張麗娟 龐志宇 李得堂 周小軍 黃育生 劉媛

變應(yīng)性鼻炎（allergic rhinitis,AR）是特應(yīng)性個(gè)體接觸變應(yīng)原后，由免疫球蛋白E（IgE）介導(dǎo)的鼻黏膜非感染性炎癥性疾病[1]。AR的發(fā)病機(jī)制目前尚未完全明確，其發(fā)生發(fā)展是一個(gè)復(fù)雜的過程，已經(jīng)成為國內(nèi)外研究的熱點(diǎn)和難點(diǎn)[2-8]，通過對AR發(fā)病機(jī)制更深入的研究，發(fā)現(xiàn)其機(jī)制已經(jīng)由Th1/Th2失衡模式擴(kuò)展到 Th17/Treg 細(xì)胞免疫失衡模式[4，9，10]。Th17細(xì)胞是一種獨(dú)特的Th細(xì)胞亞群，轉(zhuǎn)錄因子維甲酸相關(guān)孤核受體-γt（Retinoid-related orphan nuclear receptor γt，ROR-γt）是其調(diào)節(jié)免疫平衡中關(guān)鍵的調(diào)控基因，調(diào)節(jié)Th17/Treg之間的平衡[11]。調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg）是一群維持體內(nèi)穩(wěn)態(tài)的CD4 T細(xì)胞亞群，對體內(nèi)免疫反應(yīng)起到抑制的作用。叉狀頭/翅膀狀螺旋轉(zhuǎn)錄因子 (Transcription factor Forkhead box P3，F(xiàn)oxp3)是Treg細(xì)胞發(fā)育、分化及發(fā)揮功能的關(guān)鍵特征性的轉(zhuǎn)錄因子，對Treg細(xì)胞的免疫抑制活性具有至關(guān)重要的作用[12]。ARIA指南根據(jù)患者癥狀的持續(xù)時(shí)間和嚴(yán)重程度，將AR分為4種臨床類型：輕度間歇性、中-重度間歇性、輕度持續(xù)性、中-重度持續(xù)性[13，14]。AR屬于中醫(yī)學(xué)中的“鼻鼽”范疇，有多種證型，其中肺氣虛寒型較為常見。本文通過檢測不同分類與分度的肺氣虛寒型AR患者外周血中轉(zhuǎn)錄因子ROR-γt、Foxp3 、ROR-γt/Foxp3的表達(dá)，為深入研究肺氣虛寒型AR的Th17/Treg細(xì)胞免疫失衡機(jī)制提供臨床基礎(chǔ)的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

材料與方法

1 材料

1.1實(shí)驗(yàn)儀器試劑

7500Real-time PCRSystem（美國 ABI公司），GeneAmp*PCR System 9700（美國 ABI公司），Trizol Reagent（美國 Invitrogen公司），Bio-Rad Smart-SpecTM Plus Spectrophotometer（美國 Bio-Rad公司），蛋白電泳儀（美國Bio-Rad公司），凝膠成像系統(tǒng)（美國Bio-Rad公司）。

1.2試劑

SYBR Premix Ex Taq II(Tli RNaseH Plus)（Takara公司），Takara Mimi BRST universal RNA Extraction Kit（Takara公司）,PrimeScript RT Master Mix(Perfect Real Time)（Takara公司）。

2 方法

2.1肺氣虛寒型AR病例的收集及分類與分度

選取我院門診、住院患者確診但未經(jīng)治療的肺氣虛寒型AR患者19例：男8例，女11例，平均年齡29.7歲，年齡范圍為（24～49）歲；對照組為健康志愿者10例：男5例、女5例，平均年齡34.3歲，年齡范圍為（22～53）歲，入選對照組者均無過敏性疾病的病史，所有患者及健康對照者均簽署知情同意書。

