韓步鷹，李長(zhǎng)忠，馬 睿，劉小紅，千康康，侯建華，東國(guó)才，陳殊婷，孟玉瓊

(青海大學(xué)生態(tài)環(huán)境工程學(xué)院，青海 西寧，810016)

石蠟切片制備步驟繁多，制備過(guò)程包括組織取材、固定、沖洗、脫水、透明、浸蠟、包埋、切片、貼片、烤片、脫蠟、染色及封存等步驟。根據(jù)不同組織結(jié)構(gòu)特點(diǎn)不同導(dǎo)致其制備方法也不盡相同。有研究表明，脫水和透明程序是石蠟組織切片制作中至關(guān)重要的環(huán)節(jié)，也是影響組織形態(tài)學(xué)研究的重要因素[1]。因此，要制出優(yōu)質(zhì)的石蠟切片，需要不斷的摸索和改進(jìn)制備條件。

本研究通過(guò)優(yōu)化制作的高原三倍體虹鱒不同組織石蠟切片，觀察高原三倍體虹鱒鰓、肝臟和腸道組織的基本組織形態(tài)學(xué)特點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.2 方法

1.2.1 常規(guī)方法

將固定好的組織用水多次沖洗去除固定液，分別按照不同程序進(jìn)行組織的脫水和透明(見(jiàn)表1)。

表1本研究所采用的脫水及透明時(shí)間(min)

Table 1Dehydration and transparency time used in this study(min)

透明后的組織于60 ℃浸蠟2 h并包埋，修塊后采用切片機(jī)(LEICA，RM2235)將蠟塊切成6 μm厚的薄片，貼片和烤片后采用蘇木精-伊紅進(jìn)行染色，染色步驟如下：

(1)脫蠟水化：將烤干的切片分別放入以下溶液中并保持一定的時(shí)間：二甲苯(Ⅰ)5分鐘、二甲苯(Ⅱ)5分鐘、無(wú)水乙醇5分鐘、95%乙醇2分鐘、80%乙醇2分鐘、70%乙醇2分鐘和蒸餾水2分鐘。

(2)染色：對(duì)于上述處理好的樣品，用蘇木素染色5分鐘，自來(lái)水沖洗數(shù)次洗去殘留的染色液后用蒸餾水洗滌。再以1%鹽酸酒精分化液分化30秒，期間用顯微鏡檢查，當(dāng)其分色鮮明時(shí)用流水沖洗切片數(shù)次。放入伊紅染色溶液中染1分鐘。

(3)脫水和透明：將切片依次浸入95%酒精(Ⅰ)、95%酒精(Ⅱ)、100%乙醇(Ⅰ)和100%乙醇(Ⅱ)中停留1分鐘，然后將切片放入等體積比的無(wú)水酒精和二甲苯、二甲苯(Ⅰ)和二甲苯(Ⅱ)中，分別停留1分鐘。

(4)封存：將含組織材料的載玻片從二甲苯中取出放在吸水紙上，用膠頭滴管吸取中性樹(shù)膠滴在切片的中央，用小鑷子輕輕地夾住蓋玻片的右側(cè)，稍微傾斜使其左側(cè)與封藏劑接觸，緩慢放下蓋玻片，盡量減少氣泡的產(chǎn)生。最后將封好的切片放在托盤于37 ℃的恒溫箱中干燥后進(jìn)行觀察。

1.2.2 優(yōu)化方法

參考以上常規(guī)方法，首先讓組織脫水脫過(guò)，得出最短透明時(shí)間；然后，不斷縮短組織的脫水時(shí)間，直至組織不能在二甲苯中透明，前一步時(shí)間即最短脫水時(shí)間；最后通過(guò)切片染色來(lái)判斷實(shí)際的效果。優(yōu)化后的脫水及透明程序見(jiàn)表2。

表2不同組織最佳脫水及透明時(shí)間(min)

Table 2Optimal dehydration and transparent time of different tissues(min)

