李天芝，于新友，沈志強(qiáng)，2

（1.山東綠都生物科技有限公司，山東 濱州 256600；2.山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院，山東 濱州 256600）

約有80%以上病原微生物主要經(jīng)過(guò)呼吸道、消化道、生殖道等黏膜途徑侵入動(dòng)物機(jī)體引起感染[1]。黏膜是防御病原微生物的第一道屏障[2]，它可在病原微生物侵入機(jī)體前將其消滅，免其對(duì)機(jī)體造成損傷，在疾病的發(fā)生和發(fā)展中起著重要的作用。黏膜免疫系統(tǒng)是由廣泛分布于呼吸道、胃腸道、泌尿生殖道黏膜下及一些外分泌腺體（唾液腺、淚腺、乳腺）處的淋巴組織組成的系統(tǒng)，主要包括3部分：1）黏膜相關(guān)淋巴組織，如腸黏膜相關(guān)淋巴組織、支氣管黏膜相關(guān)淋巴組織、泌尿生殖道黏膜相關(guān)淋巴組織、鼻咽黏膜相關(guān)性淋巴組織和眼結(jié)膜相關(guān)淋巴組織等[3]；2）致敏淋巴細(xì)胞散布途徑，主要是淋巴循環(huán)及血液循環(huán)；3）黏膜免疫效應(yīng)部位，即全身的黏膜組織，包括胃腸道、呼吸道、眼結(jié)膜、生殖道和多種分泌腺如乳腺、唾液腺、淚腺等組織。黏膜免疫是豬體免疫網(wǎng)絡(luò)的重要組成部分[4]，50%以上的淋巴組織和 80% 的免疫細(xì)胞存在于黏膜，黏膜是豬最大的免疫系統(tǒng)。黏膜免疫自發(fā)現(xiàn)以來(lái)就受到國(guó)內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注，成為研究的熱點(diǎn)，黏膜免疫系統(tǒng)與傳統(tǒng)意義上的免疫系統(tǒng)不同，不僅能在黏膜局部發(fā)揮免疫功能，產(chǎn)生分泌型抗體，阻止了病原微生物從黏膜的入侵，還能通過(guò)“共同黏膜免疫系統(tǒng)”使整個(gè)機(jī)體黏膜系統(tǒng)產(chǎn)生免疫保護(hù)[5]，同時(shí)又能誘發(fā)全身性的體液免疫應(yīng)答[6]。黏膜局部的抗體比血清抗體出現(xiàn)得早、效價(jià)高，且維持的時(shí)間長(zhǎng)，其抗體水平更能體現(xiàn)疫苗免疫保護(hù)情況。黏膜免疫產(chǎn)生的抗體主要以分泌型的IgA（sIgA）為主，還有分泌型的IgM（sIgM）、IgG等。隨著集約化、規(guī)?；B(yǎng)殖業(yè)的不斷發(fā)展，傳統(tǒng)的疫苗注射免疫接種因存在費(fèi)時(shí)費(fèi)力、對(duì)豬的應(yīng)激大、操作繁瑣、容易導(dǎo)致交叉污染等問(wèn)題，已經(jīng)不能完全適應(yīng)生產(chǎn)的需要。黏膜免疫可通過(guò)氣霧、口服等途徑接種，簡(jiǎn)單易行、副作用較小，更重要的是可阻止病原在局部黏膜的定植，免疫效果好，不僅誘導(dǎo)局部免疫應(yīng)答，也誘導(dǎo)全身性應(yīng)答等，因此越來(lái)越受到關(guān)注。文章主要介紹黏膜免疫及其在豬病防控中的應(yīng)用。