19例的肺氣虛寒型AR患者，均依據(jù)《中醫(yī)病癥診斷療效標(biāo)準(zhǔn)》[15]，符合鼻鼽癥狀。對收入的肺氣虛寒型AR病例依據(jù)“變應(yīng)性鼻炎診斷和治療指南(2015年，天津)[1]”，并參考美國耳鼻咽喉頭頸外科學(xué)會(huì)推薦的變應(yīng)性鼻炎臨床實(shí)踐指南，進(jìn)行分類及分度[13，14]，完成鼻癥狀總分（TNSS）評分、鼻伴隨癥狀總分（TNNSS）評分、生命質(zhì)量調(diào)查問卷（RQLQ）積分評分和視覺模擬量表（VAS）評分。根據(jù)患者癥狀發(fā)生的頻率及持續(xù)的時(shí)間進(jìn)行分類：分為持續(xù)性AR和間歇性AR。持續(xù)性：癥狀≥4d/周，且≥連續(xù)4周；間歇性：癥狀＜4d/周，或＜連續(xù)4周。根據(jù)患者癥狀的嚴(yán)重程度，以及是否影響患者生活質(zhì)量(包括睡眠、日常工作、生活和學(xué)習(xí))進(jìn)行分度：分為中-重度AR和輕度AR。中-重度：癥狀明顯或嚴(yán)重，對生活質(zhì)量產(chǎn)生影響；輕度：癥狀較輕，癥狀存在時(shí)對生活質(zhì)量尚未產(chǎn)生影響。19例肺氣虛寒型AR患者分類及分度：輕度間歇性 AR（Mild intermittent AR，MI AR）4例；輕度持續(xù)性AR（Mild persistent AR，MP AR）4例；中-重度間歇性 AR（Moderate to severe intermittent AR，MSI AR）8例；中-重度持續(xù)性AR（Moderate to severe persistent AR，MSP AR）3例。

2.2外周血檢測標(biāo)本的采集

對納入標(biāo)準(zhǔn)的肺氣虛寒型AR組及對照組，清晨空腹采集外周靜脈血2ml，置于肝素納抗凝的取血管中，液氮保存，備用。

2.3RT-qPCR檢測ROR-γt mRNA和Foxp3 mRNA表達(dá)

2.3.1總RNA提取和鑒定

取備用的樣品，每個(gè)孔加入Trizol試劑1ml，按Trizol試劑說明書進(jìn)行。室溫，反復(fù)吹打，裂解5min。裂解產(chǎn)物轉(zhuǎn)到新EP管中，在25℃下，靜置5min，加入三氯甲烷 200μl，震蕩 15s，在 25℃下，靜置 5min。在4℃下，12000rpm離心5min，液體分為3層，無色液體層轉(zhuǎn)移到新的EP管中。加入異丙醇500μl，上下顛倒，混勻，在25℃下，靜置10min。在4℃下，12000rpm離心15min，棄上清，白色沉淀中加入75%的無水乙醇溶液1ml，洗滌沉淀。10000rpm離心5min，棄無水乙醇液，干燥5min后。加入30μl DEPC處理過的去離子水，使沉淀溶解。取純化后的RNA1μL，紫外分光光度計(jì)進(jìn)行檢測純度，用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA的完整性。

2.3.2cDNA合成

依據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書，37℃15min，85℃15s，4℃逆轉(zhuǎn)錄，瓊脂糖凝膠電泳檢測逆轉(zhuǎn)錄結(jié)果。

2.3.3引物設(shè)計(jì)與合成

檢索 NCBI Genebank里的基因序列，Prime premier 5.0軟件設(shè)計(jì)引物序列合成，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，見表1。

