海寶，祝斌，劉曉光,*

(1. 北京大學第三醫(yī)院骨科， 北京 100191； 2. 北京大學第三醫(yī)院疼痛醫(yī)學中心， 北京 100191)

在一生中，大多數(shù)人都經(jīng)歷過腰痛的折磨，不僅影響人們的工作和生活質(zhì)量，還會給經(jīng)濟發(fā)展帶來嚴重負擔，據(jù)統(tǒng)計腰痛每年會給全球經(jīng)濟造成超過700億歐元的損失[1]。雖然發(fā)生腰痛的確切因素仍不明確，但研究表明至少40%的腰痛與椎間盤退變密切相關[2]。隨著社會快速發(fā)展和工作強度的增高，椎間盤退變具有年輕化的趨勢。因此，對于椎間盤退變發(fā)病機制的研究尤為重要。

動物模型是生物醫(yī)學研究領域的一種重要工具，針對特定疾病開發(fā)的動物模型是研究發(fā)病機制與驗證治療有效性的可靠手段，在臨床前研究中具有不可替代的作用。本文將對近年來在椎間盤退變研究中所應用的動物模型進行綜述，以期為椎間盤退變的防治研究提供更進一步的理論基礎與實驗載體。

1 結構損傷模型

1.1 損傷髓核與纖維環(huán)

細針穿刺法是目前許多椎間盤退變研究的首選方法，因為它操作簡便、易行且重復性較高。Masuda等[3]嘗試在兔纖維環(huán)上使用不同規(guī)格的穿刺針(16G，18G和21G)進行穿刺，成功建立了一種能夠?qū)е伦甸g盤高度與MRI分級均下降的椎間盤退變動物模型。研究者還對穿刺損傷模型中所應用的兩種不同規(guī)格的針頭進行了比較，通過影像學和組織學觀察顯示，與25G針相比，21G針刺引起的椎間盤退變更為嚴重，且椎間盤突出的發(fā)生率與針頭大小成比例[4-5]。此外，Ulrich等[6]將椎間盤穿刺損傷的次數(shù)與炎癥反應進行了比較，發(fā)現(xiàn)多次損傷的椎間盤中，髓核被膠原蛋白和炎癥細胞因子所替代，而單次穿刺椎間盤中的炎癥相對短暫且僅局限于傷口處。表明反復損傷加速椎間盤退變且與炎癥反應相關。

髓核切除法亦能夠誘導椎間盤退變的發(fā)生。Kim等[7]用顯微手術鉆取出大鼠椎間盤中的髓核組織，術后9周發(fā)現(xiàn)蛋白多糖的表達和椎間盤高度均降低。此外，有研究通過微創(chuàng)手術在大動物模型中進行嘗試。Omlor等[8]在小型豬中用16G活檢套管切除了10%的髓核組織構建椎間盤退變模型，并在術后3周觀察到椎間盤高度丟失和基質(zhì)成分的變化。Xi等[9]通過經(jīng)皮穿刺椎間盤在恒河猴中發(fā)現(xiàn)了進行性椎間盤退變發(fā)生。Yoon等[10]在透視下穿刺小型豬的腰椎，與未穿刺的椎間盤相比，在5周時觀察到受損椎間盤的早期變性，并用MRI和組織學證實了椎間盤的進行性退變。這些方法為椎間盤退變的研究提供了更多的選擇，但由于存在血管和神經(jīng)損傷的風險及穿刺部位和深度等技術難度，小型嚙齒動物中的模型相比更容易推廣。

1.2 破壞軟骨終板

終板是維持椎間盤結構和供應營養(yǎng)的重要組成部分。Yuan等[11]報道了一種大鼠終板缺血誘導的椎間盤退變模型，該研究通過在大鼠尾椎間盤內(nèi)注射無水酒精造模。發(fā)現(xiàn)髓核細胞首先由液泡細胞類型變?yōu)檐浌羌毎麡蛹毎?，然后變?yōu)槔w維軟骨細胞。進而纖維環(huán)發(fā)生破裂，終板的生長板退化并最終消失。Wei等[12-13]在CT引導下將平陽霉素(在兔中)或博來霉素(在恒河猴中)經(jīng)皮注射到鄰近椎間盤的軟骨下骨中。術后觀察到椎間盤間隙逐漸變窄，MRI信號消失，并伴有骨性終板的生成。國內(nèi)也有研究者將針刺法、終板注射法與二者聯(lián)合進行對比，發(fā)現(xiàn)終板注射較針刺更早引起椎間盤的退變[14]。

