繆園欣，廖明星，孫愛紅，李蓉，*

（1.荊楚理工學(xué)院生物工程學(xué)院，湖北荊門448000；2.湖北省荊門市畜牧獸醫(yī)局，湖北荊門448000）

鐵皮石斛（Dendrobium officinale）是蘭科石斛屬多年生草本植物，是我國(guó)傳統(tǒng)的名貴中草藥，素有“救命仙草”之稱[1-2]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)鐵皮石斛具有益胃生津、滋陰清熱、抗氧化、降血糖等功能，此外研究還發(fā)現(xiàn)其對(duì)心血管和免疫系統(tǒng)疾病具有顯著的療效[2-4]?；瘜W(xué)成分分析發(fā)現(xiàn)鐵皮石斛含有生物堿、水溶性多糖、黃酮等生物活性成分[5-8]。石斛屬植物一直以莖為藥，而花未被藥用。近年來(lái)，隨著鐵皮石斛大規(guī)模的種植，鐵皮石斛花產(chǎn)量急增，造成了極大的資源浪費(fèi)[9]。為了充分利用鐵皮石斛花資源，對(duì)鐵皮石斛花進(jìn)行化學(xué)成分分析，發(fā)現(xiàn)其含有較豐富多糖、浸出物及氨基酸等營(yíng)養(yǎng)成分[10-11]。多糖是一類廣泛存在于微生物、植物細(xì)胞壁和動(dòng)物細(xì)胞膜中的復(fù)雜糖類物質(zhì)，具有抗氧化、抗腫瘤、調(diào)節(jié)免疫等藥理作用[12-14]。本試驗(yàn)采用超聲波-微波協(xié)同法對(duì)鐵皮石斛花多糖的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，并對(duì)鐵皮石斛花多糖的體外抗氧化性進(jìn)行研究，為鐵皮石斛花的開發(fā)及生物活性研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

鐵皮石斛花：湖北洲和生態(tài)農(nóng)業(yè)發(fā)展有限公司；1，1-二苯基基苯肼（1，1-dipheny 1-2-picrylhydrazyl，DPPH）：Sigma公司；硫酸亞鐵、雙氧水、水楊酸、葡萄糖、濃硫酸、苯酚、乙醇：上海凌峰化學(xué)試劑有限公司；試驗(yàn)用水為離子交換水。

EG823LC5-NR型微波爐：佛山市順德區(qū)美的微波電器制造有限公司；TY-1901型分光光度計(jì)：北京普析通用儀器有限公司；YJ1002型電子天平：上海浦春計(jì)量?jī)x器有限公司；TG16-WS型低速臺(tái)式離心機(jī)：上海安亭科學(xué)儀器廠；KQ-100KDB型高功率數(shù)控超聲波清洗機(jī)：昆山市超聲儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 材料處理

取鐵皮石斛花于60℃烘箱中烘干，然后用萬(wàn)能粉碎機(jī)粉碎，經(jīng)40目篩得石斛花粉末備用。

1.2.2 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

稱取100 mg于105℃干燥至恒重的標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖，置于100 mL容量瓶中，加適量蒸餾水溶解并稀釋至刻度，搖勻備用。精密吸取葡萄糖貯備液10 mL于100 mL容量瓶，用水稀釋至刻度，得0.1 mg/mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液。分別吸取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液 0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL于10 mL具塞刻度試管中，用蒸餾水補(bǔ)至1.0 mL，加入5%苯酚1 mL，搖勻，然后立即加入5 mL濃硫酸，搖勻靜置5 min，于90℃水浴加熱20 min，然后冰浴冷卻5 min，于488 nm波長(zhǎng)處測(cè)吸光度。以葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)，以吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線[15-16]。