表1 RT-qPCR檢測ROR-γt和Foxp3因子設(shè)計(jì)的引物

2.3.4RT-qPCR的檢測

每個(gè)樣品均進(jìn)行 ROR-γt、Foxp3和內(nèi)參 βactin的RT-qPCR，每個(gè)樣品設(shè)兩個(gè)平行管?？偡磻?yīng)體積 20μl，反應(yīng)條件:95℃30s；95℃15s，60℃ 1min,共40 個(gè)循環(huán)；95℃15s，60℃ 1min，95℃ 15s，60℃ 15s結(jié)束反應(yīng)。計(jì)算ROR-γt mRNA、Foxp3 mRNA及βactin mRNA Ct值的平均值；根據(jù)目標(biāo)基因和βactin Ct值均值計(jì)算樣本目標(biāo)基因?qū)嶋HCt值ΔCt=Ct目標(biāo)-Ctβ-actin，對各樣本 ΔCt進(jìn)行 2-ΔΔCt轉(zhuǎn)換，分析目標(biāo)基因mRNA的表達(dá)，其中ΔΔCt=ΔCt實(shí)驗(yàn)-ΔCt對照（對照為健康對照者）。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。經(jīng)正態(tài)檢驗(yàn)，符合正態(tài)分布者均以±s表示，組間差異比較采用方差分析進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，方差齊采用LSD法進(jìn)行兩兩組間比較，不符合正態(tài)分布者采用秩和檢驗(yàn)。

結(jié)果

1 RT-qPCR檢測的擴(kuò)增曲線及擴(kuò)增效率

提取的總RNA經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定，可見較清晰的條帶，表明總RNA降解較少，且無DNA污染。計(jì)算得ROR-γt、Foxp3和β-actin基因的擴(kuò)增效率分別為96%、98%和95%，擴(kuò)增效率接近于100%，擴(kuò)增效率達(dá)到最佳，因此所用比較Ct的2-ΔΔCt法計(jì)算的基因相對表達(dá)量結(jié)果更接近于真實(shí)值，ROR-γt(A)、Foxp3(B)和 β-actin(C)基因各組的擴(kuò)增曲線，見圖1。

圖 1 ROR-γt(A)、Foxp3(B)和 β-actin(C)基因的擴(kuò)增曲線

2 PCR產(chǎn)物分析

ROR-γt、Foxp3和 β-actin基因 PCR 產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳證實(shí)PCR產(chǎn)物為單一目的條帶，擴(kuò)增產(chǎn)物大小分別為192bp、144 bp及259 bp。ROR-γt、Foxp3和β-actin基因的熔解曲線分析顯示，為單一銳利主峰型，無雜峰，ROR-γt、Foxp3 和 β-actin基因PCR產(chǎn)物的熔解曲線的峰值分別為88.4℃、87.3℃及88.4℃，熔解溫度均一，說明無引物二聚體及非特異性擴(kuò)增，Tm值為60℃，擴(kuò)增產(chǎn)物特異性好，ROR-γt(A)、Foxp3(B)和 β-actin(C)基因各組的溶解曲線，見圖2。

圖 2 ROR-γt(A)、Foxp3(B)和 β-actin(C)基因的溶解曲線

3 肺氣虛寒型 AR患者 ROR-γt、Foxp3及ROR-γt/Foxp3 mRNA的相對表達(dá)量

結(jié)果表明，在19例肺氣虛寒型AR患者外周血中，ROR-γt mRNA 表達(dá)明顯高于對照組（*P＜0.05），而Foxp3 mRNA表達(dá)顯著低于對照組（**P＜0.01）。ROR-γt/Foxp3 mRNA水平顯著高于對照組（**P＜0.01），差異具有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見圖3。

圖3 對照組與肺氣虛寒型AR患者組ROR-γt（A）、Foxp3（B）及ROR-γt/Foxp3（C）mRNA相對表達(dá)的比較。**P＜0.01，*P＜0.05