在犬模型中，研究者[15]通過椎體終板注射骨水泥來封閉終板對髓核的血供通道，通過MRI和組織學等方法觀察發(fā)現(xiàn)實驗組與對照組相比，椎間盤間隙及大體形態(tài)在兩組之間沒有檢測到明顯的差異。相比之下，Kang等[16]在用骨水泥阻塞小型豬椎間盤終板時檢測到顯著的椎間盤退變發(fā)生，且退變程度比穿刺誘導纖維環(huán)損傷更重。因此，損傷軟骨終板的動物研究模型結果差異較大，仍需要進一步深入探索。

1.3 化學誘導

目前，多種生化試劑已被用于誘導椎間盤退變的動物模型。Sugimura等[17]在猴身上比較了不同種類的酶誘導椎間盤退變的區(qū)別。該研究表明，軟骨素酶ABC和木瓜凝乳蛋白酶均能誘導退行性變化，但前者對非軟骨組織的毒性低于木瓜凝乳蛋白酶。Norcross等[18]將軟骨素酶ABC注射到大鼠尾椎間盤中，觀察發(fā)現(xiàn)椎間盤高度顯著降低，蛋白多糖和髓核細胞明顯減少。然而，與對照相比，軟骨素酶ABC組中髓核的硬度增加。在山羊模型中，Hoogendoorn等[19]注射軟骨素酶ABC在18周內(nèi)成功誘導出了椎間盤退變的發(fā)生。

注射誘導椎間盤退變還有其他一些試劑。例如Anderson等[20]向兔椎間盤中加入N-末端纖連蛋白片段導致骨贅形成，正常椎間盤結構的進行性喪失以及合成代謝的降低。Oegema等[21]研究表明在退化的人體椎間盤中纖維連接蛋白片段增加，基質(zhì)的降解進一步增強。Lee等[22]將弗氏不完全佐劑(CFA)注射到大鼠椎間盤后，CFA組大鼠表現(xiàn)為后肢退縮反應，進行性椎間盤退變及疼痛相關的介質(zhì)表達增多。Zhou等[23]將5-溴脫氧尿苷(BrdU)經(jīng)皮注射到綿羊椎間盤中評估椎間盤退變，發(fā)現(xiàn)椎間盤的進行性退變需長達14周。

化學誘導椎間盤退變需要將特定材料注射入椎間盤內(nèi)，因此用于輸送酶、試劑或生長因子的注射針本身可能會對椎間盤造成損害，因此注射針的大小及穿刺深度需要嚴格控制。

2 應力改變模型

生物力學在椎間盤穩(wěn)態(tài)中起著至關重要的作用，機械負荷是椎間盤退變的主要原因之一。因此，在重體力勞動者中，椎間盤退變的風險明顯增加[24]。而慢跑和游泳等運動對維持椎間盤的健康形態(tài)存在有益的作用[25]。外源性改變脊柱的機械環(huán)境會導致椎間盤的形態(tài)和生化特性發(fā)生變化，這些變化類似于人類椎間盤退變中的早期階段[26]。

Kroeber等[27]使用定制的外部加載裝置對兔子的腰椎施加軸向載荷，在加載壓力14 d后，椎間盤表現(xiàn)出典型的退行性表現(xiàn)：椎間隙變窄、纖維環(huán)和終板的死亡細胞數(shù)目增加。卸載裝置28 d后，這些變化變現(xiàn)為不可逆轉(zhuǎn)。在鼠尾椎間盤模型中，動態(tài)加載兩周后導致椎間盤的高度和角度順應性降低[28]。髓核與纖維環(huán)對力學加載時間與頻率的反應并不相同，Kim等[29]觀察到大鼠尾椎間盤動態(tài)加載1 h后COMP和II型膠原基因表達發(fā)生變化。也有研究指出在頻率為0.01 Hz的加載時，髓核的合成代謝基因表達升高；但在1 Hz時分解代謝基因增加[30]。

