孔祥輝 叢 鵬 韓 冰 梁 霆 馬銀鵬張介馳* 于德水 陳 鶴 王笑庸 陳靜宇

（1黑龍江省科學(xué)院微生物研究所，黑龍江哈爾濱150010；2黑龍江省科學(xué)院高技術(shù)研究院，黑龍江哈爾濱150001；3哈爾濱商業(yè)大學(xué)，黑龍江哈爾濱150028）

黑木耳（Auricularia auricula）具有提高免疫力、抗血栓、抗輻射、抗?jié)?、清胃滌腸[1]、延緩衰老[2]、抗菌[3]和降脂降壓等活性。我國東北地區(qū)廣泛栽培黑木耳，在“十三五”期間，黑木耳產(chǎn)業(yè)將大力持續(xù)發(fā)展[4]，深加工技術(shù)研究大有前景。目前，人們對(duì)黑木耳的藥用研究主要集中在多糖、腺苷和黑色素等方面[5-7]，對(duì)黑木耳中黃酮類、多酚類化合物研究不多[8，9]，黃酮類以及作為第七類營養(yǎng)素的多酚類化合物具有強(qiáng)抗氧化能力，清除自由基，保護(hù)細(xì)胞作用[8]；蔡銘[10]等比較了黑木耳總黃酮和多酚提取率及抗氧化能力；張丕奇[8]等測(cè)定了用沙棘廢渣栽培的黑木耳中的總黃酮含量。三萜類化合物有止痛、保肝、毒殺腫瘤、鎮(zhèn)靜、解毒等藥理活性[11]，而關(guān)于黑木耳三萜類成分研究尚未見報(bào)道。研究分析黑木耳不同醇溶液的提取物，確定最佳醇提濃度和醇提物中總黃酮、多酚和三萜類化合物含量，并對(duì)提取后多糖和黑色素殘?jiān)≧esidues removed polysaccharides and melanin，RRPM）進(jìn)行醇提及活性成分分析，為黑木耳活性成分的深入研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

黑木耳粉過100目（黑龍江省科學(xué)院微生物研究所），蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品為分析純（貴州迪大科技有限責(zé)任公司），無水乙醇、異丙醇、正丁醇、福林酚、沒食子酸、高氯酸、冰醋酸、香草醛皆為分析純?cè)噭?/p>

1.2 設(shè)備

中草藥粉碎機(jī)TAISITE（天津市泰斯特儀器有限公司），紫外可見分光光度計(jì)UV757CRT（上海儀電分析儀器有限公司），旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀RE-600（北京市永光明醫(yī)療儀器廠），電熱恒溫水浴鍋DZKW-D-2、循環(huán)水式多用真空泵SHB-B95（鄭州長城科工貿(mào)有限公司），數(shù)控超聲波儀KQ300DE（昆山市超聲儀器有限公司），數(shù)顯恒溫油浴鍋HH-S（江蘇金壇市環(huán)宇科學(xué)儀器廠）。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 黑木耳醇提物制備流程及操作要點(diǎn)

1.3.1.1 黑木耳醇提物制備的流程

原料→粉碎→過篩→稱取→定量木耳粉→加入醇溶液→超聲波處理→回流提取→冷卻→抽濾→旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)→稱重→裝瓶待用

1.3.1.2 黑木耳醇提物制備的操作要點(diǎn)

（1）超聲處理：稱量100目黑木耳干粉3.0 g入250 mL錐形瓶；超聲功率2000 W，超聲處理30 min。

（2）回流提?。簩⒘弦恨D(zhuǎn)移至圓底燒瓶中，加入小磁塊，用恒溫油浴鍋加熱保持料液勻速旋轉(zhuǎn)。

（3）抽濾：先用提取劑潤洗抽濾瓶及布式漏斗，放好濾紙，倒入冷卻后的料液進(jìn)行抽濾。

（4）旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)：將濾液進(jìn)行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，得黑木耳粗提物，稱重。每組三個(gè)平行。