4 不同分類與分度的肺氣虛寒型AR患者ROR-γt、Foxp3及ROR-γt/Foxp3 mRNA的相對表達(dá)量

結(jié)果表明，在不同分類與分度的肺氣虛寒型AR患者外周血中，中-重度持續(xù)性AR組ROR-γt mRNA、ROR-γt/Foxp3 mRNA表達(dá)顯著高于對照組（**P＜0.01），而Foxp3 mRNA表達(dá)明顯低于對照組（*P＜0.05）。中-重度持續(xù)性AR組ROR-γt mRNA表達(dá)顯著高于輕度間歇性、中-重度間歇性及輕度持續(xù)性（**P＜0.01）。中-重度持續(xù)性 AR組 Foxp3 mRNA表達(dá)顯著低于輕度間歇性（**P＜0.01）。中-重度持續(xù)性AR組ROR-γt/Foxp3 mRNA表達(dá)顯著高于輕度間歇性、中-重度間歇性及輕度持續(xù)性（**P＜0.01），見表 2、圖 4。

表2 對照組與不同分類與分度的肺氣虛寒型AR患者組ROR-γt、Foxp3 及 ROR-γt/Foxp3 mRNA的相對表達(dá)量±s)

表2 對照組與不同分類與分度的肺氣虛寒型AR患者組ROR-γt、Foxp3 及 ROR-γt/Foxp3 mRNA的相對表達(dá)量±s)

注：ROR-γtmRNA相對表達(dá)量，與對照組比較，**P＜0.01；Foxp3 mRNA相對表達(dá)量，與對照組比較，*P＜0.05；ROR-γt/Foxp3 mRNA相對表達(dá)量，與對照組比較，**P＜0.01；不同分類與分度的肺氣虛寒型AR患者組之間比較，△△P＜0.01

組別 例數(shù)（n） ROR-γt Foxp3ROR-γt/Foxp3對照組（Control） 10 0.594±0.103 0.904±0.135 0.554±0.181輕度間歇性AR 4 0.561±0.241△△ 1.056±0.206△△ 0.531±0.345△△中 - 重度間歇性 AR 8 0.630±0.136△△ 0.932±0.1560.676±0.267△△輕度持續(xù)性 AR 4 0.708±0.192△△ 0.844±0.097 0.839±0.328△△中-重度持續(xù)性AR 3 1.355±0.112**△△ 0.540±0.085*△△ 2.569±0.618**△△

圖4 對照組與不同分類與分度的肺氣虛寒型AR患者組ROR-γt（A）、Foxp3（B）及ROR-γt/Foxp3（C）mRNA相對表達(dá)的比較。**P＜0.01，*P＜0.05

討論

目前AR的發(fā)病機(jī)制尚未完全明確，其發(fā)生發(fā)展是一個(gè)復(fù)雜的過程[2-8]，西醫(yī)學(xué)對發(fā)病機(jī)制研究較為成熟的是經(jīng)典的Th1/Th2細(xì)胞免疫失衡學(xué)說。正常狀態(tài)下Th1和Th2細(xì)胞通過所分泌的細(xì)胞因子共同調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫應(yīng)答過程，二者相互制約，相互調(diào)節(jié)，保持動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)。當(dāng)機(jī)體受到變應(yīng)原及相關(guān)刺激因素，Th1/Th2細(xì)胞免疫平衡被打破，Th1細(xì)胞中分泌的因子表達(dá)降低，Th2細(xì)胞中分泌的因子表達(dá)升高，導(dǎo)致Th1/Th2細(xì)胞中因子比值降低，出現(xiàn)失衡狀態(tài)，引發(fā)異常的免疫應(yīng)答。但是隨著研究的進(jìn)一步深入，其機(jī)制已經(jīng)由Th1/Th2失衡模式擴(kuò)展到Th17/Treg失衡模式，形成Th1/Th2/Th17/Treg細(xì)胞的免疫失衡。