1 黏膜免疫抗體

1.1 黏膜sIgA

sIgA抗體是由漿細(xì)胞分化產(chǎn)生的，在黏膜中含量最為豐富，是參與黏膜免疫反應(yīng)的主要抗體。sIgA由兩個(gè)IgA單體、1條J鏈和一條分 泌 片 (secretory component，SC)構(gòu)成[7]，J鏈?zhǔn)窃跐{細(xì)胞分泌IgA前同IgA聚合的，SC則是由IgA穿過(guò)上皮轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程中加上的。SC無(wú)免疫活性，但它能促進(jìn)上皮細(xì)胞積極地從組織中吸收sIgA，并將其釋放到消化道、呼吸道和泌尿生殖道的黏膜表面，從而發(fā)揮黏膜免疫效應(yīng)，還能夠保護(hù)抗體免受蛋白酶的降解，增加抗體的穩(wěn)定性，使其在消化道及呼吸道管腔中保持活性的時(shí)間延長(zhǎng)。與單體IgA相比，sIgA表面具有大量的抗原結(jié)合位點(diǎn)，結(jié)合抗原的能力強(qiáng)。sIgA沒(méi)有活化補(bǔ)體和其他促炎癥因子的功能，當(dāng)發(fā)揮免疫活性時(shí)只是與腸腔中的各種抗原連接，干擾它們的攝入，因此對(duì)黏膜上皮細(xì)胞的損傷較小。sIgA的作用主要是：1）能捕捉進(jìn)入黏膜內(nèi)的病原，使病原發(fā)生凝聚，阻斷其病原與黏膜結(jié)合、或與病原微生物結(jié)合形成復(fù)合物，從而阻斷或阻止病原對(duì)黏膜的黏附，發(fā)揮外源病原的免疫排斥作用；2）能與溶菌酶、補(bǔ)體共同作用引起細(xì)菌溶解，也能中和相應(yīng)腸毒素的毒性；3）能與吞噬細(xì)胞、自然殺傷（NK）細(xì)胞等細(xì)胞表面的Fc受體結(jié)合，發(fā)揮抗體依賴(lài)的細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用（ADCC）效應(yīng)，殺傷靶細(xì)胞；4）增強(qiáng)乳鐵傳遞蛋白及乳過(guò)氧化物酶系統(tǒng)對(duì)幾種黏膜病原體的抗菌作用；5）可通過(guò)黏膜淋巴組織增強(qiáng)抗原依賴(lài)性細(xì)胞作用，從而提高對(duì)病原的直接殺傷能力。

1.2 黏膜 sIgM

sIgM是由5個(gè)IgM單體聚合而成，也是能發(fā)揮黏膜免疫功能的一種高效抗體。同sIgA的功能類(lèi)似，具有抗菌、抗病毒、中和毒素的免疫活性，尤其對(duì)IgA免疫缺陷的個(gè)體，sIgM的免疫功能更為重要。

1.3 黏膜中的IgG

目前，尚不清楚血清中的IgG是如何進(jìn)入分泌物中的，黏膜表面的IgG抗體在抵抗感染中可發(fā)揮重要作用。分泌到管腔中的IgG同樣具有抗菌、抗病毒及抗毒素等功能。但I(xiàn)gG與抗原結(jié)合發(fā)揮免疫活性時(shí)，能激活補(bǔ)體造成黏膜上皮細(xì)胞的損傷，從而達(dá)到清除病原的作用。IgG抗體對(duì)蛋白酶的水解作用抵抗力弱，容易降解，不穩(wěn)定。IgG同sIgA一樣也能發(fā)揮ADCC效應(yīng)，殺傷靶細(xì)胞。管腔中的IgG可與抗原結(jié)合，形成免疫復(fù)合物，返回到黏膜固有層，經(jīng)樹(shù)突狀細(xì)胞處理后，遞呈給CD4+ T細(xì)胞，以供機(jī)體免疫系統(tǒng)識(shí)別。

2 黏膜免疫佐劑

經(jīng)黏膜免疫時(shí)大多數(shù)蛋白質(zhì)抗原免疫力降低，經(jīng)反復(fù)大量免疫后，易引起免疫耐受，阻礙了黏膜疫苗的發(fā)展。因此，需要配合相應(yīng)的佐劑，以增強(qiáng)黏膜免疫反應(yīng)的效果，或使抗原物質(zhì)免于被胃腸道消化酶降解。黏膜免疫相關(guān)佐劑可提高疫苗的免疫原性，延長(zhǎng)抗原與黏膜及免疫活性細(xì)胞的作用時(shí)間，減少黏膜免疫耐受，增強(qiáng)疫苗免疫效果[8]，是黏膜疫苗研發(fā)的重點(diǎn)。好的黏膜免疫佐劑需具備以下條件：1）能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生強(qiáng)烈的體液和/或細(xì)胞免疫應(yīng)答反應(yīng)；2）安全性好，無(wú)致熱原，無(wú)致癌致畸特性，無(wú)毒副作用，不會(huì)引起動(dòng)物體的過(guò)敏反應(yīng)；3）穩(wěn)定性好，在一定溫度、pH范圍能長(zhǎng)時(shí)間保存，性質(zhì)不發(fā)生改變。目前，人們已開(kāi)發(fā)出多種黏膜免疫佐劑并投入到實(shí)際生產(chǎn)中，取得了一定的成果。

