文/伍佰鑫 龍 云 羅 陽 孫 鏖 李劍波
(1 湖南省畜牧獸醫(yī)研究所;2 湖南德農(nóng)牧業(yè)集團(tuán)有限公司)
乳蛋白通常是蛋白質(zhì)序列中各種生物活性肽的前體,通過酶作用釋放出來,具有多種功能,如免疫調(diào)節(jié)、抗炎、抗菌和抗癌等。與其他畜乳不同,駱駝乳能治療兒童嚴(yán)重的食物過敏,對于抗糖尿病、抗中毒、抗病毒、抗菌、抗類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、抗癌等也具有明顯的效果。機(jī)體氧化應(yīng)激時(shí),體內(nèi)自由基水平增加,損傷脂類、蛋白質(zhì)和DNA等重要生物分子。活性氧簇是氧化應(yīng)激的一個(gè)方面,與類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、糖尿病、炎癥、動(dòng)脈粥樣硬化和癌癥等多種疾病有關(guān)。從天然蛋白質(zhì)中提取的一些生物活性肽,對于抗氧化、抗炎、抗菌和抗高血壓具有顯著作用,且對人類幾乎沒有副作用。一些研究報(bào)道了駱駝乳的抗氧化作用,但針對的是發(fā)酵乳、全脂乳、總蛋白水解物或特定蛋白質(zhì)(如乳鐵傳遞蛋白)。關(guān)于駱駝乳蛋白質(zhì)組分或多肽的抗氧化作用,則罕有報(bào)道。為了研究駱駝乳蛋白質(zhì)組分和肽清除自由基、防止氧化應(yīng)激的能力,日本進(jìn)行了相關(guān)研究[1],對于國內(nèi)開發(fā)新型治療肽、治療氧化應(yīng)激和相關(guān)疾病、促進(jìn)駱駝乳產(chǎn)業(yè)的發(fā)展,具有重要的啟發(fā)和參考價(jià)值。
將生鮮駱駝乳在10 ℃、5 000 r/min條件下離心30 min,移除脂肪,上清液通過三層紗布過濾后獲得駱駝乳蛋白(CMP)。一部分CMP凍干保存,其余部分用10%醋酸溶液攪拌均勻至pH值為4.6,30 ℃、5 000 r/min離心10 min。對于再懸浮顆粒(酪蛋白)和上清液(乳清蛋白),用1000 MWCO(分子量篩截)管進(jìn)行透析、凍干,獲得駱駝酪蛋白(CCP)和駱駝乳清蛋白(CWP)。在鹽酸溶液(pH值為3.0)中,按50∶1(質(zhì)量比)將蛋白質(zhì)與(豬的)胃蛋白酶混合,37 ℃培養(yǎng)2 h后,85 ℃加熱5 min,胃蛋白酶被滅活;室溫下3 000 r/min離心10 min,將上清液pH值調(diào)至7.0,冷凍干燥。通過SDS-PAGE(十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳)還原,分析駱駝酪蛋白(CCP)和駱駝乳清蛋白(CWP)消化液的水解程度;用考馬斯亮藍(lán)(CBB)觀察蛋白質(zhì)條帶;用反相高效液相色譜法(RP-HPLC)對水解物進(jìn)行純化,采取C18色譜柱,梯度洗脫,214 nm處監(jiān)控多肽的洗脫情況,收集多肽,真空干燥,使用時(shí)按所需濃度在蒸餾水中重新懸浮。
評定抗氧化活性有兩種方法,即過氧化物清除法和2,2-二苯基-1-吡啶酰肼(DPPH)介導(dǎo)還原試驗(yàn)。前者是通過四唑氮藍(lán)(NBT)為探針的黃嘌呤氧化酶(XOD)將黃嘌呤轉(zhuǎn)化成尿酸,用此過程中產(chǎn)生的過氧化物來評定過氧化物清除活性,其清除能力用過氧化物還原NBT的程度表示,并在562 nm處測定分光光度值。