Treg細(xì)胞作為重要的免疫抑制細(xì)胞，可作用于多種免疫細(xì)胞，抑制其功能，對體內(nèi)免疫反應(yīng)起抑制作用，已確知Treg細(xì)胞可以抑制Th1細(xì)胞和Th2細(xì)胞的免疫活性，可通過細(xì)胞-細(xì)胞接觸依賴的抑制模式抑制Th細(xì)胞的分化調(diào)節(jié)Th1/Th2的平衡，抑制抗原引起Th2細(xì)胞的分化而強(qiáng)化Th1細(xì)胞的活性，從而達(dá)到抑制變應(yīng)性疾病的發(fā)生[9]。Treg細(xì)胞的數(shù)量減少和功能減退，在AR的發(fā)病過程中發(fā)揮著重要的作用[10]。Foxp3是Treg細(xì)胞特異的分子標(biāo)志物，決定Treg細(xì)胞發(fā)育、分化及發(fā)揮功能的關(guān)鍵特征性的轉(zhuǎn)錄因子，對Treg細(xì)胞的免疫抑制活性具有至關(guān)重要的作用[12]，Treg細(xì)胞發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用依賴于Foxp3高水平穩(wěn)定表達(dá)，Treg細(xì)胞的功能低下可能導(dǎo)致變應(yīng)性疾病發(fā)生[16]。

AR屬于中醫(yī)學(xué)中的“鼻鼽”范疇，有多種證型，其中肺氣虛寒型較為常見，本研究通過檢測不同分類與分度的肺氣虛寒型AR患者ROR-γt mRNA及Foxp3 mRNA的表達(dá)，結(jié)果表明，在19例肺氣虛寒型AR患者外周血中，ROR-γt mRNA表達(dá)上調(diào)，而Foxp3 mRNA表達(dá)下調(diào)，ROR-γt/Foxp3 mRNA水平顯著高于對照組，肺氣虛寒型AR患者Th17/Treg細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)失衡。在不同分類與分度的肺氣虛寒型AR患者外周血中，中-重度持續(xù)性AR組ROR-γt mRNA表達(dá)上調(diào)，而Foxp3 mRNA表達(dá)下調(diào)，ROR-γt/Foxp3 mRNA水平顯著顯著高于對照組，但輕度間歇性、持續(xù)性、中-重度間歇性的ROR-γt mRNA表達(dá)及Foxp3 mRNA表達(dá)與對照組相比不明顯，ROR-γt/Foxp3 mRNA表達(dá)失衡不顯著，可能與AR發(fā)生發(fā)展存在一定的關(guān)聯(lián)性，在AR發(fā)展的早期，可能并沒有出現(xiàn)Th17/Treg細(xì)胞的免疫失衡。

中醫(yī)學(xué)對AR發(fā)病機(jī)制的認(rèn)識(shí)是“由于內(nèi)因、外因合而致病，內(nèi)有稟賦的異常，外有接觸風(fēng)邪、寒邪、異氣的經(jīng)歷，方能發(fā)病”，國醫(yī)大師干祖望先生認(rèn)為，本病與漆瘡?fù)瑢僖活怺17]。在《外科正宗·卷四》提到：“漆瘡由來自異，有感而弗感也”，認(rèn)為人接觸油漆之后發(fā)不發(fā)病關(guān)鍵在于自身，并進(jìn)一步指出了“有感而弗感”的原因在于“人之秉質(zhì)有偏，腠理不密”，明確提出先天體質(zhì)的異常是變應(yīng)性疾病發(fā)生的基礎(chǔ)，秉質(zhì)有偏，或稱為“體質(zhì)特異”，是本病發(fā)病的內(nèi)因，風(fēng)邪、寒邪、異氣與西醫(yī)學(xué)中的變應(yīng)原等同。從輕度間歇性，輕度持續(xù)性，到中-重度間歇性及持續(xù)性的發(fā)病發(fā)展過程中，不斷有外邪的入侵及誘發(fā)，可能Th17/Treg細(xì)胞的免疫失衡也處于動(dòng)態(tài)變化中，中-重度持續(xù)性AR患者，進(jìn)入完全的Th17/Treg細(xì)胞的免疫失衡。