2 結(jié)果與分析

2.1 不同脫水及透明程序?qū)Ω咴扼w虹鱒腸道組織顯微結(jié)構(gòu)的影響

注：A1、B1和C1分別代表A、B和C處理組10倍物鏡下組織切片顯微結(jié)構(gòu)圖； A2、B2和C2分別代表A、B和C處理組40倍物鏡下組織切片顯微結(jié)構(gòu)圖。
圖A1：1-漿膜；2-肌層；3-粘膜下層；4-粘膜層；圖A2：1-固有層；2-上皮細(xì)胞；3-杯狀細(xì)胞。

圖1不同脫水及透明程序?qū)Ω咴扼w虹鱒腸道組織的影響

Figure1EffectsofDifferentDehydrationandTransparentProceduresontheIntestinalTissueofPlateauTriploidRainbowTrout

不同脫水及透明程序?qū)Ω咴扼w虹鱒腸道組織的影響如圖1所示，A處理組鏡下組織結(jié)構(gòu)完整，厚薄均勻、無(wú)裂痕，染色鮮艷，細(xì)胞形態(tài)清晰。漿膜、肌層、上皮細(xì)胞和杯狀細(xì)胞等顯微結(jié)構(gòu)清晰可見(jiàn)。B處理組鏡下組織產(chǎn)生脆裂，染色不均勻，漿膜和肌層中間產(chǎn)生空隙分層，有粘膜層脫落，組織結(jié)構(gòu)不完整。C處理組鏡下組織產(chǎn)生嚴(yán)重裂痕，染色效果暗淡。

2.2 不同脫水及透明程序?qū)Ω咴扼w虹鱒肝臟組織顯微結(jié)構(gòu)的影響

注：A1、B1和C1分別代表A、B和C處理組10倍物鏡下組織切片顯微結(jié)構(gòu)圖；A2、B2和C2分別代表A、B和C處理組40倍物鏡下組織切片顯微結(jié)構(gòu)圖。

圖2不同脫水及透明程序?qū)Ω咴扼w虹鱒肝臟組織的影響

Figure2EffectsofDifferentDehydrationandTransparentProceduresonLiverTissueofPlateauTriploidRainbowTrout

不同脫水及透明程序?qū)Ω咴扼w虹鱒肝臟組織的影響如圖2所示，A處理組鏡下組織產(chǎn)生皺縮現(xiàn)象，組織形態(tài)發(fā)生改變。B處理組鏡下組織形態(tài)清晰完整，染色鮮艷，無(wú)裂痕皺縮現(xiàn)象。C處理組10倍鏡下組織類似絮狀物，結(jié)構(gòu)發(fā)生嚴(yán)重變形。

2.3 不同脫水及透明程序?qū)Ω咴扼w虹鱒鰓組織顯微結(jié)構(gòu)的影響

注：A1、B2和C3分別代表A、B和C處理組10倍物鏡下組織切片顯微結(jié)構(gòu)圖；A2、B2和C2分別代表A、B和C處理組40倍物鏡下組織切片顯微結(jié)構(gòu)圖。
圖A2：1-呼吸上皮細(xì)胞；2-柱細(xì)胞；3-血竇。

圖3不同脫水及透明程序?qū)Ω咴扼w虹鱒鰓組織的影響

Figure3EffectsofDifferentDehydrationandTransparentProceduresonGillTissueofPlateauTriploidRainbowTrout

不同脫水及透明程序?qū)Ω咴扼w虹鱒鰓組織的影響如圖3所示，A處理組鏡下組織結(jié)構(gòu)完整，染色鮮艷，細(xì)胞形態(tài)清晰。高倍鏡下呼吸上皮細(xì)胞、柱細(xì)胞和血竇清晰可見(jiàn)。B處理組鏡下組織產(chǎn)生脆裂，組織結(jié)構(gòu)不完整，高倍鏡下鰓絲組織已經(jīng)嚴(yán)重變形。C處理組部分鰓絲已經(jīng)解體，染色效果暗淡。