2.1 細(xì)菌毒素

主要包括從霍亂弧菌獲得的霍亂毒素（CT）、從大腸桿菌獲得的熱不穩(wěn)定毒素（LT）及從百日咳博德特氏菌獲得的百日咳毒素等。其中，CT和LT是公認(rèn)的有效的黏膜佐劑，均能提高APCs遞呈抗原的能力，具有良好的免疫原性。CT和LT均是由A、B兩種亞單位組成的六聚體蛋白，A亞單位具有催化ADP核糖基化的作用，B亞單位可與宿主細(xì)胞表面受體結(jié)合，穿透細(xì)胞，將A亞單位帶入細(xì)胞。CT能誘導(dǎo)CD4+、Th2型細(xì)胞活化，產(chǎn)生IL-4、IL-5、IL-6和IL-10，也能促進(jìn)IgG2b亞類(lèi)、IgE和黏膜sIgA應(yīng)答的出現(xiàn)。與抗原同時(shí)口服時(shí)可誘導(dǎo)CD4+、Th1細(xì)胞產(chǎn)生血清IgM、IgG1、IgG2a和 黏 膜 sIgA。LT作為佐劑可與多種抗原經(jīng)不同途徑共免疫，均能明顯增強(qiáng)機(jī)體對(duì)共免抗原的黏膜sIgA和IgG應(yīng)答，與CT主要誘導(dǎo)Th2型免疫應(yīng)答不同，LT誘導(dǎo)的應(yīng)答要均衡些，產(chǎn)生IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3和黏膜sIgA，是Th1和Th2型應(yīng)答的混合。CT和LT均具有毒性，LT的毒性較CT低，經(jīng)黏膜免疫時(shí)可產(chǎn)生針對(duì)自身的sIgA和血清抗體，限制了其在人體上的應(yīng)用。

2.2 細(xì)胞因子

細(xì)胞因子通過(guò)促進(jìn)免疫活性細(xì)胞的分化增殖或影響細(xì)胞內(nèi)生物活性分子的表達(dá)與分泌而發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用，可直接作為佐劑使用。目前，常用的細(xì)胞因子佐劑有IL-1、IL-2、IFN-γ、IL-12、IL-18 及 GM-CSF 等。IL-1和IL-12不僅能誘導(dǎo)抗原特異性的免疫應(yīng)答，而且能誘導(dǎo)黏膜免疫應(yīng)答。IL-1能顯著增加抗體水平，尤其是IgG2a和IgA的水平，在鼻內(nèi)免疫佐劑中可代替CT或LT，毒性相對(duì)較小。IL-18可誘導(dǎo)Th1細(xì)胞分化發(fā)育和增殖。細(xì)胞因子佐劑的缺點(diǎn)是半衰期短，活性易受內(nèi)環(huán)境如pH、各種水解酶及血漿蛋白的影響，當(dāng)劑量大時(shí)可導(dǎo)致發(fā)熱、炎癥等副作用。

