白雪杉，林國樂

2019-03-15 美國國立綜合癌癥網(wǎng)絡（NCCN）在線發(fā)布了2019.V1 版《NCCN 結直腸癌診治指南》，本文主要對比了2019.V1 版《NCCN 結直腸癌診治指南》與2018.V4 版《NCCN 結直腸癌診治指南》的更新內容，并對幾點重要的更新內容進行詳細解讀，以期為結直腸癌診療實踐提供思路。

1 “BRAF”作為指導治療的指標之一

在2019.V1 版《NCCN 結直腸癌診治指南》整體改變（General）章節(jié)中，新增“BRAF 基因”作為指導結直腸癌治療的一個指標；在所有標記“KRAS 野生型和NRAS 野生型”作為指征的地方，同時標記“BRAF 野生型”。

這一變化與2019 NCCN 年會的主題——“擴大生物標志物檢測以指導癌癥精準醫(yī)療”的主題相互輝映。早在20 世紀90 年代，KRAS 基因被發(fā)現(xiàn)是結直腸癌的分子標志物之一。之后國內外大量的臨床研究陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了NRAS 基因、BRAF 基因、錯配修復基因（MMR）/微衛(wèi)星不穩(wěn)定性（MSI）等一系列與結直腸癌靶向藥物療效預測、疾病預后、輔助化療等相關的分子標志物［1-2］。其中BRAF 基因是人類最重要的原癌基因之一，其突變可以驅動腫瘤細胞的增殖、生長和分化，尤其在結直腸癌、甲狀腺乳頭狀癌、多毛細胞白血病、腦腫瘤和黑色素瘤中占比突出［3］。

目前檢測到的BRAF 基因突變已逾30 種，其中V600E 占80%以上，是最常見的BRAF 基因激活突變［4］。BRAF 基因V600E 突變可導致RAF/絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號通路的持續(xù)性激活，引起腫瘤細胞分化增殖、代謝、生長的改變［4］。

大量研究發(fā)現(xiàn)，BRAF 基因可以在10%～20%結直腸癌患者中表達，而BRAF 基因V600E 突變可發(fā)生在6%～10%的轉移性結直腸癌患者中，該突變類型定義了一個長期存活概率低、具有高淋巴結和腹膜轉移率的特定臨床生物學特征的亞組［5-6］。隨著研究的深入，MARGONIS 等［7］研究證實BRAF 基因V600E 突變預示著患者不良預后和高復發(fā)風險；在這項隊列研究中，與KRAS 基因相比，BRAF 基因V600E 突變是更強有力的預后指標；該研究回顧性分析了849 例符合入選標準的患者的多國數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，與KRAS 基因突變相比，BRAF 基因V600E 突變對總生存率和無病生存率的影響至少增加3 倍。

BRAF 基因不僅是結直腸癌預后良好的指標，并且在基因突變檢測方面也較為方便快捷。多項研究表明，BRAF 基因V600E（VE1）抗體在體外對于BRAF 基因檢測初篩的應用價值［8］。其對Sanger 測序、RT-PCR 及免疫組化技術3 種方法在檢測實體瘤BRAF 基因V600E 突變中的一致性進行了深入分析，共納入了779 例患者，涵蓋611 例結直腸癌、127 例甲狀腺癌及41 例惡性黑色素瘤患者，采用BRAF 基因V600E（VE1）抗體，分別進行免疫組化檢查（IHC）；779 例患者中，150 例VE1 抗體染色陽性；對349 例患者又進行Sanger 測序及RT-PCR 檢測（包括150例VE1 陽性患者），結果顯示，IHC 方法的靈敏度和特異度分別為100%和99%，可作為BRAF 基因突變檢測很好的初篩工具，并對預后和治療方案提出指導。

由此可見，2019.V1 版《NCCN 結直腸癌診治指南》將BRAF 基因與KRAS 基因和NRAS 基因提到了同等地位。BRAF 基因突變檢測在結直腸癌患者的診斷及治療等方面均有很好的臨床價值，對腫瘤預后評估、靶向治療等意義重大。