1.3.2 黑木耳醇提物得率計(jì)算方法

黑木耳醇提物得率=（醇提物干重/木耳干重）×100%

1.3.3 乙醇濃度對(duì)黑木耳醇提物得率的影響

黑木耳粉3.0 g置錐形瓶中，分別加入60%、70%、80%、90%、100% 乙醇150 mL，超聲處理30 min，功率2000 W。將料液回流提取，磁力攪拌器轉(zhuǎn)速600 r/min，提取溫度88℃，提取2 h，冷卻。將冷卻后料液進(jìn)行抽濾，漏斗中殘留物繼續(xù)用醇溶液潤洗3次，每次10 mL。將合并后濾液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，蒸發(fā)溫度50℃，得乙醇提取物。

1.3.4 異丙醇濃度對(duì)黑木耳醇提物得率的影響

黑木耳粉3.0 g置錐形瓶中，分別加入60%、70%、80%、90%、100% 異丙醇150 mL，超聲處理、回流提取和磁力攪拌同1.3.3，提取溫度110℃，提取2 h，冷卻、抽濾、殘留物潤洗同1.3.3，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)溫度60℃至干，得到異丙醇提取物。

1.3.5 正丁醇濃度對(duì)黑木耳醇提物得率的影響

黑木耳粉3.0 g置于錐形瓶中，分別加入60%、70%、80%、90%、100% 正丁醇150 mL，超聲處理、回流提取和磁力攪拌同1.3.3，提取溫度128℃，提取2 h，冷卻、抽濾、殘留物潤洗同1.3.3，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)溫度70℃至干，得到正丁醇提取物。

1.3.6 總黃酮含量測(cè)定

采用三氯化鋁吸光度法測(cè)定黑木耳中總黃酮含量，選擇蘆丁作為標(biāo)準(zhǔn)品，按照文獻(xiàn)[8]方法進(jìn)行蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線制備。

分別將90%乙醇醇提物0.324 g、100%異丙醇醇提物0.305 g、70%正丁醇醇提物0.162 g用適量無水乙醇溶液充分溶解，定容至10 mL。準(zhǔn)確量取待檢樣品1.00 mL，加無水乙醇至10 mL，其他操作同標(biāo)準(zhǔn)曲線。同時(shí)做樣品空白試驗(yàn)（不加氯化鋁顯色液，其他操作相同），靜置20 min，在415 nm波長處以無水乙醇調(diào)節(jié)零點(diǎn)，先測(cè)樣品空白吸光度值，再測(cè)樣品吸光度值，樣品吸光度減去空白吸光度的數(shù)值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算得總黃酮含量。

1.3.7 多酚含量測(cè)定

采用福林-酚比色法，標(biāo)準(zhǔn)品選用沒食子酸，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算多酚含量[14]。

沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)液濃度0.1 mg/mL。

1.3.7.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

分別移取0.00、0.25、0.50、0.75、1.00、1.25、1.50 mL沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)液置于25 mL具塞試管中，分別加入福林酚試劑1 mL，搖勻，分別加入12%碳酸鈉溶液2 mL，用去離子水定容至25 mL，搖勻。室溫下避光反應(yīng)1 h，于765 nm波長下測(cè)定吸光度，用去離子水調(diào)節(jié)零點(diǎn)，以沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度為橫坐標(biāo)，以吸光度為縱坐標(biāo)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.7.2 樣品吸光度的測(cè)定

分別將90%乙醇醇提物0.324 g、100%異丙醇醇提物0.305 g、70%正丁醇醇提物0.162 g用去離子水充分溶解，并定容至100 mL容量瓶。量取待測(cè)樣品1 mL加入福林酚試劑1 mL，同上方法測(cè)定吸光度，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算多酚含量。

1.3.8 三萜類化合物含量測(cè)定

采用白樺脂醇為標(biāo)準(zhǔn)品，5%香草醛-冰醋酸和高氯酸為顯色劑，通過紫外分光光度法測(cè)定三萜類化合物含量。此法已被江西疾病預(yù)防控制中心用于靈芝產(chǎn)品的質(zhì)量評(píng)定[13，14]。

