張文平 楊 臻 吳佩佳 李依揚 程 新 李昆太

(江西農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，江西南昌 330045)

近年來，隨著現(xiàn)代農(nóng)業(yè)生產(chǎn)強度的增加，以及農(nóng)藥化肥的大量使用，導(dǎo)致土壤生態(tài)環(huán)境急劇惡化，土壤酸化、鹽漬化等問題日益嚴重[1-2]。據(jù)報道，我國土壤酸化的總面積高達2.04×108hm2，約占全國土壤面積的22.7%[3]；土壤鹽漬土壤面積約達3 600萬hm2，占全國可利用土地面積的4.88%[4]。土壤環(huán)境的不斷惡化使農(nóng)作物生產(chǎn)受到巨大威脅，特別是水稻等主要糧食作物受土壤環(huán)境變化的影響較大[5]。因此，如何提高水稻等作物的抗逆性已成為研究熱點之一。研究表明，改良土壤[6]、平衡施肥[7]、生物誘導(dǎo)[8]等方式均對提高水稻抗逆性有較好的效果。目前，關(guān)于添加外源物質(zhì)來提高作物的抗逆性的研究已有大量報道，其中微生物多糖在促進種子萌發(fā)、幼苗生長以及增強作物抗逆性等方面的調(diào)節(jié)作用越來越受到人們的關(guān)注[9]。微生物胞外多糖能夠提高作物在不同逆境脅迫下的抗逆性已在高粱[10]、小麥[11]、煙草[12]等作物上得到證實，而其對水稻生長發(fā)育的影響研究尚鮮見報道。

水稻(Oryza sativa)種子萌發(fā)期的生長狀況對水稻后期的生長發(fā)育及產(chǎn)量有著重要影響[13]，而通過添加微生物多糖來增強水稻對酸、鹽等脅迫條件的抵抗能力，對提高水稻的生長和產(chǎn)量具有重要意義。因此，本研究以乳酸菌(Lactobacillus plantarum)胞外多糖為試驗對象，研究其對酸、鹽脅迫下水稻種子萌發(fā)的影響，并通過酶學(xué)測定等方法初步闡明胞外多糖誘導(dǎo)水稻抵御酸、鹽脅迫條件的作用機制，以期為穩(wěn)定和提高脅迫條件下水稻生長和產(chǎn)量提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試菌株:植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)，由江西農(nóng)業(yè)大學(xué)微生物資源與利用實驗室提供。

供試水稻品種:準兩優(yōu)608，由湖南隆平種業(yè)有限公司提供。種子用5%NaClO消毒10 min，然后用蒸餾水沖洗6次，備用。

改良MRS培養(yǎng)基:用蔗糖替代MRS培養(yǎng)基[14]中葡萄糖，其他成分保持與MRS培養(yǎng)基一致。

1.2 試驗設(shè)計

1.2.1 胞外多糖的制備及含量測定 將活化的植物乳桿菌接種于改良的MRS培養(yǎng)基中，于37℃發(fā)酵24 h。參照Rimada等[15]的方法進行粗多糖提取，然后采用硫酸-苯酚法[16]測定胞外多糖含量。

葡萄糖標準曲線的繪制:取0～0.2 mg·mL-1不同濃度葡萄糖標準溶液各2 mL，加入2 mL 6%苯酚溶液，再加入濃硫酸10 mL，搖勻，冷卻后利用UV759紫外可見分光光度計(上海佑科儀器儀表有限公司)于490 nm波長處測定吸光度，樣品適當(dāng)稀釋后參照標準曲線方法進行胞外多糖含量的測定。

1.2.2 脅迫處理 酸、鹽2個脅迫因子分別為pH值3.0的H2SO4溶液和7.0 mg·mL-1NaCl溶液。設(shè)胞外多糖處理濃度分別為 0、2、20、200、2 000 mg·L-1。 將消毒的水稻種子分別放入不同濃度的多糖溶液中，于室溫下浸種24 h，然后用蒸餾水沖洗種子并晾干，將種子置于鋪有兩層無菌濾紙的培養(yǎng)皿(直徑9 cm)中，每個培養(yǎng)皿30粒種子。按照上述條件分別進行酸、鹽脅迫，然后將培養(yǎng)皿置于28℃培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)，以無脅迫處理作為對照(CK)，每個處理設(shè)3次重復(fù)。培養(yǎng)期間每日觀察并記錄種子發(fā)芽情況，定期更換培養(yǎng)液，以保證脅迫環(huán)境不變，培養(yǎng)至第8天時，測定水稻幼苗形態(tài)指標和生理指標。