具體操作步驟如下,100 μL反應(yīng)混合物(包括40 μmol/L NBT、5 mmol/L黃嘌呤、10 mmol/L磷酸鈉緩沖液系列濃度蛋白質(zhì)或多肽,pH值為8.0)置于96 孔培養(yǎng)板中,對照組不加測試樣;加入100μL XOD(5 mU),在562 nm(37℃)處,通過超高速生物軌跡II微型平板閱讀器(瑞典)監(jiān)測反應(yīng)動(dòng)力學(xué)20 min,減去空白值,結(jié)果用吸光度值的變化表示;每個(gè)樣品有3 個(gè)平行,并重復(fù)測定2次。后者的操作步驟為,在薄層色譜板(5 cm×7.5 cm,德國)涂上6 μL蛋白質(zhì)或多肽,晾干;噴涂含DPPH(1.8 mmol/L)的乙醇溶液;當(dāng)含有清除的DPPH時(shí),紫色背景會(huì)出現(xiàn)白色斑點(diǎn)。
將生長于酵母浸出液蛋白胨葡萄糖(YPD)肉湯培養(yǎng)基中的釀酒酵母(YNN27)細(xì)胞懸浮于肉湯培養(yǎng)基中形成酵母懸浮液,將多肽(200 μg/mL)置于酵母懸浮液中,28 ℃培養(yǎng)1 h;加入2 mmol/L的過氧化氫(H2O2),將培養(yǎng)時(shí)間延長至48 h;在含有2 mmol/L過氧化氫(H2O2)的YPD瓊脂平板上涂10 μL稀釋培養(yǎng)物,28 ℃培養(yǎng)72 h后估算酵母菌落數(shù),用CFU/mL表示。
將2 μL多肽溶液與2 μL α-氰基-4-羥基肉桂酸(α-HCCA)基質(zhì)飽和溶液混合到靶板上并風(fēng)干,在1 000~3 200 Da質(zhì)量范圍內(nèi),采取正反射模式,用自彎曲速度質(zhì)譜儀進(jìn)行分析,通過對每個(gè)高峰值的主要前體離子進(jìn)行MS/MS分析,鑒別多肽序列。
用天冬氨酸蛋白酶(胃蛋白酶)分別水解CMP、CCP和CWP 2 h,凍干前進(jìn)行透析,分析水解物對SDS-PAGE的還原作用。結(jié)果顯示,CWP與CCP充分分離,所有蛋白質(zhì)(CMP、CCP、CWP)被完全水解成分子量小于8 000 Da的肽;完整的蛋白質(zhì)(CMP、CCP、CWP)顯著減少了藍(lán)二甲醛的形成,表明其具有清除過氧化物的能力,其中CWP清除過氧化物的能力最強(qiáng),DPPH還原的結(jié)果與清除過氧化物的結(jié)果一致;CCP水解物比其完整蛋白質(zhì)具有更強(qiáng)的清除過氧化物能力,CWP水解物清除過氧化物的能力與其完整蛋白質(zhì)一致;CMP、CWP、CCP的水解物展示了顯著的DPPH還原能力(產(chǎn)生了更強(qiáng)烈的白斑)。因此,它們不僅具有清除過氧化物能力,還具有還原自由基DPPH能力。
用RP-HPLC法,采取C18色譜柱將CMP、CWP和CCP的多肽分為4 個(gè)亞組分肽,命名為P1~P4。亞組分P1和P2稱為快速洗脫肽(親水),P3和P4則為慢速洗脫肽(疏水)。在濃度為40 μg/mL時(shí),CMP的所有亞組分肽比其水解物都具有更強(qiáng)的清除活性;無論洗脫時(shí)間長短,CWP的亞組分肽都顯示出最強(qiáng)的清除活性;CMP和CCP的亞組分肽則顯示出從強(qiáng)(P1、P3)到中等(P2、P4)的變化。在各種蛋白質(zhì)中,快速洗脫肽(P1、P2)表現(xiàn)出比慢速洗脫肽更強(qiáng)的DPPH還原能力;CMP和CWP的亞組分肽(P1、P2、P3)表現(xiàn)出比CCP亞組分肽更顯著的DPPH還原能力。因此,快速洗脫肽(親水)是比慢速洗脫肽(疏水)更強(qiáng)的抗氧化劑。