2.3 CpG基序

通過(guò)人工合成的一個(gè)或多個(gè)非甲基化的CpG基序?yàn)楹诵牡墓押塑账幔∣DN），也具有相似的免疫刺激功能，可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生強(qiáng)烈的體液和細(xì)胞介導(dǎo)的全身免疫及黏膜免疫。當(dāng)與蛋白抗原共同使用時(shí)，可誘導(dǎo)機(jī)體細(xì)胞免疫應(yīng)答反應(yīng)。CpG能刺激B細(xì)胞增殖，分泌多克隆抗體、IL-6、IL-12[9]，同時(shí)激活單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和樹(shù)突狀細(xì)胞，促使未成熟的樹(shù)突狀細(xì)胞（DCs）轉(zhuǎn)變?yōu)槌墒斓腁PCs。CpG作為佐劑與抗原共同免疫動(dòng)物可誘發(fā)強(qiáng)烈的以IgG2a和CTL為主的Th1型免疫應(yīng)答。還能激活T細(xì)胞、B細(xì)胞、NK細(xì)胞等，產(chǎn)生大量的多種細(xì)胞因子，增強(qiáng)機(jī)體的特異性和非特異性免疫效應(yīng)。還可與傳統(tǒng)的黏膜免疫佐劑CT和LT產(chǎn)生協(xié)同效應(yīng)，且無(wú)毒副作用，是一種極具應(yīng)用前景的黏膜免疫佐劑。

2.4 甘露聚糖

甘露聚糖可作為黏膜反應(yīng)佐劑，誘導(dǎo)血清、陰道及唾液中sIgA的分泌。

2.5 脂質(zhì)體

脂質(zhì)體是由單層或多層磷脂組成的具有水相內(nèi)核的環(huán)形囊狀結(jié)構(gòu)小體，對(duì)蛋白質(zhì)或多糖抗原都有免疫增強(qiáng)作用，能激發(fā)細(xì)胞免疫活性，提高抗體效價(jià)，而且抗體滴度維持的時(shí)間較長(zhǎng)。脂質(zhì)體與抗原結(jié)合后可增加黏膜供給疫苗的有效性，發(fā)揮免疫佐劑效應(yīng)，能誘發(fā)高水平的系統(tǒng)IgG和黏膜sIgA抗體反應(yīng)。作為鼻黏膜免疫佐劑時(shí)，刺激機(jī)體產(chǎn)生黏膜和全身免疫應(yīng)答反應(yīng)。在酸性溶液、膽汁和胰液素中非常穩(wěn)定，因此，很適合作為口服疫苗的載體，脂質(zhì)體也可以配合其他黏膜佐劑如CT一起使用，增加口服釋放的效率。

2.6 細(xì)菌載體

應(yīng)用化學(xué)或分子生物學(xué)技術(shù)使上細(xì)菌中的致病基因發(fā)生突變以降低其毒性，但仍保留了其對(duì)黏膜的侵襲力或從動(dòng)物體內(nèi)分離的益生菌作為載體，將疫苗抗原運(yùn)載至APCs。目前常用的細(xì)菌載體主要包括李斯特桿菌、鼠傷寒桿菌、志賀氏菌、乳酸桿菌、酵母菌等。一般通過(guò)口服方式進(jìn)行免疫，可保護(hù)抗原免于被體內(nèi)酸性環(huán)境破壞。

3 黏膜免疫的途徑

常見(jiàn)的黏膜免疫途徑包括消化道、呼吸道、生殖道、直腸黏膜等。由于每個(gè)部位的組織結(jié)構(gòu)各不相同，其免疫的分子機(jī)制和效果也不同。疫苗用量較少，又能引起強(qiáng)烈的全身性免疫應(yīng)答反應(yīng)的途徑是最佳的途徑[10]。下面簡(jiǎn)單介紹一下各種黏膜免疫途徑的特點(diǎn)。

3.1 消化道

消化道免疫主要是通過(guò)口服疫苗的方式免疫，操作方便，能同時(shí)預(yù)防腸道及呼吸道、泌尿生殖道感染，是傳統(tǒng)的黏膜免疫途徑，能產(chǎn)生大量的sIgA發(fā)揮免疫功能，但通過(guò)消化道免疫疫苗時(shí)，疫苗容易被強(qiáng)烈的胃酸環(huán)境破壞，免疫時(shí)需要加大劑量，或采用特殊的物質(zhì)包被，以減少胃酸對(duì)疫苗的破壞。除了sIgA發(fā)揮重要作用外，位于小腸黏膜上皮之間的上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞，直接與進(jìn)入腸腔的微生物接觸，也在消化道黏膜免疫中發(fā)揮重要的作用。腸道是誘導(dǎo)黏膜免疫應(yīng)答的有效部位，經(jīng)過(guò)腸道免疫可以產(chǎn)生較好的黏膜免疫應(yīng)答，且免疫方法簡(jiǎn)單易行。如何使疫苗不受消化液的影響、使用少量的抗原有效地誘導(dǎo)黏膜免疫反應(yīng)，提高黏膜免疫力是目前經(jīng)消化道免疫急需解決的問(wèn)題。