1.2.3 鐵皮石斛花多糖的測(cè)定

精密稱取1 g鐵皮石斛花粉，按不同的料液比加入蒸餾水，超聲波-微波協(xié)同提取一定時(shí)間。提取完成后去除濾渣、醇沉，將得到的沉淀重新溶于水，按1.2.2的方法（苯酚-硫酸法）操作測(cè)得多糖濃度，并依據(jù)下列公式計(jì)算得出多糖提取率：

式中：C為石斛花樣品中多糖的濃度，mg/mL；V為樣品溶液稀釋液體積，mL；N為稀釋倍數(shù)；m為樣品質(zhì)量，g。

1.2.4 鐵皮石斛花多糖提取工藝優(yōu)化試驗(yàn)

1.2.4.1 料液比對(duì)多糖提取率的影響

準(zhǔn)確稱取 1.000 g樣品，分別按 1∶20、1∶30、1∶40、1 ∶50、1 ∶60（g/mL）的料液比加入蒸餾水，超聲處理35 min，再在350 W微波功率下提取5 min。提取結(jié)束后定容，測(cè)定吸光度，并計(jì)算石斛花多糖提取率。

1.2.4.2 微波時(shí)間對(duì)多糖提取率的影響

準(zhǔn)確稱取1.000 g樣品，按1∶40（g/mL）的料液比加入蒸餾水，超聲處理35 min，再分別在350 W微波功率下提取 1、3、5、7、9 min。提取結(jié)束后定容，測(cè)定吸光度，并計(jì)算石斛花多糖提取率。

1.2.4.3 超聲時(shí)間對(duì)多糖提取率的影響

準(zhǔn)確稱取1.000 g樣品，按1∶40（g/mL）的料液比加入蒸餾水，分別超聲處理 15、25、35、45、55 min，再在350 W微波功率下提取5 min。提取結(jié)束后定容，測(cè)定吸光度，并計(jì)算石斛花多糖提取率。

1.2.4.4 微波功率對(duì)多糖提取率的影響

準(zhǔn)確稱取1.000 g樣品，按1∶40（g/mL）的料液比加入蒸餾水，超聲處理45 min，再分別在250、300、350、400、450 W微波功率下提取5 min。提取結(jié)束后定容，測(cè)定吸光度，并計(jì)算石斛花多糖提取率。

1.2.5 提取工藝優(yōu)化正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

為了確定最佳提取條件，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以石斛花多糖提取率為試驗(yàn)指標(biāo)，設(shè)計(jì)L9（34）正交試驗(yàn)，對(duì)料水比、微波時(shí)間、超聲時(shí)間、微波功率4個(gè)因素在3個(gè)不同水平上進(jìn)行優(yōu)化試驗(yàn)，因素與水平見表1。

表1 多糖提取工藝條件優(yōu)化正交試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiment for polysaccharides extracting conditions optimization

1.2.6 鐵皮石斛花多糖體外抗氧化活性測(cè)定

1.2.6.1 DPPH自由基清除能力測(cè)定

取 2 mL 不 同濃 度（0.05、0.1、0.15、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mg/mL）的鐵皮石斛花多糖溶液于試管中，分別加入2.0 mL 0.1 mmol/L DPPH溶液，充分混勻后避光反應(yīng)20 min，在517 nm處測(cè)定吸光度為Ai，VC做陽(yáng)性對(duì)照；對(duì)照組以無(wú)水乙醇代替DPPH，測(cè)定吸光度Aj；空白組以蒸餾水代替多糖溶液，測(cè)定吸光度為A0[17]。

DPPH自由基清除率/%=[A0-Ai+Aj]/A0×100

1.2.6.2 羥基自由基清除能力測(cè)定

取 2 mL 不同 濃 度（0.05、0.1、0.15、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mg/mL）的石斛花多糖溶液，加入 2.0 mL 6 mmol硫酸亞鐵、2.0 mL 6 mmol/mL雙氧水，混勻后靜置10 min，各加入2.0 mL 6 mmol水楊酸，混勻后再靜置30 min，于510 nm處測(cè)吸光度Ai。以蒸餾水代替水楊酸測(cè)吸光值A(chǔ)j，空白對(duì)照以2.0 mL蒸餾水代替石斛花多糖溶液測(cè)定吸光度A0[18]。

