗鑒定試劑盒，按照其操作說明書進行各項生化試驗項目的檢測。

1.6.3 16S rRNA的序列測定 按照常規(guī)方法進行單一菌種基因組總DNA的提取，用細菌通用引物進行分子生物學特征鑒定，正向引物為27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′；反向引物為1492R：5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′，進行擴增。PCR反應體系(50 μL)：10×Buffer 5 μL，dNTP 3 μL，上、下游引物各0.5 μL，rTap酶0.3 μL，模板DNA 1 μL，加去離子水至39.7 μL。PCR擴增反應程序：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，55 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，共35個循環(huán)；72 ℃ 5 min。用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物，用回收試劑盒回收、純化后送南京金斯瑞生物科技有限公司測序。將得到的菌株16S rRNA基因序列數(shù)據(jù)輸入GenBank核酸數(shù)據(jù)庫中，利用在線BLAST程序與GenBank數(shù)據(jù)庫中的序列進行比對分析，確定其分類地位。

1.7 菌株的抗藥性試驗 挑取分離菌株，接種于含抗生素濃度分別為1%四環(huán)素、1%土霉素、1%黃連素、1 000 IU/mL鏈霉素、1 000 IU/mL青霉素鈉鹽的MRS液體培養(yǎng)基中，觀察篩選菌的生長情況。

2 結果

經過初步分離和純化，從青海省共和縣20份新鮮牦犢牛糞便中共獲得7株分離菌，其中3株革蘭陽性桿菌分別命名L1、L2、L3，4株革蘭陽性球菌分別命名為E1、E2、E3、E4。經生化試驗鑒定，按照說明書的判定標準，初步判定L1分離菌為羅伊氏乳桿菌，L2分離菌為植物乳桿菌，L3分離菌為保加利亞乳桿菌，E1、E2、E3和E4分離菌疑似為腸球菌。經測序和BLAST比對分析表明，L1的DNA序列與羅伊氏乳桿菌(Lactobacillusreuteri)的基因序列相似性達100%，L2的DNA序列與植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)的基因序列相似性達99%，L3的DNA序列與保加利亞乳桿菌(Lactobacillusbulgaricus)的基因序列相似性達100%。E1的DNA序列與乳酸乳球菌(Enterococcuslactis)的基因序列相似性達100%，E2與堅強腸球菌(Enterococcusdurans)的基因序列相似性達100%，E3的DNA序列與海氏腸球菌(Enterococcushirae)的基因序列相似性達100%，E4的DNA序列與屎腸球菌(Enterococcusfaecium)的基因序列相似性達100%。結合分離菌的形態(tài)學特征、生理生化特征和分子鑒定特征，確定L1分離菌為羅伊氏乳桿菌(見中插彩版圖1)，L2分離菌為植物乳桿菌(見中插彩版圖2)，L3為保加利亞乳桿菌；E1分離菌為乳酸乳球菌，E2為堅強腸球菌，E3為海氏腸球菌(見中插彩版圖3)，E4為屎腸球菌(見中插彩版圖4)。

抗藥性試驗結果表明，7株分離菌在幾種藥物中均能生長，但在青霉素中生長比較緩慢，說明7株分離菌均具有較強的抗藥性。

3 討論

益生菌可競爭性抑制病原微生物，使其不能定值、占位、生長、繁殖，促使病原微生物隨糞便排出體外[14]。而源自牦牛糞便中的益生菌更有利于適應牦牛特異性腸道環(huán)境從而發(fā)揮最大功效。

從青海共和縣牦牛的糞便樣品中分離得到7株乳酸菌，包括羅伊氏乳桿菌、植物乳桿菌、保加利亞乳桿菌、乳酸乳球菌、堅強腸球菌、海氏腸球菌和屎腸球菌各1株。其中羅伊乳桿菌幾乎存在于所有脊椎動物和哺乳動物腸道內，對腸黏膜具有很強的粘附能力，可以承受胃酸和膽汁的作用到達小腸的上部粘附于小腸壁，該菌體可分泌胞外物質抑制腸道菌群的粘附定植，避免罹患腸道疾病，能合成并分泌羅伊菌素，是一種非蛋白質類廣譜抗菌物質，可有效抑制大腸桿菌、沙門菌、李斯特菌、梭菌、葡萄球菌等有害菌的生長；該菌可作為一種防腐劑用于食品、飼料、飲料；可作為生物抑菌劑，用于不能高壓滅菌的牛奶、生物材料的滅菌；作為嬰兒食品添加劑調節(jié)腸道菌群分布，刺激機體免疫器官的成熟，激活免疫系統(tǒng)，增加抗炎細胞因子的產生，降低腸道的滲透性[15-17]。植物乳桿菌因其代謝產物乳酸、細菌素及蛋白酶等而被作為益生菌應用到畜禽生產中，其能通過維持腸道菌群平衡、促進營養(yǎng)物質消化與吸收和改善腸道微生物代謝對宿主產生益生作用，尤其當動物機體處于應激條件下，其益生功效更為明顯。在生長豬飼糧中添加植物乳桿菌，能夠改善生長豬腸道菌群環(huán)境，提高生長豬生長速度和飼料利用效率[18]。屎腸球菌是乳酸菌中抗逆性較強的一類，具有很好的抗逆性(高溫、酸堿、高鹽、氧氣)，腸道粘附能力好，對抗生素也具備很好的耐受性。據(jù)資料顯示，該菌進入動物腸道后，主要通過以下四個途徑對宿主產生作用：快速粘附腸道黏膜，抑制病原菌的粘附，維持微生態(tài)平衡；代謝過程中產生乳酸、細菌素和過氧化氫等物質，降低腸道pH值、抑制病原菌繁殖、減少腸道內毒素與尿素酶的含量、促進動物器官成熟、改善動物生理狀態(tài)；產生維生素、氨基酸和促生長因子等多種營養(yǎng)物質；誘導機體產生細胞因子、干擾素、白細胞介素等，增強機體非特異性免疫、提高抗病能力、降低炎癥反應[19]。

本研究分離的7株乳酸菌，為后期研制抗牦牛腹瀉益生菌產品的研究提供了基礎。