（1）白樺脂醇標(biāo)準(zhǔn)溶液制備：精確稱取白樺脂醇50 mg，用無水乙醇充分溶解，再用無水乙醇定容至100 mL容量瓶中，制成0.5 mg/mL白樺脂醇溶液待用。

（2）5%香草醛-冰醋酸的制備：精確稱取10 g香草醛粉末，用冰醋酸溶解并定容至200 mL容量瓶中。放入冰箱待用。

1.3.8.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

分別吸取0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mL的白樺脂醇標(biāo)準(zhǔn)溶液于25 mL具塞試管中，水浴蒸干后分別加入5%香草醛-冰醋酸0.5 mL，然后加入高氯酸0.8 mL，于60℃水浴鍋中加熱15 min后取出冷卻，加冰醋酸定容至25 mL。搖勻，以冰醋酸調(diào)節(jié)零點(diǎn)，測(cè)定吸光度。以白樺脂醇質(zhì)量為橫坐標(biāo)，以吸光度為縱坐標(biāo)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.8.2 樣品吸光度測(cè)定

分別將90%乙醇醇提物0.324 g、100%異丙醇醇提物0.305 g、70%正丁醇醇提物0.162 g用冰醋酸充分溶解，并定容至10 mL容量瓶，放入冰箱待用。量取待測(cè)樣品0.1 mL水浴蒸干后，加0.5 mL 5%香草醛-冰醋酸，加0.8 mL高氯酸，同上方法測(cè)定吸光度，通過曲線計(jì)算樣品總?cè)坪俊?/p>

1.3.9 RRPM中總黃酮、多酚、三萜類化合物含量的測(cè)定

黑色素提取方法：80目黑木耳粉加入50倍體積蒸餾水，80℃水浴1.5 h，重復(fù)2次，去除多糖等水溶性成分，8000 r/min離心15 min，殘?jiān)?0℃干燥，粉碎過100目篩，加入30倍體積3 mol/L鹽酸溶液，70℃水浴1 h，8000 r/min離心15 min，沉渣加入3 mol/L NaOH溶液調(diào)pH為12，70℃水浴浸提1 h，10 750 g離心15 min，上清液酸沉過夜得黑色素，沉渣用蒸餾水洗三次，60℃干燥得到黑木耳提取多糖和黑色素后殘?jiān)≧esidues Removed Polysaccharides and Melanin，RRPM）。將RRPM用90%乙醇、100%異丙醇和70%正丁醇醇提，總黃酮、多酚、三萜類化合物測(cè)定方法同前。

2 結(jié)果與分析

2.1 黑木耳醇提物最優(yōu)濃度確定

2.1.1 乙醇濃度對(duì)黑木耳醇提物得率的影響

不同乙醇濃度的黑木耳醇提物得率如圖1-a所示，隨著乙醇濃度增加，黑木耳醇提物得率呈現(xiàn)先增加后平穩(wěn)的趨勢(shì)，當(dāng)濃度為80%時(shí)，醇提物得率為7.5%，濃度為90%時(shí)，醇提物得率為10.7%，濃度達(dá)到100%時(shí)，得率增加不明顯，為11.5%，這可能由于乙醇濃度過高使得黑木耳中一些物質(zhì)，如蛋白質(zhì)等發(fā)生凝固變性，使收率不再增加，因此90%乙醇溶液為最佳。

2.1.2 異丙醇濃度對(duì)黑木耳醇提物得率的影響

不同異丙醇濃度的黑木耳醇提物得率如圖1-b所示，隨異丙醇濃度增加，黑木耳醇提物得率一直保持增長趨勢(shì)，當(dāng)異丙醇濃度為100%時(shí)，醇提物得率達(dá)到10.1%。這可能由于異丙醇濃度越高，黑木耳中能溶于異丙醇的成分越多，因此100%異丙醇溶液為最佳。