1.3 測定項目與方法

1.3.1 形態(tài)指標的測定 培養(yǎng)時期每天記錄水稻種子萌發(fā)數(shù)量，第3天統(tǒng)計種子發(fā)芽勢，第8天統(tǒng)計種子發(fā)芽率并測定水稻幼苗的根長、芽長、根鮮重和芽鮮重(根鮮重、芽鮮重按皿計算)。按照下列公式計算發(fā)芽勢、發(fā)芽率及發(fā)芽指數(shù):

式中，Gt:t日的發(fā)芽種子數(shù)；Dt:發(fā)芽天數(shù)。同時將經(jīng)過以上處理的發(fā)芽的種子播種于塑料培養(yǎng)盒進行苗期生長，分別于第10和第20天測定形態(tài)指標。

1.3.2 生理指標的測定 丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量:采用硫代巴比妥酸(thiobarbituric acid，TBA)法[17]測定 MDA含量。先用蒸餾水，再用去離子水將水稻幼芽沖洗干凈，用濾紙吸干表面水分，稱取0.2 g，加入10 mL 10%三氯乙酸和少量石英砂，在冰浴中研磨成勻漿，于4℃下4 000 r·min-1離心10 min，上清液即為提取液，用于MDA含量的測定。

抗氧化酶活性:稱取0.5 g洗凈的水稻幼芽，剪碎后置于預(yù)冷的研缽中，加入預(yù)冷的0.05 mol·L-1磷酸緩沖液5 mL(pH值7.8，2%聚乙烯吡咯烷酮)及少量石英砂，冰浴研磨成勻漿，4℃下 10 000 r·min-1離心 15 min，上清液即粗酶液，用 0.05 mol·L-1磷酸緩沖液定容至10 mL，然后分別采用雙氧水法測定過氧化氫酶(catalase，CAT)活性；愈創(chuàng)木酚法測定過氧化物酶(peroxidase，POD)活性；氮藍四唑比色法測定超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)活性[18]。

上述指標每個處理均設(shè)3個重復(fù)。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Origin 8.5、DPS 7.5軟件進行統(tǒng)計分析和差異顯著性檢驗，對不同處理的數(shù)據(jù)進行單因素方差分析和Duncan多重比較。

表中數(shù)據(jù)均為平均值±標準差。圖、表中不同小寫字母表示不同處理間在α=0.05水平上差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 酸脅迫下胞外多糖對水稻種子萌發(fā)及生理特性的影響

2.1.1 酸脅迫下胞外多糖對水稻種子萌發(fā)的影響由表1可知，與CK相比，酸脅迫對水稻種子的發(fā)芽率、發(fā)芽勢及發(fā)芽指數(shù)均有顯著的抑制作用(P＜0.05)，而胞外多糖溶液浸種對酸脅迫下水稻種子的萌發(fā)具有促進作用。隨著胞外多糖濃度的增加，種子的發(fā)芽勢、發(fā)芽率及發(fā)芽指數(shù)均呈先增加后降低的趨勢。其中20 mg·L-1胞外多糖對發(fā)芽勢的促進作用最為明顯，與酸脅迫下不添加胞外多糖相比，提高了186.9%，而與無脅迫處理(CK)相比，僅降低7.0%。200 mg·L-1胞外多糖處理的發(fā)芽率最高達到92.50%，發(fā)芽指數(shù)也為最大，與酸脅迫下不添加胞外多糖相比，發(fā)芽率提高了38.7%。當(dāng)多糖濃度增加達到 2 000 mg·L-1時，對水稻種子萌發(fā)的促進作用略有降低，但仍具有顯著改善脅迫的效果。

表1 不同濃度胞外多糖對酸脅迫下水稻種子萌發(fā)的影響Table1 Effect of different concentrations of exopolysaccharides on the germination of rice seeds under acid stress

2.1.2 酸脅迫下胞外多糖對水稻種子根長、芽長及根鮮重、芽鮮重的影響 由圖1可知，酸脅迫對水稻幼芽生長的抑制效果不顯著，但對根系生長的抑制效果顯著(P＜0.05)。與CK相比，酸脅迫下不添加多糖芽長與根長分別降低1.8%和70.2%，芽鮮重與根鮮重分別降低15.5%和74.4%。隨著多胞外糖濃度的增加，其對水稻根系生長的促進作用增加。與CK相比，200 mg·L-1和2 000 mg·L-1胞外多糖處理的根長分別增長35.1%和59.6%，根鮮重分別增加79.5%和126.1%，且均顯著高于CK。

