涂招秀，謝欣，胡居吾＊，黃斌華

（1.江西省科學(xué)院，江西南昌 3300962；2.江西華紫仁農(nóng)業(yè)開(kāi)發(fā)有限公司，江西贛州 330000）

蔓三七，又名平臥菊三七、蛇接骨、續(xù)命草、神仙草，其味辛、微苦、性涼，為多年生草本藥食兩用植物。蔓三七莖葉營(yíng)養(yǎng)豐富，富含粗多糖和綠原酸，同時(shí)還含有總黃酮、維生素A、維生素C、氨基酸，富含有機(jī)鈣等成分。民間利用其通經(jīng)活絡(luò)，消腫止痛，消炎止咳，治療跌打損傷，支氣管肺炎、肺結(jié)核等[1]。

現(xiàn)代生物化學(xué)和醫(yī)學(xué)研究證明，蔓三七具有通經(jīng)活絡(luò)，消炎止咳，散淤消腫，活血生肌等功效[2]；能延緩衰老、激活免疫細(xì)胞、改善機(jī)體免疫功能、提高人體免疫力，增強(qiáng)人體的新陳代謝并對(duì)記憶障礙有一定改善作用[3]；具有降血壓、降血糖和預(yù)防慢性腎病、抑制乙型肝炎的顯著效果[4]；對(duì)預(yù)防和治療心腦血管疾病、糖尿病等有一定的療效[5]；還具有抗病毒、抗菌活性、抑制骨髓癌和志賀樣毒素細(xì)胞的活性[6]?？蓮V泛利用于食品醫(yī)藥工業(yè)、日用化工等領(lǐng)域，是一種極具潛力和高經(jīng)濟(jì)價(jià)值的藥食兩用植物。黃酮類(lèi)化合物是蔓三七葉的主要活性成分之一，其中主要含蘆丁、異槲皮苷、山奈酚-3-O-蕓香糖苷、槲皮苷等[7]。

動(dòng)態(tài)超高壓微射流技術(shù)能對(duì)物料起到強(qiáng)烈的剪切作用，并能產(chǎn)生高頻振蕩效果，同時(shí)給物料帶來(lái)高速的撞擊和壓力瞬間釋放等一系列的相互作用，從而導(dǎo)致物料的細(xì)胞或細(xì)胞壁破碎，從而使物料的活性成分溶出，而且它不會(huì)影響物料中的活性成分[8]。目前，動(dòng)態(tài)超高壓微射流技術(shù)常用在對(duì)植物多糖的提取[9-10]、蛋白質(zhì)改性[11]等。運(yùn)用動(dòng)態(tài)超高壓微射流技術(shù)來(lái)提取黃酮的研究相對(duì)較少。

本文先采用進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)，并在此基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面法，以蔓三七葉黃酮得率（Y）為響應(yīng)值，優(yōu)化提取工藝；再以總抗氧化能力和對(duì)DPPH·和·OH清除率來(lái)評(píng)價(jià)蔓三七葉黃酮的抗氧化活性，研究結(jié)果對(duì)開(kāi)發(fā)天然抗氧性化合物，綜合利用蔓三七葉資源，提高蔓三七葉的附加值具有重要的意義。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

蔓三七葉，江西華紫仁農(nóng)業(yè)開(kāi)發(fā)有限公司，烘干、粉碎后過(guò)20目篩備用。

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品，中藥固體制劑制造技術(shù)國(guó)家工程研究中心；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH），Westgene公司；2,2-連氨基-雙-（3-乙基苯并二氫噻唑啉-6-磺酸）二銨鹽（ABTS）、AAPH、Trolox，Aladdin 公司。其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

MFIC高壓微射流均質(zhì)機(jī)（M-700 Series），美國(guó)Microfluidics公司；高壓均質(zhì)機(jī)（GY50-6S），上海華東高壓均質(zhì)機(jī)廠；可見(jiàn)分光光度計(jì)（722G），上海馳唐實(shí)業(yè)有限公司；電子分析天平（AL104），梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 蔓三七葉黃酮提取的流程

