熊海燕，陳 鈞

（武漢軟件工程職業(yè)學院，武漢市藥物增溶工程技術研究中心，湖北武漢 430205）

水產品是人類優(yōu)質蛋白質的主要來源之一，富含人體必需的8種氨基酸[1]。但由于水分含量較高、組織柔軟，且自身易攜帶大量細菌，在貯運、加工與銷售過程中，往往容易引起變色、變味，甚至腐敗變質，大大降低了食用價值。因此，對漁獲后的水產品應當及時采取相應的保鮮處理措施，以延長貨架期。

水產品的保鮮方法有物理、化學、生物方法等，其中從動植物、微生物中提取或利用現代生物工程技術得到的生物保鮮劑，如溶菌酶、乳菌鏈球菌素、茶多酚、殼聚糖、蜂膠、植酸、紅曲色素、魔芋葡甘聚糖、生姜汁和魚精蛋白等，一些安全、營養(yǎng)的生物保鮮劑越來越受人們的關注。例如，從食品安全級微生物——乳酸鏈球菌發(fā)酵產物中提取獲得的由34個氨基酸組成的多肽化合物——乳酸鏈球菌素屬于天然的蛋白類物質，對于人體很安全，其對細菌具有形成孔道和抑制細胞壁合成的雙重作用機制，對細菌芽孢也具有明顯的抗菌活性，從而實現了工業(yè)化生產、純化了用于商業(yè)的細菌素[2]。納他霉素具有廣譜、高效、安全等特點，主要用于食品表面防腐。魔芋葡甘聚糖是魔芋的主要成分，由葡萄糖和甘露糖按一定比例通過β-1，4糖苷鍵聚合而成，可抑制微生物的生長，具有良好的水溶性、膠凝性和成膜性，適合作為涂膜保鮮的基質[3]。生姜具有清除自由基、抗炎、抑制超敏反應等藥用保健功能，姜汁對細菌具有明顯的抑制作用。這些生物保鮮劑可以減少化學合成殺菌劑對人類健康的不良影響，有效防止病原菌的抗藥性，被認為是食品添加劑研究領域最有前景的發(fā)展方向。

湖北是魚米之鄉(xiāng)，水產豐富，水產品如何保鮮的問題吸引了眾多科研工作者的關注，以單一因子或通過柵欄技術對水產品進行防腐保鮮的研究報道不斷涌現，其保鮮效果的評判指標主要有感官品質、菌落總數、pH值、水分活度、揮發(fā)性鹽基氮等。而少見以抑菌圈直徑為評判指標進行研究。但在微生物學上，抑菌圈大小是評判藥劑抑殺菌效果的重要依據。因此，試驗選取乳酸鏈球菌素、檸檬酸、魔芋葡甘聚糖、生姜汁、海藻酸鈉、甘氨酸6種生物保鮮劑對鯽魚進行保鮮處理，獲得各保鮮劑合適的質量濃度，再進行抑菌圈試驗，比較抑菌作用效果，以期為鯽魚保鮮提供安全有效的生物保鮮劑。

1 材料與方法

1.1 材料與設備

1.1.1 材料與試劑

（1） 新鮮活鯽魚。每尾質量約500 g，去頭尾、內臟，清洗，切成3 cm×4 cm的塊狀，備用。

（2） 試劑。乳酸鏈球菌素、海藻酸鈉、檸檬酸、魔芋葡甘聚糖、甘氨酸，以上試劑均為食品級、生物試劑；生姜，購自學校附近集貿市場。

（3） 供試菌種。金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌，武漢軟件工程職業(yè)學院微生物實驗室提供。

（4） 培養(yǎng)基。牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基、M-H瓊脂培養(yǎng)基（生物試劑）。

（5）保鮮材料。PE保鮮膜，規(guī)格30 cm×30 m。

1.1.2 儀器與設備

250B型生化培養(yǎng)箱、DZKW-0-2型恒溫水浴鍋、KK19V41TI型冰箱、ALC210.4型電子天平、SW-CJ-2F型超凈工作臺、DHG型電熱恒溫鼓風干燥箱。

1.2 試驗方法

1.2.1 6種生物保鮮劑最佳質量濃度的篩選

將生姜榨汁，配成生姜原液，按表1配成相應質量濃度的生姜汁；選取乳酸鏈球菌素、檸檬酸、魔芋葡甘聚糖、海藻酸鈉、甘氨酸5種保鮮劑，以無菌水為溶劑，按照表1配制成溶液。將新鮮魚塊分別放入上述保鮮劑共24瓶溶液中，5 min后取出，采用保鮮膜包好后放入培養(yǎng)皿中，置于恒溫培養(yǎng)箱中，于37℃條件下培養(yǎng)24 h后取出，搗碎，稀釋至1×10-6，分別取1 mL置入無菌平皿中，傾入牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，混勻，于37℃條件下倒置培養(yǎng)48 h后計數。再根據菌落總數確定各生物保鮮劑的最佳質量濃度。

6種生物保鮮劑最佳質量濃度篩選試驗設計見表1。

1.2.2 6種最佳質量濃度生物保鮮劑的抑菌試驗

采用篩選出的6種最佳質量濃度生物保鮮劑進行體外抑菌試驗。試驗流程如下。

表1 6種生物保鮮劑最佳質量濃度篩選試驗設計/g·100 mL-1

配制菌懸液→配制保鮮劑→自制保鮮劑濾紙片→進行抑菌試驗→測量抑菌圈直徑。

（1） 菌懸液的制備。將供試菌金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、大腸桿菌分別接種到斜面牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上，再培養(yǎng)18～24 h，取出后使用5 mL無菌生理鹽水洗出，稀釋成質量濃度為1×107～1×108CFU/mL的菌懸液置于無菌操作室內備用。