將真核釀酒酵母菌細(xì)胞和駱駝乳多肽共同培養(yǎng),然后置于含2 mmol/L H2O2的瓊脂板中,觀察細(xì)胞存活情況。與對照組相比,各種蛋白質(zhì)(CMP、CWP和CCP)亞組分肽的存活率(log CFU/mL)顯著提高;CWP快速洗脫肽的存活率比慢速洗脫肽高,CMP和CCP慢速洗脫肽的存活率更高。胃蛋白酶使CMP釋放出不同的抗氧化肽,其中許多作為胞內(nèi)抗氧化肽起作用,說明某些抗氧化肽具有調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)氧化還原狀態(tài)能力,從而使活細(xì)胞對氧化應(yīng)激產(chǎn)生耐受性。這些抗氧化肽很有可能會(huì)產(chǎn)生短暫的保護(hù)作用,以抵御隨后的氧化狀態(tài)。
CCP水解物在活性高峰值組分(P1、P2、P3)中含有14 個(gè)肽,質(zhì)量范圍為913.12~2 951.68 m/z。CWP水解物在活性高峰值組分(P1、P2)中含有8 個(gè)肽,質(zhì)量范圍為1 168.52~1 861.14 m/z。在酪蛋白中,αs1-酪蛋白、αs2-酪蛋白和κ-酪蛋白基本上不會(huì)產(chǎn)生肽,但β-酪蛋白能夠產(chǎn)生許多肽。在乳清中,乳磷蛋白和富含半胱氨酸的蛋白質(zhì)基本上不會(huì)產(chǎn)生肽,肽主要來自于乳鐵蛋白。
總之,對駱駝乳蛋白質(zhì)組分進(jìn)行消化水解,可以釋放抗氧化肽。雖然酪蛋白水解物產(chǎn)生了大量具有不同抗氧化能力的肽,但從乳清水解液中提取的肽比酪蛋白具有更高的過氧化物清除能力。酪蛋白肽(特別是高峰值P1中的酪蛋白肽)比乳清中的肽更能有效地降低DPPH還原能力。酪蛋白肽和乳清肽對H2O2脅迫的酵母細(xì)胞具有顯著的保護(hù)作用。駱駝乳蛋白肽很可能參與了質(zhì)子與自由基的交換,因此具有抗氧化能力。
中國是雙駝峰的發(fā)源地和主要產(chǎn)地之一。全國約有駱駝20.5 萬峰左右,主要分布在內(nèi)蒙古、新疆、青海、甘肅、寧夏等省區(qū)約110 萬km2的干旱草原上?!度珖虡I(yè)發(fā)展規(guī)劃(2016-2020)》中鼓勵(lì)發(fā)展特種乳產(chǎn)業(yè),豐富乳品市場,以滿足人們生活水平日益提高對多種乳品的需要[2]。
駱駝的胃有三個(gè)胃室,第一室有20~30 個(gè)小氣泡,稱為“水脬”,可在飲水充足時(shí)儲(chǔ)存水分;第二室儲(chǔ)存草料等食物;第三室胃囊具有消化吸收功能。脂肪主要在駝峰聚集,而皮下沒有脂肪。駱駝是所有動(dòng)物中水轉(zhuǎn)換量最低的動(dòng)物,它能調(diào)整結(jié)腸水的吸收量及腎的排泄量,也不需要通過排汗來調(diào)節(jié)體溫。傳統(tǒng)放牧下的駱駝喜歡食用荒漠或半荒漠地區(qū)生長的(多刺)灌木和半灌木,能夠適應(yīng)低蛋白質(zhì)飼料,對干物質(zhì)、粗纖維及粗蛋白的消化能力比較強(qiáng)[3]。雙峰駱駝(母)的平均泌乳期是14~16 個(gè)月,泌乳期內(nèi)產(chǎn)奶量為1 254 kg。新鮮駱駝乳的pH值為6.5~6.7,含脂肪2.8 7%~5.3 8%、無脂固形物3.70%~10.36%、蛋白質(zhì)3.0%~4.0%、乳糖3.4%~5.8%[4]。駱駝乳粉與雙歧桿菌結(jié)合,可輔助治療糖尿病[5]。
因此,駱駝已經(jīng)進(jìn)入學(xué)者的研究范圍,無論藥用還是食用,駱駝乳均具有開發(fā)潛力。通過加大輿論宣傳和政策扶持,必定會(huì)促進(jìn)駱駝(舍飼)養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展。C