2.1.3 正丁醇濃度對(duì)黑木耳醇提物得率的影響

不同正丁醇濃度的黑木耳醇提物得率如圖1-c所示，隨正丁醇濃度增加，黑木耳醇提物得率呈現(xiàn)緩慢增長趨勢(shì)，當(dāng)濃度為60%時(shí)，醇提物得率為2.7%，濃度為70%時(shí)，得率可達(dá)5.4%，但當(dāng)濃度繼續(xù)增加時(shí)，得率增加并不明顯，這可能由于正丁醇70%以上濃度對(duì)黑木耳中可溶于正丁醇的物質(zhì)溶出率影響不大。因此70%正丁醇溶液為最佳。

2.2 黑木耳醇提物中總黃酮、多酚、三萜類化合物含量

2.2.1 黑木耳醇提物中總黃酮含量

用蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液建立標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖2），得線性回歸方程，由樣品吸光度值計(jì)算得樣品總黃酮含量。乙醇、異丙醇、正丁醇醇提物中總黃酮含量見表1。

2.2.2 黑木耳醇提物中多酚含量

沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖3所示，由樣品吸光度值計(jì)算得樣品多酚含量。乙醇、異丙醇、正丁醇醇提物中多酚含量見表1。

2.2.3 黑木耳醇提物中三萜含量

三萜含量測(cè)定方法得到白樺脂醇標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖4。乙醇、異丙醇、正丁醇醇提物中總?cè)坪繙y(cè)定結(jié)果見表1。

2.3 RRPM醇提物中總黃酮、多酚和總?cè)茰y(cè)定

圖1 乙醇、異丙醇和正丁醇濃度對(duì)黑木耳醇提物得率的影響

表1 黑木耳醇提物總黃酮含量

圖2 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖3 沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖4 白樺脂醇標(biāo)準(zhǔn)曲線

RRPM乙醇提取獲得醇提物得率為13.8%；異丙醇提取獲得醇提物得率為14.3%；正丁醇提取獲得醇提物得率為8.9%。乙醇、異丙醇醇提物中總黃酮、多酚和總?cè)坪咳绫?所示。

3 小結(jié)

在同樣提取條件下，90%乙醇和100%異丙醇獲得的黑木耳醇提取物收率（10.7%和10.1%）均相當(dāng)于70%正丁醇（5.4%）的2倍。

最優(yōu)條件提取的各組黑木耳醇提物中，經(jīng)分析測(cè)定可知：乙醇作為提取劑獲得的醇提物中總?cè)频暮浚?.55%）顯著高于異丙醇（0.37%）和正丁醇（0.30%）（P＜0.01）；而正丁醇作為提取劑獲得的醇提物中多酚的含量（1.68%）顯著高于乙醇（0.43%）和異丙醇（0.66%）P＜0.01。三者醇提物中的總黃酮含量有差異（分別為5.68 mg/100 g、4.84 mg/100 g和4.07 mg/100 g。），其中乙醇提取總黃酮含量最高，與正丁醇提取的總黃酮收率比較差異極顯著（P＜0.01）。

RRPM的90%乙醇、100%異丙醇和70%正丁醇醇提物得率與對(duì)應(yīng)黑木耳的醇提物得率相比分別高2.1%、4.2%和3.5%；RRPM的三種醇提物中總黃酮含量均比黑木耳醇提取中大幅增加（分別增加2.6 mg/100 g、7.15 mg/100 g和 8.31 mg/100 g）；而多酚含量均比黑木耳粉醇提物中有所降低；總?cè)坪坎町惓尸F(xiàn)不規(guī)律狀態(tài)即RRPM乙醇提取物中的總?cè)坪勘群谀径鄞继嵛镏械目側(cè)坪看蠓档?，而異丙醇和正丁醇提取物中的總?cè)坪勘群谀径鄞继嵛镏械目側(cè)坪坑休^大增加，差異顯著（P＜0.01）。試驗(yàn)結(jié)果為黑木耳活性成分的進(jìn)一步研究和開發(fā)提供參考。