羥基自由基清除率/%=[A0-Ai+Aj]/A0×100

2 結(jié)果與分析

2.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線及回歸方程

以葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液濃度（mg/mL）為橫坐標(biāo)，吸光度（A）為縱坐標(biāo)，繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1。

圖1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of glucose

根據(jù)圖1，求得回歸方程A=8.941 4C-0.012 2。式中：C為葡萄糖含量，mg/mL；A為吸光度。相關(guān)系數(shù)R2為0.999 3，表明在該濃度范圍內(nèi)葡萄糖濃度與吸光度線性關(guān)系良好。

2.2 鐵皮石斛花多糖提取單因素試驗(yàn)

2.2.1 料液比對(duì)鐵皮石斛花多糖提取率的影響

料液比對(duì)鐵皮石斛花多糖提取率的影響見圖2。

圖2 料液比對(duì)多糖提取率的影響Fig.2 Impact of solid-liquid ratio on the extraction rate of polysaccharides

由圖 2 可知，料液比在 1 ∶20（g/mL）～1 ∶40（g/mL）范圍內(nèi)，隨著溶劑的增加，固液接觸面積增加，多糖提取率提高；此后，繼續(xù)增加溶劑，由于單位體積溶劑吸收的超聲波、微波能量減少，溫度升高變慢不利于提取溶出[19]，多糖提取率呈下降趨勢(shì)。因此，鐵皮石斛花多糖提取時(shí)的最佳料液比為1∶40（g/mL）。

2.2.2 微波時(shí)間對(duì)鐵皮石斛花多糖提取率的影響

微波時(shí)間對(duì)鐵皮石斛花多糖提取率的影響見圖3。

圖3 微波時(shí)間對(duì)多糖提取率的影響Fig.3 Impact of microwave time on the extraction rate of polysaccharides

由圖3可知，微波時(shí)間在1 min～5 min范圍內(nèi)，隨著微波時(shí)間的增加，鐵皮石斛花多糖提取率呈增加趨勢(shì)；當(dāng)微波時(shí)間超過(guò)5 min時(shí)，由于長(zhǎng)時(shí)間高溫作用，部分多糖結(jié)構(gòu)被破壞，多糖提取率降低。因此，微波時(shí)間選擇5 min較為適宜，該條件下的鐵皮石斛花多糖具有較高的提取率。

2.2.3 超聲時(shí)間對(duì)多糖提取率的影響

超聲時(shí)間對(duì)多糖提取率的影響見圖4。

圖4 超聲時(shí)間對(duì)多糖提取率的影響Fig.4 Impact of ultrasonic time on the extraction rate of polysaccharides

由圖4可知，超聲時(shí)間在15 min～45 min范圍內(nèi)，鐵皮石斛花多糖提取率隨超聲時(shí)間的延長(zhǎng)而增加；當(dāng)超聲時(shí)間超過(guò)45 min時(shí)，由于長(zhǎng)時(shí)間的空化作用和機(jī)械振動(dòng)作用破壞了部分多糖結(jié)構(gòu)，多糖提取率下降。因此，鐵皮石斛花多糖提取的最佳超聲時(shí)間為45 min。

2.2.4 微波功率對(duì)多糖提取率的影響

微波功率對(duì)多糖提取率的影響見圖5。

由圖5可知，微波功率在250 W～400 W范圍內(nèi)，隨著微波功率的增加，物質(zhì)吸收微波能越多，有效成分浸出約多，鐵皮石斛花多糖提取率逐漸增加；此后，繼續(xù)升高微波功率，部分多糖在高功率作用下分解，多糖提取率下降。因此，選擇微波功率400 W為最佳微波功率。