蔓三七葉粉末→一定濃度的乙醇浸泡→過(guò)夜→高壓預(yù)均質(zhì)（30 MPa，2次）→動(dòng)態(tài)超高壓微射流均質(zhì)→乙醇冷凝回流提?。?0 ℃，2次）→ 合并提取液→離心→抽濾→測(cè)定吸光度→計(jì)算黃酮得率。

1.2.2 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制[12]

精確稱取在干燥溫度為120 ℃下干燥至恒重的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品0.200 0 g，置于100 mL容量瓶中，往容量瓶中加入80%乙醇70 mL，置于50 ℃水浴上邊加熱邊搖晃使其溶解，溶解完全后再冷卻至室溫，往容量瓶中再加入乙醇至刻度，搖勻。精密吸取10 mL，置于100 mL容量瓶中，加水至刻度，搖勻，即得0.2 mg/mL蘆丁對(duì)照品溶液。精密量取對(duì)照品溶液0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL和7.0 mL，分別置于25 mL容量瓶中，先加乙醇6 mL，其次往容量瓶中加入1.0 mL 5%亞硝酸鈉溶液，搖勻，放置6 min后，再容量瓶中加10%硝酸鋁溶液1.0 mL，搖勻，放置6 min，最后加5%氫氧化鈉試液10.0 mL，再加水至刻度，搖勻，放置15 min。以乙醇為參比，用1 cm比色皿，于紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)上，在400～600 nm波長(zhǎng)處進(jìn)行掃描。結(jié)果表明，對(duì)照品溶液在510 nm處有最大吸收，因此選擇510 nm作為測(cè)定波長(zhǎng)。在510 nm波長(zhǎng)處測(cè)定體系的吸收度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，其中縱坐標(biāo)為吸收度（A），橫坐標(biāo)為溶液濃度。標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為A=0.001x+0.0392，相關(guān)系數(shù)R2=0.999，線性范圍在0～100 mg/mL。

1.2.3 單因素實(shí)驗(yàn)

影響蔓三七葉黃酮得率的主要因素包括提取溫度、乙醇濃度、提取時(shí)間、提取次數(shù)、微射流均質(zhì)壓力和料液比等。通過(guò)前期的研究，確定液料比為15 mL/g，提取次數(shù)為2次。本實(shí)驗(yàn)主要研究對(duì)蔓三七葉黃酮得率影響較大的因素有提取溫度、乙醇濃度、提取時(shí)間和微射流均質(zhì)壓力4個(gè)因素對(duì)蔓三七葉黃酮得率的影響。

1.2.4 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取乙醇濃度（A）、提取時(shí)間（B）和微射流均質(zhì)壓力（C）3個(gè)因素為自變量，由于提取溫度變化不顯著，設(shè)定為65 ℃。根據(jù)Box-Behnken中心組合設(shè)計(jì)原理，以蔓三七葉黃酮得率（Y）為響應(yīng)值。因素水平編碼見(jiàn)表1。

表1 中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平

1.2.5 蔓三七葉黃酮體外抗氧化活性研究

1.2.5.1 總抗氧化能力的測(cè)定

參照李雪等[13]人方法，采用試劑盒測(cè)定蔓三七葉黃酮總抗氧化能力。按照T-AOC測(cè)定試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作進(jìn)行。根據(jù)公式（1）計(jì)算蔓三七葉黃酮及維生素C的總抗氧化能力（η總）：

式中：

N=反應(yīng)體系稀釋倍數(shù)（反應(yīng)液總量/取樣量）；

n=樣品測(cè)試前稀釋倍數(shù)。

在37℃時(shí)，每分鐘每毫升樣品使反應(yīng)體系的吸光度值每增加0.01時(shí)，為一個(gè)總抗氧化單位。

1.2.5.2 DPPH自由基清除能力的測(cè)定

參照Najafian[14]等人方法，測(cè)定蔓三七葉黃酮對(duì)DPPH自由基清除效果。最后根據(jù)公式（2）計(jì)算蔓三七葉黃酮及維生素C的DPPH自由基清除率（ηDPPH）