靜態(tài)壓縮能夠引起椎間盤組成和機械性能的退行性變化，細胞數(shù)量隨加載頻率和大小成比例的減少[31]。徐海棟等[32]研究表明靜態(tài)加壓組的病理分級明顯高于針刺組。在靜態(tài)壓縮模型中觀察到MMP和ADAMT-4的上調(diào)以及聚集蛋白聚糖和II型膠原的減少[33-35]。機械負荷也會引起大動物的椎間盤退變發(fā)生。Hutton等[36]將螺旋彈簧安裝到犬的腰椎上，分別在16和27周的髓核基質(zhì)中觀察到I型膠原增加，而蛋白多糖和II型膠原減少。此外，壓縮模型也能夠誘發(fā)炎癥的發(fā)生。Miyagi等[37]比較大鼠椎間盤動態(tài)壓迫和損傷模型中炎癥介質(zhì)和神經(jīng)肽的表達，證明炎癥介質(zhì)(TNFα，IL-1，IL-6)和神經(jīng)肽在模型組僅在短暫升高，但壓迫組中持續(xù)長達8周。

上述動物模型中，機械負荷能夠?qū)е伦甸g盤基質(zhì)成分、酶活性、靜態(tài)和動態(tài)負荷后基因表達的變化，退變程度則取決于強度、持續(xù)時間和裝載頻率。

3 自發(fā)性模型

有些動物隨著年齡表現(xiàn)出椎間盤的變化與人類椎間盤退變具有許多共同特征。沙鼠是一種經(jīng)典的自發(fā)性椎間盤退變模型。Gruber等[38]發(fā)現(xiàn)沙鼠與年齡相關的椎間盤退行性變化。2月齡沙鼠脊柱的影像學表現(xiàn)：楔形變、椎管狹窄、椎間盤邊緣不規(guī)則、細胞死亡及軟骨終板鈣化，這恰巧也是老年人椎間盤最常見的退變過程。與2～6月齡雌性相比，雄性沙鼠的楔形變和終板鈣化的發(fā)生率更高，但到了12月齡時它們之間的差異又消失。

一些大動物也可以作為研究自發(fā)性椎間盤退變的實驗模型。Bergknut等[39]比較了軟骨營養(yǎng)不良與非軟骨營養(yǎng)不良犬的椎間盤。在年輕(<1歲)軟骨營養(yǎng)不良和5～7歲非軟骨營養(yǎng)不良的犬中觀察到椎間盤退變的跡象。Cho等[40]發(fā)現(xiàn)豬在衰老期間椎間盤細胞數(shù)和合成代謝減少，這些變化與MMP-1表達的增加有關。因此，犬和豬的椎間盤隨年齡的退變與人類相似。

最近的研究提出使用羊駝作為進一步探索自發(fā)性椎間盤退變的大動物模型[41]。羊駝不僅與人類具有類似的脊柱形態(tài)，椎間盤的大小和生物力學特性也很相似，而且隨著年齡的增長會表現(xiàn)出椎間盤退變的特征。以上研究表明，許多實驗動物均為研究自發(fā)性椎間盤退變的潛在模型。

4 基因敲除模型

近年來，隨著基因工程研究的逐漸深入，基因敲除和敲入技術的進步為多種疾病的新動物模型提供了重要機會。轉(zhuǎn)基因小鼠品系對研究椎間盤退變也有很高的實驗價值[42]。Millecamps等[43]描述了一種轉(zhuǎn)基因小鼠品系，表現(xiàn)出對軸向拉伸的耐受性低、后爪對寒冷過敏以及運動活力下降，且椎間盤退變的程度隨其年齡增長逐漸加重。Bedore等[44]報道了脊索特異性Ccn2基因敲除小鼠髓核中脊索聚糖和II型膠原蛋白減少，但I型膠原蛋白增加，同時也表現(xiàn)出CCN1和CCN3蛋白表達的減少。此外，IL-1受體拮抗劑(IL-1rn)敲除小鼠顯示分解代謝與合成代謝的改變，包括蛋白多糖和膠原結構的喪失，伴隨著基質(zhì)降解酶表達增加[45]。該發(fā)現(xiàn)與IL-1在椎間盤退變進展中的作用一致，并且表明IL-1是防治椎間盤退變的可能靶標。