3.2 呼吸道

所謂呼吸道免疫主要是經(jīng)鼻腔接種疫苗，疫苗也可通過(guò)氣管激發(fā)機(jī)體免疫。鼻黏膜具有豐富的血管，接種的疫苗能吸收進(jìn)入體循環(huán)，一般所需要的劑量少，鼻腔接種后可誘導(dǎo)激活扁桃體處的B淋巴細(xì)胞，在鼻或扁桃體激活的部分B細(xì)胞可進(jìn)入血液循環(huán)遷移到遠(yuǎn)處黏膜組織。因此，鼻腔接種疫苗不僅能預(yù)防呼吸道感染，也能預(yù)防其他部位的感染。鼻腔接種操作簡(jiǎn)單，不需要專(zhuān)門(mén)器械，并可避免由于注射而帶來(lái)的交叉感染。

3.3 生殖道

豬的一些病毒性疾病如豬偽狂犬病、豬藍(lán)耳病及豬圓環(huán)病毒病可通過(guò)公豬的精液傳播，導(dǎo)致大批母豬被感染，引起豬繁殖障礙性疾病。常規(guī)的注射免疫不能阻斷這種傳播，可通過(guò)在豬生殖道黏膜接種疫苗的方式，誘導(dǎo)相應(yīng)的免疫應(yīng)答，從而阻止疾病的傳播，黏膜免疫是解決豬繁殖障礙性疾病的重要免疫方式。

3.4 直腸

豬直腸黏膜中有大量M細(xì)胞和淋巴細(xì)胞，能夠進(jìn)行局部黏膜免疫。

4 黏膜免疫在豬病毒病防控中的應(yīng)用

4.1 豬流行性腹瀉防控

豬流行性腹瀉病毒（PEDV）對(duì)哺乳仔豬的危害嚴(yán)重，尤其對(duì)7日齡內(nèi)的仔豬，因腸上皮細(xì)胞更新速度慢，死亡率更高，通過(guò)母乳獲得的sIgA是仔豬抵抗病毒感染的關(guān)鍵。傳統(tǒng)的母豬肌注滅活疫苗不能產(chǎn)生sIgA，而接種弱毒疫苗后可能會(huì)因弱毒含量低或在腸道中的增殖能力低或與當(dāng)前流行毒株不匹配等問(wèn)題，不能產(chǎn)生大量的sIgA，免疫效果差。而口服疫苗免疫可刺激母豬乳腺產(chǎn)生sIgA，sIgA在腸道中穩(wěn)定性較好，可為仔豬提供被動(dòng)免疫保護(hù)。Hou等[11]構(gòu)建了能表達(dá)PEDV N基因的重組乳酸桿菌，經(jīng)口服和滴鼻免疫小鼠后，檢測(cè)其血清中抗PEDV的特異性IgG抗體水平。結(jié)果表明，重組菌能夠刺激機(jī)體產(chǎn)生明顯的免疫反應(yīng)，口服和滴鼻免疫沒(méi)有明顯的差異。分別在70 d和84 d收集腸液和肺液，用間接ELISA檢測(cè)黏膜IgA抗體水平，結(jié)果表明：無(wú)論是在小腸黏液中還是在肺泡液中均可檢測(cè)到大量的抗體，這些抗體可以中和豬流行性腹瀉病毒。葛俊偉等[12]構(gòu)建了表達(dá)PEDV COE基因的重組乳酸桿菌口服免疫小鼠，測(cè)定其免疫應(yīng)答水平。結(jié)果表明：免疫組小鼠血清、糞便中檢測(cè)到較高水平的特異性IgG、sIgA（P ＜ 0.01），血清具有中和活性（1:12），脾淋巴細(xì)胞增殖指數(shù)明顯高于對(duì)照組，IL-4和IFN-γ水平極顯著提高（P ＜ 0.01）。