圖1 不同濃度胞外多糖對酸脅迫下水稻根長、芽長、根鮮重、芽鮮重的影響Fig.1 Effect of different concentration of exopolysaccharides on root length，shoot length，root fresh weight and fresh weight of rice under acid stress

2.1.3 酸脅迫下胞外多糖對水稻幼芽MDA含量及抗氧化酶活性的影響 由圖2可知，酸脅迫對水稻MDA含量有顯著的提高作用，同時對抗氧化酶(CAT、POD、SOD)活性有抑制作用。胞外多糖溶液浸種處理在一定程度上可以顯著降低MDA含量，提高抗氧化酶活性。酸脅迫下，水稻幼芽的MDA含量較CK顯著增加，而經(jīng)過胞外多糖浸種處理可以顯著降低MDA含量，當(dāng)多糖濃度為200 mg·L-1時，MDA含量與CK間無顯著性差異。

酸脅迫對水稻幼芽的CAT、POD、SOD活性均有抑制作用，與 CK相比，分別降低了 54.8%、32.8%、1.4%。添加胞外多糖可以顯著提高抗氧化酶活性，且不同濃度胞外多糖對抗氧化酶活性的促進作用存在差異。 當(dāng)胞外多糖濃度為 20 mg·L-1時，CAT、POD、SOD活性與酸脅迫下不添加多糖相比，分別提高了60.7%、46.9%、31.0%，達到與無脅迫處理時相近的活性。

2.1.4 酸脅迫下胞外多糖對水稻幼苗各項生理指標的影響 由表2可知，酸脅迫的水稻幼苗與CK相比，其葉長、株高、根長、總根數(shù)和鮮重分別降低了13.40%、10.29%、27.61%、19.79%和 19.57%。 隨著胞外多糖濃度的增加，其對水稻幼苗的酸毒害緩解作用逐漸增強。胞外多糖濃度為200 mg·L-1時，其對脅迫處理后的水稻幼苗生長有顯著的緩解作用，與不添加胞外多糖相比，第20天時水稻葉長、株高、根長、總根數(shù)和鮮重分別提高了16.82%、10.13%、14.70%、12.91%、5.97%。由表3可知，不同處理下的水稻幼苗葉片的MDA含量、CAT、POD和SOD活性雖有一定的差異，但均未達到顯著水平(P＞0.05)。

圖2 不同濃度胞外多糖對酸脅迫下水稻MDA含量和抗氧化酶活性的影響Fig.2 Effect of different concentrations of exopolysaccharides on MDA content and the activity of antioxidant enzymes in rice under acid stress

表2 不同濃度胞外多糖對酸脅迫下水稻幼苗生理指標的影響Table2 Effect of different concentrations of extracellular polysaccharide on physiological indexes of rice seedlings under acid stress

2.2 鹽脅迫下胞外多糖對水稻種子萌發(fā)及生理特性的影響

2.2.1 鹽脅迫下胞外多糖對水稻種子發(fā)芽勢、發(fā)芽率的影響 由表4可知，鹽脅迫對水稻種子的發(fā)芽勢、發(fā)芽率及發(fā)芽指數(shù)均有顯著的抑制作用，與CK相比，分別降低了76.1%、47.9%、67.2%。胞外多糖浸種處理對鹽脅迫下的水稻種子萌發(fā)具有一定的促進作用，且隨著胞外多糖濃度的增加，其對種子萌發(fā)的促進作用呈先增加后降低趨勢。其中胞外多糖為200 mg·L-1時效果最好，與不添加胞外多糖的鹽脅迫時相比，發(fā)芽勢、發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)分別提高了152.9%、73.8%、103.0%。

表3 不同濃度胞外多糖對酸脅迫下水稻幼苗MDA含量及抗氧化酶活性的影響Table3 Effect of different concentrations of exopolysaccharides on MDA content and the activity of antioxidant enzymes in rice seedlings under acid stress

圖3 不同濃度胞外多糖對鹽脅迫下水稻根長、芽長、根鮮重、芽鮮重的影響Fig.3 Effect of different concentrations of exopolysaccharides on root length，shoot length，root fresh weight and fresh weight of rice under salt stress