2 BRAF 基因V600E 突變與林奇綜合征

2019.V1 版《NCCN 結直腸癌診治指南》中，針對MSI 和MMR 檢測內容做出了如下更新：（1）林奇綜合征是一種常染色體顯性遺傳腫瘤綜合征，由MMR 種系突變引起，可引起結直腸及其他部位（包括子宮內膜、卵巢、胃、小腸、肝膽、上尿道、腦和皮膚等）患腫瘤，其風險高于正常人群。林奇綜合征占所有結直腸癌患者的2%～4%，是最常見的遺傳性結直腸癌綜合征［9］。在MLH1 缺失的情況下，如果存在BRAF 基因V600E 突變，絕大多數(shù)的病例將排除林奇綜合征的診斷。然而，約有1%BRAF 基因V600E 突變（伴MLH1 缺失）的腫瘤是林奇綜合征。在BRAF 基因V600E 突變的病例中，對于有強家族史的病例，應謹慎地行胚系突變篩查以排除林奇綜合征。

近年來多項研究表明，BRAF 基因V600E 突變可以助力結直腸癌的鑒別診斷，排除林奇綜合征［10］。林奇綜合征的基因異常主要為MLH1 基因缺失，無BRAF 基因V600E 突變。故當MLH1 基因缺失時，BRAF 基因V600E 突變提示為散發(fā)型結直腸癌（SCRC）。BRAF 基因V600E 檢測有效簡化了林奇綜合征的診斷流程：首先采用MMR 蛋白免疫組化染色法對疑似患者進行篩查。若MMR 蛋白表達正常，可排除林奇綜合征；而在MMR 蛋白表達缺失的情況下，需具體分析MLH1、MSH2、MSH6 及PMS2 4 種蛋白的具體表達情況。如MLH1 缺失，則進行BRAF突變分析，若為V600E 陽性則預示著極大可能患有SCRC。

（2）對IHC 及其結果做了如下說明：IHC 是對腫瘤組織中的一些蛋白進行染色，這些蛋白質（MLH1、MSH2、MSH6 和PMS2）是由已知在林奇綜合征中均存在突變的4 種錯配修復的MMR 基因所表達。IHC 結果正常意味著4 種MMR 蛋白均正常表達。4 種DNA MMR 蛋白中有1 種或1 種以上缺失通常報告為異?；騃HC 結果陽性。注意：正常結果是指存在蛋白質染色（陽性），異常結果是蛋白質染色缺失（陰性）。如果IHC 發(fā)現(xiàn)任何一種MMR 基因表達蛋白缺失，則指示要行進一步基因檢測（檢測未觀察到表達的蛋白質對應的基因的突變情況）。IHC發(fā)現(xiàn)MLH1 異常的患者，應該對結腸腫瘤進行BRAF基因V600E 突變檢測，其發(fā)生率與SCRC 一致。然而，約有1%的MLH1 缺失的林奇綜合征患者可表達BRAF 基因V600E 突變。

近年來，IHC 已經(jīng)成為林奇綜合征分子診斷的重要手段。當IHC 提示任一MMR 蛋白（MLH1、MSHZ、MSH6、PMS2）缺 失 即 為dMMR，如4 個MMR 蛋白均陽性表達，則稱為錯配修復功能完整（pMMR）。若有MLH1 蛋白表達缺失時，需排除BRAF 基因V600E 突變或MLH1 啟動子區(qū)甲基化。并且，一直以來，分子生物學檢測Sanger 測序法和熒光定量-聚合酶鏈式反應（RT-PCR）一直被用作BRAF 基因突變檢測的常用方法。然而，Sanger 測序法不僅費時、繁瑣，并且對提取DNA 組織要求高，在病理檢查中難以實現(xiàn)常規(guī)化。相比之下，RT-PCR法則較為精準，目前使用較多，但其成本更高，且其對空間及人員的嚴格要求限制了應用與推廣。而IHC用特異性抗體VE1 識別V600E 突變來檢測BRAF 基因突變，且與Sanger 測序法一致性達95%以上。即使所取標本的腫瘤樣本少也可進行檢測，結果易于判讀，兼具低成本和高效的優(yōu)勢，因此更適合作為初篩手段，優(yōu)化結直腸癌鑒別診斷以及林奇綜合征的診斷流程。

筆者認為，應用IHC 檢測BRAF 基因V600E 抗體來識別V600E 突變的過程中，仍需定期評估該方法與分子生物學檢測間的一致性，做好相應的質量評估與控制。先推廣作為篩查手段，通過IHC 的結果指導測序，可以一定程度上簡化診斷流程，并對預后和治療方案提出指導。