4.2 豬傳染性胃腸炎防控

豬傳染性胃腸炎病毒（TGEV）是經(jīng)腸道黏膜感染的重要病毒，黏膜免疫在抵御病毒侵入機(jī)體過(guò)程中具有重要作用。宋振輝等[13]分別構(gòu)建了含TGEV M及N基因的重組桿狀病毒rBac-M和rBac-N，將兩種重組病毒分別口服免疫小鼠，收集小鼠糞便檢測(cè)sIgA抗體水平，并檢測(cè)血清中IgG。結(jié)果顯示：兩種重組病毒均可誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生黏膜免疫和體液免疫應(yīng)答。劉義等[14]將含有TGEV S基因的重組乳酸菌口服（灌胃）免疫BALB/C小鼠，首免、二免、加強(qiáng)免疫共免疫3次，每次免疫連續(xù)灌服3 d，間隔兩周,免疫劑量為0.3～0.4 mL/只。第3次加強(qiáng)免疫后10 d，捕殺小鼠，采集血液、脾臟、糞便，處理后采用T淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)及間接ELISA方法檢查免疫小鼠對(duì)外源基因表達(dá)產(chǎn)物的應(yīng)答情況。結(jié)果表明，免疫組小鼠血清中的IgG、糞便中的sIgA與對(duì)照組有顯著差異（P ＜ 0.05）。

4.3 豬輪狀病毒病防控

輪狀病毒是引起嬰幼兒和各種幼齡動(dòng)物腹瀉的主要病原之一。對(duì)輪狀病毒感染所引起的胃腸炎沒(méi)有特效治療藥物，只能通過(guò)疫苗免疫預(yù)防。目前，人用的輪狀病毒疫苗可口服免疫，效果較好，豬輪狀病毒口服疫苗的研制是疫苗研究的重要方向。葉麗萍等[15]構(gòu)建了能表達(dá)輪狀病毒Vp4的重組乳酸菌，大量培養(yǎng)后離心，加入滅菌脫脂乳液給BALB/c小鼠灌服，檢測(cè)血清抗體和腸黏膜sIgA水平，并進(jìn)行小鼠免疫保護(hù)性試驗(yàn)。結(jié)果表明，該重組菌能增強(qiáng)小鼠的黏膜免疫反應(yīng)，對(duì)豬輪狀病毒強(qiáng)毒株的攻擊具有一定的保護(hù)作用。

4.4 豬偽狂犬病防控

由于偽狂犬病病毒并不引起毒血癥，而主要定植在三叉神經(jīng)，使用gE缺失的弱毒疫苗局部黏膜免疫可以起到占位效應(yīng)，從而抵抗野毒的感染。同時(shí)，黏膜免疫可以避免母源抗體對(duì)免疫產(chǎn)生的影響。用豬偽狂犬病病毒活疫苗在小豬1～3日齡噴鼻免疫，是豬場(chǎng)豬偽狂犬病凈化的第1步，能有效抵御偽狂犬病野毒的入侵。噴鼻免疫一定要操作正確，選用專(zhuān)用的噴鼻器，最好不要進(jìn)行滴鼻免疫，滴鼻時(shí)只有非常少的疫苗粘在鼻腔黏膜，大部分疫苗或通過(guò)吞咽反射進(jìn)入胃內(nèi)被胃酸滅活或直接流出，不能有效利用，如果能配合相應(yīng)的佐劑，則能進(jìn)一步提高黏膜免疫的效果。豬場(chǎng)在噴鼻免疫的基礎(chǔ)上再做1～2次肌肉注射免疫以建立起細(xì)胞免疫，防控豬偽狂犬病。

4.5 豬支原體病防控

豬支原體能與相應(yīng)的受體結(jié)合，并在黏膜部位的細(xì)胞內(nèi)增殖，通過(guò)“占位效應(yīng)”阻斷野毒的“入侵”。豬支原體活疫苗可噴鼻免疫，也可進(jìn)行噴霧免疫操作，當(dāng)噴霧免疫時(shí)一定要控制氣溶膠顆粒的大小，粒徑太大只能吸入到咽部，粒徑太小吸入后又會(huì)被呼出，只有一定粒徑的才會(huì)停留于肺泡。另外，噴霧時(shí)一定要保持抗原的活性，否則就失去意義。如能解決保持粒徑和活性這兩個(gè)關(guān)鍵問(wèn)題，氣霧型免疫就會(huì)有很好的進(jìn)展。