2.2.2 鹽脅迫下胞外多糖對水稻種子根長、芽長及根鮮重、芽鮮重的影響 由圖3可知，鹽脅迫下，水稻幼芽和根系生長均受到顯著抑制。與CK相比，鹽脅迫下的種子芽長和根長分別減少34.5%、71.9%，芽鮮重和根鮮重分別降低35.2%、77.8%。胞外多糖處理對芽長無顯著作用，但對芽鮮重有一定的促進作用，且隨著胞外多糖濃度的增加，其對芽鮮重的促進作用逐漸增加。胞外多糖濃度為200 mg·L-1時，其對根長、芽鮮重、根鮮重的促進作用效果較顯著，與鹽脅迫不添加多糖相比分別增加了187.5%、32.6%、134.6%。

表4 不同濃度胞外多糖對鹽脅迫下水稻種子萌發(fā)的影響Table4 Effect of different concentrations of exopolysaccharideson rice seed germination under salt stress

2.2.3 鹽脅迫下胞外多糖對水稻種子MDA含量及抗氧化酶活性的影響 由圖4可知，鹽脅迫對水稻MDA含量及抗氧化酶活性的影響與酸脅迫條件下的變化趨勢基本一致。鹽脅迫不添加多糖條件下，與CK相比，其水稻幼芽中的MDA含量上升了24.8%，胞外多糖處理后，其含量有所降低其中胞外多糖濃度為200 mg·L-1時，MDA含量達到最低，與不添加胞外多糖的鹽脅迫相比降低了63.3%。但當(dāng)胞外多糖濃度為2 000 mg·L-1時，其對MDA含量降低的作用減弱。鹽脅迫下，水稻幼芽CAT、POD、SOD活性均降低，分別降低了37.1%、93.2%、17.3%。胞外多糖浸種后，3種抗氧化酶活性均有不同程度的提高，且隨著胞外多糖濃度的增加，活性逐漸上升。

圖4 不同濃度胞外多糖對鹽脅迫下水稻MDA含量及抗氧化酶活性的影響Fig.4 Effect of different concentrations of exopolysaccharides on MDA content and the activity of antioxidant enzymes in rice under salt stress

2.2.4 鹽脅迫下胞外多糖對水稻幼苗各項生理指標的影響 由表5可知，鹽脅迫對水稻幼苗的生長有顯著的抑制效果。鹽脅迫不添加多糖條件下的水稻幼苗與CK相比，葉長、株高、根長、總根數(shù)、鮮重分別降低了16.39%、11.14%、32.54%、14.36%、19.57%。 隨著浸種胞外多糖濃度的增加，對水稻幼苗的緩解作用呈先增加后降低趨勢。其中，胞外多糖濃度為200 mg·L-1時，對水稻幼苗的緩解效果最為顯著，幼苗生長第20天，與不添加胞外多糖相比，葉長、株高、根長、總根數(shù)、鮮重分別提高了17.80%、9.17%、16.87%、11.81%、19.40%。

由表6可知，不同處理間的水稻幼苗葉片MDA含量及CAT、POD、SOD活性均存在差異，但未達到顯著水平(P＞0.05)。

表5 不同濃度胞外多糖對鹽脅迫下水稻幼苗各項生理指標的影響Table5 Effect of different concentrations of extracellular polysaccharide on physiological indexes of rice seedlings under salt stress

表6 不同濃度胞外多糖對鹽脅迫下水稻幼苗MDA含量及抗氧化酶活性的影響Table6 Effect of different concentrations of exopolysaccharides on MDA content and the activity of antioxidant enzymes in rice seedlings under salt stress