1.2.5.3 OH自由基清除能力的測(cè)定

參照李雪[13]等人方法，測(cè)定蔓三七葉黃酮對(duì)OH自由基清除效果。最后根據(jù)公式（3）計(jì)算蔓三七葉黃酮及維生素C的OH自由基清除率（η·OH）：

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS17.0進(jìn)行單因素方差分析、Origin8.5軟件作圖、Design-Expert 8.0.6軟件進(jìn)行響應(yīng)面設(shè)計(jì)和統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)

2.1.1 乙醇濃度對(duì)蔓三七葉黃酮得率的影響

分別稱取100.00 g干燥的蔓三七葉粉末（過(guò)20目），按上述的液料比15 mL/g（體積/重量）加入分別為50%、60%、70%、80%和90%乙醇溶液，先經(jīng)過(guò)30 MPa預(yù)均質(zhì)后，在80 MPa微射流壓力下處理2次，65 ℃ 水浴提取1.5 h，提取兩次。

由圖1可知，蔓三七葉黃酮得率在50%～70%乙醇濃度范圍內(nèi)，隨著乙醇濃度的上升而增大，并且在乙醇濃度為70%時(shí)達(dá)到最大值，此時(shí)得率為1.93%；在乙醇濃度70%～90%的范圍內(nèi)，隨著乙醇濃度繼續(xù)上升，蔓三七葉黃酮得率緩慢下降，在乙醇濃度為90%時(shí)，蔓三七葉黃酮得率為1.82%。其原因可能是當(dāng)乙醇濃度大于70%，物料中的葉綠素等脂溶性雜質(zhì)大量的溶出，從而影響了黃酮物質(zhì)的溶出率。因此，選擇乙醇濃度為70%較合適。

圖1 乙醇濃度對(duì)蔓三七葉黃酮得率的影響

2.1.2 提取溫度對(duì)蔓三七葉黃酮得率的影響

分別稱取100.00 g蔓三七葉粉末，按液料比15 mL/g加入70 %濃度的乙醇，浸泡過(guò)夜，經(jīng)30 MPa預(yù)均質(zhì)后，立刻在80 MPa微射流壓力下處理2次，提取溫度選擇 50、55、60、65 ℃和 70 ℃ 水浴提取 1.5 h，提取2次，結(jié)果如圖2所示。

由圖2可知，在提取溫度為50～65 ℃范圍內(nèi)，蔓三七葉黃酮得率隨著提取溫度的上升而有所增加，但曲線上升趨勢(shì)不是太顯著，在提取溫度為50 ℃時(shí)，蔓三七葉黃酮得率為1.82%，而在提取溫度為65 ℃時(shí)，蔓三七葉黃酮得率為1.90%。當(dāng)提取溫度超過(guò)65℃后，蔓三七葉黃酮得率隨著溫度的上升（70 ℃）而緩慢下降，其原因可能是蔓三七葉黃酮中的某些活性成分被氧化分解。因此，選擇提取溫度為65 ℃較合適。

2.1.3 提取時(shí)間對(duì)蔓三七葉黃酮得率的影響

分別稱取100.00 g蔓三七葉粉末，按液料比15 mL/g加入70%濃度的乙醇，浸泡過(guò)夜，經(jīng)30 MPa預(yù)均質(zhì)后，立刻在80 MPa微射流壓力下處理2次，提取溫度65 ℃水浴提取，提取時(shí)間分別選擇0.5、1、1.5、2 h和2.5 h，提取2次，結(jié)果如圖3所示。

圖2 提取溫度對(duì)蔓三七葉黃酮得率的影響

由圖3可知，在提取時(shí)間為0.5～1.5 h范圍內(nèi)，蔓三七葉黃酮得率會(huì)隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，且蔓三七葉黃酮得率升高較快。在提取時(shí)間超過(guò)1.5 h后，蔓三七葉黃酮得率有下降的趨勢(shì)。因此，選擇提取時(shí)間為1.5 h較合適。