4.6 豬圓環(huán)病毒病防控

豬圓環(huán)病毒2型（PCV2）可經(jīng)呼吸道、消化道、精液及胎盤(pán)等途徑傳播，能定植于黏膜系統(tǒng)（包括口鼻呼吸道、支氣管、肺及胃腸道黏膜）然后開(kāi)始復(fù)制，并伺機(jī)突破血液屏障進(jìn)入血液循環(huán)和淋巴循環(huán)。傳統(tǒng)的圓環(huán)病毒2型疫苗肌肉注射，只能獲得體液免疫，無(wú)法阻止PCV2在黏膜系統(tǒng)的定植復(fù)制及向體外排毒，黏膜免疫產(chǎn)生sIgA可通過(guò)黏膜免疫中和病毒，全面清除機(jī)體中的病毒。英國(guó)皇家科學(xué)院用食用酵母菌為載體研制了圓環(huán)病毒病的口服疫苗為粉末狀風(fēng)干重組酵母，可穩(wěn)定地表達(dá)PCV2b的殼蛋白，在母豬腸道建立了黏膜保護(hù)，從而顯著降低病毒載毒量和排毒，防止臨床疾病癥狀的發(fā)生，提高血清（IgG）和糞便（IgA）中的抗體水平，顯著降低了母豬圓環(huán)病毒2型的排毒感染壓力。

4.7 豬藍(lán)耳病防控

豬藍(lán)耳病病毒（PRRSV）可經(jīng)呼吸道、消化道、生殖道等黏膜途徑感染豬，通過(guò)黏膜免疫可阻斷其感染。吳國(guó)軍等[16]研究證實(shí)鼻黏膜免疫接種PRRSV CH-1R株弱毒疫苗，可以刺激機(jī)體產(chǎn)生較高的黏膜免疫反應(yīng)和體液免疫反應(yīng)，有效保護(hù)易感動(dòng)物。Han等[17]構(gòu)建了表達(dá)PRRSV的ORF7基因重組減毒沙門(mén)氏菌，經(jīng)口服免疫小鼠12周后，在腸系膜淋巴結(jié)、小腸黏膜下淋巴集結(jié)、固有層淋巴細(xì)胞都檢測(cè)到sIgA。王振華等[18]構(gòu)建了表達(dá)PRRSV ORF6基因的重組乳酸桿菌，與黏膜佐劑CpG ODN聯(lián)合鼻內(nèi)免疫BALB/c小鼠，評(píng)價(jià)其佐劑效應(yīng)。結(jié)果顯示，CpG ODN佐劑協(xié)同重組菌抗原組的血清特異性抗體IgG高于單獨(dú)佐劑組和抗原組，呼吸道和腸道黏膜sIgA水平高于單獨(dú)佐劑組和抗原組，并且呼吸道黏膜sIgA抗體水平高于腸道黏膜抗體，最后一次免疫后14 d檢測(cè)脾細(xì)胞懸液中IL-2、IFN-γ、IL-4及IL-5的活性。IL-2、IFN-γ和IL-5的活性，佐劑CpG ODN協(xié)同重組菌抗原組高于單獨(dú)抗原組（P ＞ 0.05）但不顯著，極顯著高于單獨(dú)佐劑組（P ＜ 0.01），IL-4水平在各組之間差異不顯著（P ＞ 0.05）。