3 討論

利用多糖浸種可以緩解脅迫對植株造成的傷害。研究發(fā)現(xiàn)植物多糖[19]、動物多糖[20]等均能夠增強植物抗逆性，其中微生物多糖因具有安全無污染、易提取等優(yōu)點而備受人們關(guān)注。Sandhya等[21]從向日葵根際土中分離獲得一株在干旱脅迫下高產(chǎn)胞外多糖的惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida)GAP-P45，發(fā)現(xiàn)在干旱脅迫下接種GAP-P45對向日葵幼苗的存活率、生物量、根冠比等指標均有顯著影響，且明顯增強了向日葵幼苗對干旱脅迫的適應(yīng)能力；Xu等[22]研究發(fā)現(xiàn)藍藻多糖對灌木檸條種子的發(fā)芽率和幼苗代謝活性均有顯著提高的作用，并通過清除活性氧、提高抗氧化酶活性等方式減少植物的氧化損傷，可作為恢復(fù)荒漠地區(qū)生態(tài)系統(tǒng)的潛在生物肥料；劉偲嘉[23]研究表明，膠凍類芽孢桿菌胞外多糖可以顯著提高多種蔬菜、煙草等植物的抗氧化酶活性，誘導(dǎo)植物產(chǎn)生抗逆性。本試驗結(jié)果表明，乳酸菌胞外多糖浸種能夠提高酸、鹽脅迫下水稻種子的發(fā)芽勢、發(fā)芽率和發(fā)芽指數(shù)，促進水稻根系的生長，抑制水稻MDA含量，提高抗氧化酶活性，從而改善逆境脅迫對水稻種子造成的傷害。這與前人研究[21-23]結(jié)果基本一致。此外，本研究發(fā)現(xiàn)不同胞外多糖濃度對植物受脅迫的緩解作用不同，因此在實際應(yīng)用中，需要根據(jù)不同植物和脅迫環(huán)境條件，選擇適宜的胞外多糖濃度。

研究表明，酸、鹽脅迫導(dǎo)致水稻幼芽的抗氧化系統(tǒng)活性不同程度地降低，進而對植株造成損傷[24]。MDA是細胞膜脂過氧化的產(chǎn)物，其含量反映了細胞氧化損傷的程度[25]，因此MDA含量常作為評價植物膜脂過氧化的重要指標[26]。本研究發(fā)現(xiàn)逆境脅迫會顯著提高水稻幼芽MDA含量，通過利用胞外多糖浸種后，可顯著降低水稻幼芽的MDA含量，表明胞外多糖可以顯著降低細胞膜脂過氧化，減少活性氧的產(chǎn)生，緩解脅迫對水稻的過氧化傷害。這與曹君等[27]的研究結(jié)果基本相同。此外，Yang等[28]研究也表明，解淀粉芽孢桿菌胞外多糖具有較強的抗氧化性，能夠顯著抑制MDA的形成。抗氧化酶能夠清除植物體內(nèi)活性氧，以維持活性氧代謝平衡，避免過量活性氧對植物造成的傷害[29-30]，是評價植物抗性的重要指標[31-32]。本研究結(jié)果表明，酸、鹽脅迫會導(dǎo)致水稻幼芽的抗氧化酶不同程度地降低，而通過乳酸菌胞外多糖浸種后，水稻幼芽的 CAT、POD、SOD活性均顯著提高，這與 Tewari等[33]的研究結(jié)果相似。研究發(fā)現(xiàn)脅迫導(dǎo)致植物抗氧化酶活性變化會隨著植物基因型的不同而存在較大差異[34]，某些脅迫條件下植物的抗氧化酶活性會顯著上升，這可能是由于脅迫條件導(dǎo)致作物的萌發(fā)和正常生理代謝嚴重紊亂，造成作物的抗氧化酶系統(tǒng)會產(chǎn)生不同方向的變異，進而影響作物的生長和代謝。

乳酸菌作為一類益生菌，其安全性被世界廣泛認可，所產(chǎn)的胞外多糖是一類具有抗氧化[35]、抗腫瘤[36]、免疫調(diào)節(jié)[37]等生物活性的糖類大分子[38]，在食品等領(lǐng)域有廣泛應(yīng)用[39]，但在誘導(dǎo)植物抗逆性方面的應(yīng)用較少。本研究表明，乳酸菌胞外多糖對酸、鹽逆境脅迫下水稻種子萌發(fā)具有顯著的緩解作用，能夠提高水稻種子抗氧化酶活力，這為乳酸菌胞外多糖增強植株抗逆性方面的研究提供了理論依據(jù)。

4 結(jié)論

利用乳酸菌胞外多糖浸種可有效改善酸、鹽脅迫下水稻種子的萌發(fā)和苗期生長，緩解酸、鹽脅迫對水稻造成的毒害，其中以200 mg·L-1胞外多糖的效果最為顯著。本研究為微生物源物增強水稻抗逆性的應(yīng)用提供了理論依據(jù)。今后可考慮采用代謝組學(xué)等新方法，進一步考察微生物多糖對脅迫條件下植物代謝的影響，進而闡明其作用機理。