2.4 最佳脫水及透明程序?qū)Ω咴扼w虹鱒不同組織的影響

注：A1、A2和A3分別代表腸道組織在物鏡為10倍、20倍和40倍下組織切片顯微結(jié)構(gòu)圖。B1、B2 和B3分別代表肝組織在物鏡為10倍、20倍和40倍下組織切片顯微結(jié)構(gòu)圖。C1、C2和C3分別代表鰓組織在物鏡為10倍、20倍和40倍下組織切片顯微結(jié)構(gòu)圖。
圖A1：1 漿膜；2 肌層；3 粘膜下層；4 粘膜層；圖A3：1 固有層；2 上皮細(xì)胞；3 杯狀細(xì)胞；圖B2：1 肝細(xì)胞；2 肝血竇；圖C2：1 鰓小片；2 鰓絲；3 鰓絲軟骨；圖C3：1 呼吸上皮細(xì)胞；2 柱細(xì)胞；3 血竇。

圖4最佳脫水及透明程序?qū)Ω咴扼w虹鱒不同組織的影響

Figure4EffectsofOptimalDehydrationandTransparencyProceduresonDifferentTissuesofPlateauTriploidRainbowTrout

對(duì)不同組織的石蠟切片制作程序優(yōu)化結(jié)果如圖4所示，最佳脫水和透明程序下的腸道、肝臟和鰓的組織切片薄厚均勻、無(wú)皺折、切面組織結(jié)構(gòu)完整。細(xì)胞結(jié)構(gòu)形態(tài)清晰，染色鮮艷，細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)藍(lán)紅對(duì)比明顯，腸道切片輕微縊縮，組織無(wú)裂隙。并且發(fā)現(xiàn)高原三倍體虹鱒鰓、腸道和肝臟組織脫水及透明時(shí)間存在差異，其中腸道組織所需脫水時(shí)間最短，肝臟組織透明時(shí)間最長(zhǎng)。

3 討論

整個(gè)石蠟切片過(guò)程雖然并不復(fù)雜，但要制出優(yōu)質(zhì)的切片，需要根據(jù)研究對(duì)象的不同，不斷的摸索和改進(jìn)制備過(guò)程。脫水和透明程序是石蠟組織切片制作中至關(guān)重要的步驟，影響著最終切片質(zhì)量的好壞。脫水的目的是把組織中的水分徹底脫除，有利于組織的透明、浸蠟及永久保存。通常采用梯度酒精浸泡逐漸取代組織中水分，以保證組織徹底脫水并避免組織過(guò)度收縮和硬化。然而，乙醇的濃度及處理時(shí)間會(huì)顯著影響生物組織的物理特性。長(zhǎng)時(shí)間低濃度乙醇處理會(huì)導(dǎo)致組織變軟，助長(zhǎng)材料的解體；而長(zhǎng)時(shí)間高濃度乙醇處理則會(huì)導(dǎo)致組織收縮變硬[2]，進(jìn)而產(chǎn)生脆裂乃至無(wú)法展片的現(xiàn)象。本研究發(fā)現(xiàn)鰓組織在B處理脫水及透明程序下明顯產(chǎn)生鰓絲解體現(xiàn)象，這可能由于在低濃度乙醇中每級(jí)停留時(shí)間太長(zhǎng)，使組織變軟，C脫水和透明程序下，由于在高濃度乙醇中每級(jí)停留太長(zhǎng)時(shí)間，使鰓組織產(chǎn)生收縮現(xiàn)象。肝臟組織在A處理脫水透明程序下明顯產(chǎn)生皺縮現(xiàn)象，這可能與脫水時(shí)間過(guò)短有關(guān)。