4.8 口蹄疫防控

口蹄疫病毒（FMDV）經(jīng)消化道、呼吸道進(jìn)入動(dòng)物機(jī)體，首先在咽喉部和扁桃體增殖，隨后進(jìn)入血液循環(huán)系統(tǒng)，因此黏膜免疫對(duì)預(yù)防口蹄疫具有重要意義。王瀟等[19]分別構(gòu)建了含F(xiàn)MDV VP1基因及小鼠IL-10基因的重組核表達(dá)質(zhì)粒pcD-VP1和proVAX-IL-10，將兩種重組質(zhì)粒同時(shí)或pcD-VP1單獨(dú)免疫小鼠，檢測(cè)免疫效果，結(jié)果顯示：與單獨(dú)接種pcD-VP1相比，加入IL-10分子佐劑后可誘導(dǎo)更高水平的黏膜sIgA的表達(dá)及分泌，極大地提高了黏膜部位抗原特異性T細(xì)胞增殖反應(yīng)及CD4+T細(xì)胞中IL-4的表達(dá)量。張馨玉等[20]用殼聚糖來(lái)包被口蹄疫DNA疫苗pcD-VP1形成納米級(jí)顆粒，用此顆粒經(jīng)滴鼻、口服、直腸和生殖道4種黏膜免疫小鼠，檢測(cè)小鼠針對(duì)口蹄疫的體液和細(xì)胞免疫水平。結(jié)果顯示，殼聚糖/pcDVP1滴鼻免疫小鼠，抗體的高峰來(lái)臨比僅免疫pcD-VP1提前2周，直腸免疫處理中也呈現(xiàn)如此效果，經(jīng)口服和生殖道途徑的免疫，均沒(méi)有呈現(xiàn)比pcD-VP1免疫組更好的抗體水平。但殼聚糖/pcD-VP1在生殖道和直腸免疫途徑里均比pcD-VP1免疫組腸道集合淋巴結(jié)的T細(xì)胞增殖水平高。

4.9 豬流感防控

豬流感病毒（SIV）一般通過(guò)呼吸道黏膜感染豬，因此，如果能提高黏膜局部免疫力，可更有效阻止SIV感染。師小瀟等[21]選擇SIV血凝素（HA）的T、B抗原表位，將多個(gè)表位片段串聯(lián)，克隆到原核表達(dá)載體pET-30a（+）中，對(duì)串聯(lián)表達(dá)的重組SIV蛋白SIV-ep1、SW-ep2、SIV-el2，經(jīng)灌胃途徑免疫6周齡昆明小鼠，檢測(cè)免疫小鼠抗體及細(xì)胞免疫水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，3免后各免疫組血清IgG抗體與PBS對(duì)照組差異極顯著（P ＜ 0.01），所有免疫蛋白組與PBS組黏膜sIgA抗體差異均極顯著（P ＜ 0.01），細(xì)胞免疫檢測(cè)顯示：所有免疫組小鼠外周血T淋巴細(xì)胞增殖明顯，SIV血凝抗體檢測(cè)結(jié)果顯示，SIV-ep1免疫組、SIV-ep2免疫組、SIV-ep1與LT蛋白免疫組抗SIV H1N1亞型HI效價(jià)達(dá)1∶1024，SIV-el2蛋白免疫組HI效價(jià)達(dá)1∶512。

5 小結(jié)與展望

黏膜免疫尤其對(duì)于一些經(jīng)黏膜途徑侵入動(dòng)物機(jī)體的病原防控效果更好，與傳統(tǒng)的免疫方式相比，黏膜免疫具有很多優(yōu)點(diǎn)，對(duì)動(dòng)物應(yīng)激小，安全性好，既能產(chǎn)生局部黏膜免疫，形成黏膜抗體防護(hù)網(wǎng)，又能產(chǎn)生全身免疫應(yīng)答反應(yīng)，操作簡(jiǎn)便，省時(shí)省力，可發(fā)揮占位效應(yīng)，適合規(guī)?；B(yǎng)殖場(chǎng)應(yīng)用，是未來(lái)豬用疫苗研究的方向。但在黏膜疫苗的研制過(guò)程中也存在一些問(wèn)題，如在免疫佐劑的選擇、免疫途徑的確定及如何保持抗原的活性且發(fā)揮最佳的免疫效果等方面還有很多工作需要研究。目前已有專(zhuān)家從豬體內(nèi)分離出腸道定植的益生菌作為疫苗的載體，制備成可口服的疫苗，能使疫苗的效力達(dá)到最佳。黏膜佐劑的研制也取得了一定的進(jìn)展，開(kāi)發(fā)安全性、有效性、穩(wěn)定性好的新型黏膜疫苗仍然是生物技術(shù)領(lǐng)域及生命科學(xué)工作者的重大挑戰(zhàn)。相信隨著分子生物學(xué)和免疫學(xué)理論與技術(shù)的發(fā)展，黏膜免疫將在今后豬病的防控中發(fā)揮越來(lái)越重要的作用。