3 BRAF 基因V600E 突變患者的后續(xù)治療方案

結直腸癌具有自己非常獨特的基因圖譜以及相應的臨床治療決策流程：比如KRAS/NRAS 基因的檢測可以幫助臨床醫(yī)生選擇使用西妥昔單抗還是貝伐單抗［11］；BRAF 基因的檢測可以協(xié)助臨床醫(yī)生選擇并以此靶點為患者提供相應的靶向藥物治療方案［12］；MSI-H 基因的檢測可以預測免疫療效、化療敏感性甚至是家族遺傳疾病風險等［13］。針對BRAF 基因V600E 突變的結直腸癌治療又出現(xiàn)臨床治療新方案，并以2A 類證據(jù)寫進NCCN 指南。

目前在2019.V1版《NCCN結直腸癌診治指南》中，除了常規(guī)的一線化療方案（FOLFOX/FOLFIRI±貝伐單抗）外，針對BRAF 基因V600E 突變的患者，目前推薦3 種靶向方案：（1）伊立替康+西妥昔單抗/帕妥珠單抗+維莫非尼；（2）達拉菲尼+曲美替尼+西妥昔單抗/帕妥珠單抗；（3）達拉非尼+曲美替尼+（西妥昔單抗或帕尼單抗）/康奈非尼+比美替尼+西妥昔單抗/帕妥珠單抗。

最后的方案為2019.V1 版《NCCN 結直腸癌診治指南》新增內容，其是基于Ⅲ期BEACON CRC試驗［14］。上述研究比較了BRAF 抑制劑康奈非尼、MEK 抑制劑比美替尼聯(lián)合抗表皮生長因子受體抗體西妥昔單抗與對照組（伊立替康/西妥昔單抗或FOLFIRI/西妥昔單抗）治療既往接受1～2 種方案治療失敗的BRAF 基因V600E 突變轉移性結直腸癌患者的安全性與療效，以總生存期為主要研究終點［14］；通過對比BRAF 基因V600E 突變轉移性結直腸癌患者的歷史臨床治療數(shù)據(jù)，該項研究發(fā)現(xiàn)參與研究的這類患者總生存期顯著改善，無進展生存期超過了當前標準治療的總生存期。此方案的療效在目前3 個方案中是最佳的，將近100%的疾病控制率以及可觀的無進展生存期和總生存期，可以作為積極選擇方案。

BRAF 基因突變型患者的后續(xù)治療一直是國內外研究的熱點，從強化療與靶向藥物結合到聯(lián)合靶向藥物治療，在眾多學者不斷地嘗試和失敗中，BRAF 抑制劑和MEK 抑制劑聯(lián)合抗表皮生長因子受體抗體多管齊下終于有所突破?？梢钥闯鯞RAF 基因突變型結直腸癌發(fā)生、發(fā)展背后的多重耐藥機制，多種手段及聯(lián)合用藥治療也許能更好地封鎖各條必經(jīng)信號通路。BRAF 基因突變型結直腸癌患者MSI 發(fā)生率高，未來是否可以考慮聯(lián)合免疫藥物PD-1 抑制劑增效仍需更多高質量的研究去探索。

綜上，本文著重討論了2019.V1 版《NCCN 結直腸癌診治指南》有關“BRAF 基因”的相關更新：例如其作為新的指導結直腸癌治療的指標之一，優(yōu)化林奇綜合征診斷流程以及BRAF 基因V600E 突變患者的后續(xù)治療方案等。以上3 點是2019.V1 版《NCCN結直腸癌診治指南》重要的更新內容，其會對現(xiàn)有結直腸癌的診斷治療以及預測預后的臨床思路產(chǎn)生重大影響。2019.V1 版 《NCCN 結直腸癌診治指南》其他更新內容還包括術后隨訪計劃更為細化，強調了生育風險的討論，新增了短期放療后為期6～12 個月的化療的新輔助治療方案，本文未進行敘述分析，詳見2019.V1 版《NCCN 結直腸癌診治指南》原文（https：//www.nccn.org/patients）。

作者貢獻：林國樂進行文章的構思與設計；白雪杉、林國樂撰寫論文；林國樂進行論文修訂并負責文章的質量控制及審校；白雪杉、林國樂對文章整體負責、監(jiān)督管理。

本文無利益沖突。