（2） 配制保鮮劑。以無菌水為溶劑，根據“1.2.1”的試驗結果配制各保鮮劑溶液100 mL。

（3）自制保鮮劑濾紙片。將定性濾紙用打孔器制備一定數量的6 mm直徑的圓形小紙片，將其放入潔凈空瓶中包扎，于0.1 MPa壓力下20 min高壓滅菌，取出，置37℃烘箱內烘干，在“1.2.2（2）”已配制好的100 mL各保鮮劑中分別放入12片，翻動紙片，使各紙片充分浸透藥液后取出，放入37℃溫箱內稍許烘干備用。另以無菌水浸過的濾紙片做空白對照。

（4）抑菌試驗。①倒平板，將M-H瓊脂培養(yǎng)基溶化后倒平板，要求平皿中培養(yǎng)基為4 mm的均勻厚度。使用前將培養(yǎng)基放在37℃培養(yǎng)箱中培育30 min，使其表面干燥。②接種，無菌操作，用無菌吸量管分別吸取培養(yǎng)24 h的供試菌金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、大腸桿菌100 μL菌液到M-H瓊脂培養(yǎng)基中，用無菌涂布棒進行涂布。③貼濾紙條，用無菌鑷子取自制保鮮劑濾紙片分別貼在平板上。每個平板貼5片（周圍4片為同一種保鮮劑同一濃度濾紙片，中間1片為空白），每片間距不少于為24 mm，紙片中心離皿邊不少于15 mm，在菌接種后15 min內貼完紙片。④培養(yǎng)、觀察，將接種后的平板倒置于37℃恒溫箱保溫培養(yǎng)24 h后，取出，用游標卡尺測量抑菌圈直徑大小，記錄并計算平均值。

2 結果與分析

2.1 6種生物保鮮劑最佳質量濃度的篩選結果

通過平皿計數法，得到6種生物保鮮劑不同質量濃度處理的菌落總數大小順序如下：

生姜汁 （g/100 mL） 75＞25＞50＞100，乳酸鏈球菌素 （g/100 mL） 0.15＞0.05＞0.10＞0.20，檸檬酸（g/100 mL）0.40＞0.70＞1.00＞1.30，魔芋葡甘聚糖 （g/100 mL） 0.80＞1.00＞0.60＞0.40，海藻酸鈉 （g/100 mL） 0.50＞1.00＞2.00＞1.50，甘氨酸 （g/100 mL） 0.05＞0.10＞0.15＞0.20。

由此確定各保鮮劑最佳質量濃度分別為100g/100mL生姜汁，0.20 g/100 mL乳酸鏈球菌素，1.30 g/100 mL檸檬酸，0.40 g/100 mL魔芋葡甘聚糖，1.50 g/100 mL海藻酸鈉，0.20 g/100 mL甘氨酸。

2.2 6種最佳質量濃度生物保鮮劑抑菌效果的比較

6種生物保鮮劑體外抑菌效果（X±s，n=4） 見表2。

表2 6種生物保鮮劑體外抑菌效果（X±s，n=4）/mm

由表2可以看出，對金黃色葡萄球菌，抑菌圈直徑由大到小順序為1.30 g/100 mLL檸檬酸＞100 g/100 mL生姜汁＞0.40 g/100 mL魔芋葡甘聚糖＞0.20 g/100 mL乳酸鏈球菌素=1.50 g/100 mL海藻酸鈉；對大腸桿菌，抑菌圈直徑大小順序為1.30 g/100 mL檸檬酸與0.40 g/100 mL魔芋葡甘聚糖抑菌效果相當，抑菌圈直徑最大，后面依次是100 g/100 mL生姜汁、0.20 g/100 mL乳酸鏈球菌素、1.50 g/100 mL海藻酸鈉；對枯草芽孢桿菌，抑菌圈直徑由大到小順序為1.30 g/100 mL檸檬酸＞100 g/100 mL生姜汁=1.50 g/100 mL海藻酸鈉＞0.20 g/100 mL乳酸鏈 球菌素＞0.40 g/100 mL魔芋葡甘聚糖。相比較而言，1.30 g/100 mL檸檬酸抑菌效果最好，0.20 g/100 mL甘氨酸幾乎無抑菌效果。

3 結論

從試驗結果看，檸檬酸對革蘭氏陽性菌（金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌）和革蘭氏陰性菌（大腸桿菌）均有較強的抑菌效果，生姜汁、魔芋葡甘聚糖抑菌效果較好，海藻酸鈉、乳酸鏈球菌素的抑菌效果一般，甘氨酸幾乎無抑菌效果。

研究選擇的菌種均為實驗室常規(guī)典型菌種，與引起淡水魚腐敗變質的菌種（假單胞菌屬、無色桿菌屬、黃桿菌屬、摩氏桿菌屬等[4]）存在一定差異。在研究保鮮劑的抑菌效果時，不同保鮮劑對不同菌種的抑殺菌效果會有所不同，但研究方法應該是一樣的。試驗中1.30 g/100 mL檸檬酸抑菌效果最好，作為一種有機酸，不僅改變環(huán)境pH值，影響微生物抗熱性，還賦予鮮切鯽魚一定的酸味，是一種理想的水產品保鮮劑，但到底是單一使用的效果好還是與其他生物防腐劑復配效果好還需進一步探討。