圖5 微波功率對(duì)多糖提取率的影響Fig.5 Impact of microwave power on the extraction rate of polysaccharides

2.3 提取工藝優(yōu)化正交試驗(yàn)

為確定最佳提取條件，在單因素的基礎(chǔ)上，研究超聲時(shí)間、料液比、微波時(shí)間、微波功率對(duì)鐵皮石斛花多糖提取的影響，以石斛花多糖提取率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，進(jìn)行L9（34）正交試驗(yàn)。正交試驗(yàn)結(jié)果見表2，方差分析結(jié)果見表3。

表2 提取工藝條件優(yōu)化正交試驗(yàn)結(jié)果與分析Table 2 Results and analysis of orthogonal experiments for extraction conditions optimization

表3 正交試驗(yàn)結(jié)果方差分析Table 3 Variance analysis of orthogonal experiments results

通過(guò)表3中提取率的極差分析結(jié)果可知，影響提取率的各因素主次順序?yàn)槌晻r(shí)間＞料液比＞微波功率＞微波時(shí)間。試驗(yàn)指標(biāo)提取率越大越好，從k值得出使石斛花多糖提取最佳的工藝條件為A3B3C1D3，即超聲時(shí)間為 55 min，料液比為 1 ∶50（g/mL），微波時(shí)間為3 min，微波功率為450 W，在此條件下石斛花多糖提取率最高，為7.22%。由表3方差分析結(jié)果可知，因素A、B、D對(duì)石斛花多糖提取率有極顯著影響（P＜0.01），因素C對(duì)石斛花多糖提取率無(wú)顯著影響（P＞0.05），對(duì)多糖提取率影響的主次順序?yàn)锳＞B＞D＞C，即超聲時(shí)間＞料液比＞微波功率＞微波時(shí)間，與直觀分析結(jié)果一致。

2.4 鐵皮石斛花多糖體外抗氧化活性測(cè)定

2.4.1 清除DPPH自由基能力的測(cè)定

清除DPPH自由基能力的測(cè)定結(jié)果見圖6。

圖6 石斛花多糖對(duì)DPPH自由基清除率曲線Fig.6 Scavening curves of the polysaccharides from flowers of Dendrobium officinale DPPH radicals

在最優(yōu)的超聲波-微波提取工藝下提取石斛花多糖，并對(duì)多糖進(jìn)行清除DPPH自由基的活性測(cè)定，由圖6可知石斛花多糖對(duì)DPPH自由基的清除率呈現(xiàn)濃度依賴性，隨著多糖濃度的增加，清除率增加。

2.4.2 清除羥自由基能力的測(cè)定

清除羥自由基能力的測(cè)定結(jié)果見圖7。

圖7 石斛花多糖對(duì)羥自由基清除率曲線Fig.7 Scavening curves of the polysaccharides from flowers of Dendrobium officinale OH radicals

由圖7可知，石斛花多糖對(duì)羥自由基的清除率具有濃度依賴性，清除率隨濃度的增加而增加。

3 結(jié)論

本研究探討了鐵皮石斛花多糖的提取工藝，結(jié)果表明，各因素影響鐵皮石斛花多糖提取率的主次順序?yàn)椋撼晻r(shí)間＞料液比＞微波功率＞微波時(shí)間。通過(guò)單因素試驗(yàn)及正交試驗(yàn)確定超聲波-微波協(xié)同提取鐵皮石斛花多糖的最佳工藝條件為：超聲時(shí)間為55 min，料液比為1∶50（g/mL），微波時(shí)間為3 min，微波功率為450 W，在此條件下鐵皮石斛花多糖提取率為7.22%。對(duì)超聲波-微波協(xié)同提取的鐵皮石斛花多糖進(jìn)行活性研究，發(fā)現(xiàn)鐵皮石斛花多糖有較好的抗氧化活性。這為鐵皮石斛花的深入研究及開發(fā)利用提供了一定的理論參考。