脫水后的材料在浸蠟前，還必須經(jīng)過(guò)透明處理。透明是指采用透明劑置換組織內(nèi)的脫水劑，透明與脫水環(huán)節(jié)息息相關(guān)，一般來(lái)說(shuō)，脫水越充分，透明效果就越好[3]。隨著時(shí)間的推移，組織逐漸變得通透，最終呈透明狀，使得組織呈現(xiàn)透明狀以利于顯微鏡下觀察，同時(shí)為下一步的浸蠟起到橋梁作用，一般采用二甲苯進(jìn)行。二甲苯不僅可替代組織中的酒精，又能溶解石蠟以利石蠟的滲入，是目前被廣泛應(yīng)用的一種透明劑。然而，高濃度的二甲苯會(huì)引起組織強(qiáng)烈收縮[4]，所以要先用無(wú)水酒精與二甲苯等比例混合液進(jìn)行透明預(yù)處理，再用二甲苯進(jìn)行透明。且透明時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng)，過(guò)長(zhǎng)組織會(huì)出現(xiàn)脆裂現(xiàn)象，一般2小時(shí)左右即可[5]。本研究發(fā)現(xiàn)肝臟組織在A處理脫水透明程序下明顯產(chǎn)生皺縮現(xiàn)象，相反C脫水透明程序下出現(xiàn)脆裂現(xiàn)象，這可能與高濃度二甲苯中停留時(shí)間長(zhǎng)短有關(guān)。

在對(duì)高原三倍體虹鱒石蠟組織切片制作方法研究的基礎(chǔ)上，本研究進(jìn)一步對(duì)其鰓、肝臟和腸道組織進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察。結(jié)果表明，高原三倍體虹鱒鰓組織由鰓弓和鰓絲組成，鰓弓由骨骼支持，每一片鰓由鰓弓、鰓耙及鰓絲構(gòu)成，鰓絲呈長(zhǎng)條形；肝臟組織主要由肝細(xì)胞構(gòu)成，肝細(xì)胞多為多角形或近圓形，細(xì)胞核位于中央或偏移一側(cè)，少許細(xì)胞存在兩個(gè)細(xì)胞核；高原三倍體虹鱒腸道組織是由漿膜、肌層、粘膜下層和粘膜層構(gòu)成的。粘膜層的中間是固有層、外圍由柱狀上皮細(xì)胞和杯狀細(xì)胞構(gòu)成。

通過(guò)與其他魚類組織形態(tài)學(xué)研究對(duì)比發(fā)現(xiàn)，高原三倍體虹鱒組織形態(tài)結(jié)構(gòu)與一般肉食性魚類如哲羅魚[6]、鱖魚[7]和黃鱔[8]等類似，而與草食性和雜食性魚類如鰱、鳙[9]和鯉魚[10]不同。一般來(lái)說(shuō)肉食性魚類鰓耙短而稀疏，腸壁較厚，腸絨毛面積較大，肝細(xì)胞分布不均勻[11]。本研究發(fā)現(xiàn)高原三倍體虹鱒的鰓耙較稀疏，鰓絲呈長(zhǎng)條形，腸壁較厚，杯裝細(xì)胞較多，長(zhǎng)絨毛面積較大，肝臟不與胰臟混雜，肝細(xì)胞核呈圓形或橢圓形，有時(shí)可見(jiàn)兩個(gè)核，肝細(xì)胞索單列縱行，低倍鏡下似云霧狀，肝細(xì)胞分布不均勻，肝小葉區(qū)分不明顯。王永翠等[12，13]研究發(fā)現(xiàn)魚類消化道的形態(tài)組織結(jié)構(gòu)與其生活環(huán)境和食物息息相關(guān)，食物豐富的魚類消化道杯狀細(xì)胞發(fā)達(dá)，與其組織結(jié)構(gòu)上有更好的消化吸收機(jī)制密切相關(guān)。張娟娟等[14]在虹鱒的研究上發(fā)現(xiàn)腸絨毛面積與對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收相關(guān)。因此，不同養(yǎng)殖環(huán)境對(duì)于虹鱒組織形態(tài)學(xué)影響較大，系統(tǒng)研究高原三倍體虹鱒組織形態(tài)學(xué)對(duì)于理解其生理變化具有至關(guān)重要的意義。