圖3 提取時(shí)間對(duì)蔓三七葉黃酮得率的影響

2.1.4 微射流均質(zhì)壓力對(duì)蔓三七葉黃酮得率的影響

分別稱取100.00 g蔓三七葉粉末，按液料比15 mL/g加入70%濃度的乙醇，浸泡過(guò)夜，經(jīng)30 MPa預(yù)均質(zhì)后，分別在立刻微射流均質(zhì)壓力選擇60、70、80、90 MPa和100 MPa下處理2次，提取溫度65 ℃水浴提取1.5 h，提取2次，結(jié)果如圖4所示。

相對(duì)于普通提取和高壓預(yù)均質(zhì)后提取，微射流均質(zhì)后再提取時(shí)，使得蔓三七葉黃酮得率隨著均質(zhì)壓力的加大而顯著提高，因?yàn)轶w系中均質(zhì)壓力越大，使得物料細(xì)胞的破碎程度越高，從而使得物料中黃酮物質(zhì)等有效成分更完全的溶出。從圖4可知，蔓三七葉黃酮的得率在微射流均質(zhì)壓力為90 MPa時(shí)達(dá)到最大值，蔓三七葉黃酮的得率達(dá)到1.94%。而后隨著均質(zhì)壓力的進(jìn)一步加大，蔓三七葉黃酮得率趨于平緩且略微下降。因此，微射流均質(zhì)壓力90 MPa時(shí)，蔓三七葉黃酮得率最大。

圖4 微射流均質(zhì)壓力對(duì)蔓三七葉黃酮得率的影響

2.2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析

2.2.1 回歸模型的建立及方差分析

單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，乙醇濃度、提取時(shí)間、微射流均質(zhì)壓力是影響得率的三個(gè)最主要的因素，由于提取溫度變化不顯著，設(shè)定為65 ℃，根據(jù)Box-Behnken中心組合設(shè)計(jì)原理，以蔓三七葉黃酮得率（Y）為響應(yīng)值，進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

采用Design-Expert.V8.0.6.1 軟件對(duì)表2中的17個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)的響應(yīng)值進(jìn)行多元回歸擬合后得到黃酮得率與各因素的二次多項(xiàng)回歸方程模型 R：

Y(%)=2.04-0.041A+0.026B+0.048C+0.030AB+0.0 13AC+0.017BC-0.12A2-0.085B2-0.14C2

由表3分析結(jié)果可知，表中F值越大表明該因素對(duì)黃酮得率影響越大，各因素對(duì)黃酮得率的影響大小依次為：均質(zhì)壓力（C）、乙醇濃度（A）、提取時(shí)間（B）。對(duì)該模型進(jìn)行方差分析，結(jié)果見(jiàn)表3，整體模型的顯著性檢測(cè)p＜0.01，且失擬項(xiàng)為0.623 4，不顯著，說(shuō)明該方程對(duì)試驗(yàn)擬合較好，在此模型中A2、B2和C2是極顯著性因子項(xiàng)（p＜0.01），而B(niǎo)、AB、AC、BC無(wú)顯著性差異（p＞0.05）。

其中校正決定系數(shù)R2Adj=0.876 9＞0.80和變異系數(shù)（CV）為2.31%，可用來(lái)對(duì)提取蔓三七葉黃酮的工藝過(guò)程進(jìn)行初步分析和預(yù)測(cè)。

表3 回歸模型的方差分析

2.2.2 驗(yàn)證試驗(yàn)

通過(guò)Design-Expert8.0.6 軟件求解方程，系統(tǒng)預(yù)測(cè)得出蔓三七葉黃酮得率的最佳工藝條件為：乙醇濃度67.56 %、提取時(shí)間68.06 min和均質(zhì)壓力79.57 MPa，在此條件下，模型預(yù)測(cè)得到黃酮得率為2.07%。為了檢驗(yàn)響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)所得到結(jié)果的可靠性，考慮到實(shí)際操作因素，將上述條件修正為：乙醇濃度68.0%、提取時(shí)間68 min和均質(zhì)壓力80 MPa，在此條件下黃酮得率為2.08%。黃酮得率實(shí)際值與預(yù)測(cè)理論值未發(fā)現(xiàn)顯著性差異（p＞0.05），證明運(yùn)用試驗(yàn)建立的數(shù)學(xué)模型進(jìn)行預(yù)測(cè)在實(shí)踐中是切實(shí)可行的，適用于工業(yè)生產(chǎn)。