Gdf8是轉(zhuǎn)化生長因子β超家族的成員之一，能夠負性調(diào)節(jié)骨骼肌的生長，Gdf8基因敲除小鼠的肌肉量是野生型小鼠的兩倍。Hamrick等[46]發(fā)現(xiàn)Gdf8基因缺陷小鼠顯示出椎間盤退變的跡象，并且甲苯胺藍染色顯示終板和內(nèi)側(cè)纖維環(huán)區(qū)域的蛋白多糖丟失與終板骨化有關。這些結果表明肌肉量、骨量與椎間盤退變的發(fā)生具有相關性。但由于基因敲除技術難度較高，同時需要復雜的操作過程及較高額的費用，該領域研究相對較少。

5 根性疼痛模型

當椎間盤退變發(fā)生時，突出的髓核不僅壓迫神經(jīng)根，還能夠誘導炎癥反應，導致根性疼痛的發(fā)生。研究人員將外源性髓核或脂肪組織植入大鼠腰5脊神經(jīng)根旁以模擬人類的根性疼痛[47]，發(fā)現(xiàn)不同組間存在熱痛覺過敏及神經(jīng)生理學改變，炎癥相關的IL-1β、IL-6與TNF表達均發(fā)生變化。周渝等[48]應用大鼠自體髓核移植加環(huán)扎神經(jīng)根的方法建立根性神經(jīng)痛模型，成功誘導出機械痛覺超敏和熱痛覺過敏的癥狀。然而，該操作技術要求較高，醫(yī)源性神經(jīng)損傷的可能性大，且動物的行為學監(jiān)測相對困難。此外，造模常采用的后路椎板切除術，容易將根性疼痛與骨性疼痛相混淆。因此，神經(jīng)壓迫引起的根性疼痛模型尚需進一步探索。

6 其他模型

Wang等[49]報道了吸煙對小鼠椎間盤退行性變的影響。指出吸煙能夠誘導細胞衰老、蛋白多糖合成減少以及總蛋白多糖含量降低，伴隨著MMP活性的升高，椎體終板孔隙度與骨質(zhì)流失增加。此外，關節(jié)硬化小鼠模型[50]及糖尿病小鼠模型[51]中均出現(xiàn)了椎間盤軟骨終板細胞代謝障礙和骨化現(xiàn)象。

7 總結與展望

椎間盤退變是一種隨著年齡增長而發(fā)生的復雜性退行性變化，構建一種完全復制該疾病的動物模型非常困難。此外，由于動物和人體的姿勢、椎間盤大小、細胞種類及椎體負荷之間解剖學差異使得尋求理想的動物模型變得更加復雜。脊索細胞在人類10歲左右時成熟并消失，或許代表著椎間盤退變的開始。與人類的椎間盤不同，脊索細胞在大多數(shù)的動物體內(nèi)能夠長期存在[52]，這可能造成了人類和動物模型之間的本質(zhì)差異。

目前，關于構建椎間盤退變的諸多方法中，尚未有能夠完全模擬人體椎間盤退變過程的理想模型。因此，在后續(xù)的研究中，我們應當努力改進以下的局限點：①細針穿刺作為研究椎間盤退變的常用手段，具有重復性高及誘導時間相對較短的優(yōu)點，但它不適用于進行早期干預。②化學誘導造模相對穩(wěn)定，但還需優(yōu)化試劑的劑量與注射深度。③機械模型適用于模擬逐漸發(fā)展的椎間盤退變，但要控制好加壓的時間和頻率。④自發(fā)性椎間盤退變模型及轉(zhuǎn)基因小鼠是目前研究椎間盤退變的有利選擇。⑤經(jīng)椎間盤后路或后外側(cè)入路的開放手術造模，因損傷椎間盤后部的肌肉韌帶復合體結構，不適用于盤源性疼痛的相關研究。

總之，雖然現(xiàn)有的動物模型都有各自的局限性，但我們可以利用不同的模型滿足不同的研究需求。后續(xù)的研究中，構建理想的椎間盤退變模型是所有研究者的共同課題，以期為椎間盤退變的機制研究和臨床治療鋪設更堅實的平臺。