2.3 蔓三七葉黃酮的抗氧化活性

2.3.1 總抗氧化能力

不同質(zhì)量濃度蔓三七葉黃酮總抗氧化能力見(jiàn)圖5。由圖5可見(jiàn)，在各濃度下蔓三七葉黃酮總抗氧化能力與對(duì)照品維生素C的總抗氧化能力較接近，兩者的溶液濃度在0.8 mg/mL時(shí)，蔓三七葉黃酮總抗氧化能力值為（11.25±0.45）U/mL，維生素C總抗氧化能力值為（13.56±0.50）U/mL，蔓三七葉黃酮總抗氧化能力達(dá)到了維生素C總抗氧化能力值的90%以上，并且隨著溶液濃度增大，兩者的抗氧化能力都增強(qiáng)?？梢钥闯?，蔓三七葉黃酮總抗氧化能力較強(qiáng)。

圖5 蔓三七黃酮總抗氧化能力

2.3.2 對(duì)DPPH自由基清除能力

不同質(zhì)量濃度蔓三七葉黃酮對(duì)DPPH自由基清除能力見(jiàn)圖6。在各濃度下蔓三七葉黃酮與維生素C的DPPH 自由基清除能力均隨著質(zhì)量濃度增大具有增強(qiáng)趨勢(shì)。但蔓三七葉黃酮對(duì)DPPH 自由基清除能力低于Vc對(duì)DPPH 自由基清除能力，如在0.8 mg/mL時(shí)，蔓三七葉黃酮對(duì)DPPH自由基清除率為55.65%，而維生素C對(duì)DPPH 自由基清除率為90.2%。雖然蔓三七葉黃酮對(duì)DPPH自由基清除能力不及維生素C，但它對(duì)清除DPPH自由基還是具有較好的效果。

2.3.3 對(duì)OH自由基清除能力

不同質(zhì)量濃度蔓三七葉黃酮對(duì)OH自由基的清除能力見(jiàn)圖7。在各濃度下蔓三七葉黃酮與維生素C的OH自由基清除能力均隨著質(zhì)量濃度增大具有增強(qiáng)趨勢(shì)。蔓三七葉黃酮對(duì)OH自由基清除能力稍低于維生素C對(duì)OH自由基清除能力，在0.8 mg/mL時(shí)，蔓三七葉黃酮對(duì)OH自由基清除率為70.25%，維生素C對(duì)OH自由基清除率為86.7%，此濃度下蔓三七葉黃酮對(duì)OH自由基清除能力達(dá)到維生素C的80%以上，說(shuō)明蔓三七葉黃酮對(duì)OH自由基清除能力較強(qiáng)。

圖6 蔓三七黃酮對(duì)DPPH自由基清除能力

圖7 蔓三七黃酮對(duì)OH自由基清除能力

3 結(jié)論

采用動(dòng)態(tài)超高壓微射流技術(shù)提取蔓三七葉黃酮，通過(guò)單因素與響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)，建立了蔓三七葉黃酮得率的回歸模型。該模型測(cè)得出蔓三七葉黃酮得率的最佳工藝條件為：乙醇濃度68.0%、提取時(shí)間68 min和均質(zhì)壓力80 MPa，在此條件下黃酮得率為2.08%。在質(zhì)量濃度0.2～1.0 mg/mL范圍內(nèi)，蔓三七葉中黃酮體外抗氧化活性呈現(xiàn)出量效關(guān)系趨勢(shì)。0.8 mg/mL時(shí)，總抗氧化能力為（11.25±0.45）U/mL，達(dá)到相同溶液濃度的維生素C總抗氧化能力[（13.56±0.50）U/mL]的90%以上，各濃度蔓三七葉中黃酮對(duì)DPPH和·OH清除能力均有較強(qiáng)的清除能力，是一種良好的天然抗氧化劑。