朱朱 袁兆琪 黃成 楊軍 羅旭松

脫細(xì)胞真皮基質(zhì)（ADM）是一種具有良好生物相容性及生物力學(xué)性能的天然來(lái)源材料，臨床上常用于乳房重建或與自體皮片聯(lián)合使用以修復(fù)深度創(chuàng)面[1-3]。由于異體脫細(xì)胞真皮基質(zhì)來(lái)源短缺且價(jià)格昂貴，而異種（豬）脫細(xì)胞真皮基質(zhì)（HPADM）與人來(lái)源ADM（hADM）在組織學(xué)上具有高度相似性，是代替hADM的合適材料[4]。但是，ADM類材料結(jié)構(gòu)過(guò)于致密，植入人體后難以快速、充分地細(xì)胞化及血管化，導(dǎo)致其臨床應(yīng)用受到一定限制[5]。此外，盡管去除了免疫原性的細(xì)胞成分，異種ADM植入人體后仍表現(xiàn)出一定的慢性炎癥反應(yīng)[6]，這是HADM臨床應(yīng)用的兩大限制因素。

脂肪干細(xì)胞（ADSCs）是組織工程研究中廣泛應(yīng)用的種子細(xì)胞[7]，其旁分泌作用能產(chǎn)生一系列的促血管形成及炎癥調(diào)節(jié)因子[8-9]。由于不同的支架材料能形成各自獨(dú)特的生物微環(huán)境，并能通過(guò)細(xì)胞-材料間的相互作用而改變?cè)谄渲猩L(zhǎng)的種子細(xì)胞的生物學(xué)行為[10-11]。因此，我們嘗試探索HADM能否為ADSCs發(fā)揮其旁分泌功能提供合適的、有益的微環(huán)境，并探討ADSCs體外預(yù)培養(yǎng)對(duì)HADM植入人體后的血管化及炎癥反應(yīng)的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

Fisher 344雄性大鼠 （本院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心）；HADM（江蘇優(yōu)創(chuàng)生物醫(yī)學(xué)科技有限公司）；引物（上海生物工程股份有限公司）；CCK-8試劑盒 （Dojindo，日本）；qRT-PCR 試劑盒（Applied Biosystems，美國(guó)）；ADSCs誘導(dǎo)分化試劑盒（Cyagen，美國(guó)）。

動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)過(guò)本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，審批號(hào)：HKDL[2018]214。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 HADM性質(zhì)檢測(cè)

大體觀察：用數(shù)碼相機(jī)在同一高度、相同比例尺下對(duì)HADM進(jìn)行拍攝，顯示其大體形態(tài)。

電鏡檢測(cè)：將HADM放置于2.5%戊二醛中固定，后轉(zhuǎn)至1%的鋨酸中固定；固定后的材料置于梯度乙醇脫水，臨界點(diǎn)干燥，掃描電鏡觀察并拍攝。

組織學(xué)染色：HADM多聚甲醛固定，乙醇干燥脫水，包埋，5 μm厚度切片，HE染色。

1.2.2 ADSCs獲取、培養(yǎng)及鑒定

從大鼠兩側(cè)腹股溝獲取脂肪組織，酶消化法獲取原代ADSCs，以含10%胎牛血清的低糖DMEM在37℃、5%CO2下培養(yǎng)，0.05%胰酶消化換代。

取第2代 ADSCs，以2×105個(gè)/孔的密度接種于6孔板中，按照ADSCs誘導(dǎo)分化試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行誘導(dǎo)分化，茜素紅染色檢測(cè)成骨分化能力、油紅O染色檢測(cè)成脂分化能力。

1.2.3 細(xì)胞材料相容性檢測(cè)

電鏡觀察：將材料裁成24孔板大小（約1.9 cm2），消毒后置于24孔板內(nèi)，按1×105個(gè)/孔的密度接種ADSCs，48 h后進(jìn)行電鏡觀察。

浸提液檢測(cè)材料毒性：材料置于24孔板中，1 mL DMEM（含10%胎牛血清）浸沒(méi)72 h，收集上清液并過(guò)濾。將ADSCs以2×104個(gè)/孔的密度接種于96孔板中，分別用浸提液及普通完全培養(yǎng)基 （低糖DMEM+10%胎牛血清）培養(yǎng) 7 d，于第 1、3、5、7 天加入CCK-8試劑，培養(yǎng)箱孵育2.5 h后于450 nm處行吸光度檢測(cè)。

1.2.4 ADSCs在不同培養(yǎng)條件下的旁分泌因子表達(dá)情況

將ADSCs以1×105個(gè)/孔的密度接種于24孔板或相應(yīng)大小的HADM上培養(yǎng)48 h，用Trizol提取全部細(xì)胞中的RNA，并用qRT-PCR法檢測(cè)ADSCs在不同培養(yǎng)條件下的促血管形成因子（VEGF、HGF、bFGF）、炎癥調(diào)節(jié)因子（TGF-β、iNOS、TSG-6、COX-2）及干性基因（SOX-2）的表達(dá)情況（表 1）。

1.2.5 ADSCs體外預(yù)培養(yǎng)對(duì)HADM植入后的血管化及炎癥反應(yīng)的影響

將 ADSCs以 5×104cells/cm2的密度接種于HADM 上（2 cm×2 cm 大?。?，DMEM+10%胎牛血清培養(yǎng)1周后備用。

在大鼠背部形成一2 cm×2 cm大小的U型皮瓣，掀開皮瓣，將HADM縫合到底部筋膜上并關(guān)閉切口。實(shí)驗(yàn)組移植經(jīng)ADSCs體外預(yù)處理的HADM，對(duì)照組則移植未經(jīng)處理的HADM。術(shù)后4周取材，將樣本與周圍組織一同取出，固定后行組織學(xué)檢測(cè)。1.2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

以GraphPad7軟件分析數(shù)據(jù)，計(jì)量資料以（x±s）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HADM大體形態(tài)、電鏡及組織學(xué)形態(tài)

HADM呈瓷白色，柔軟且有一定彈性，厚度大約0.15 mm。電鏡顯示其粗糙面有絨毛樣外觀而光滑面則有溝壑。HE染色顯示HADM中無(wú)細(xì)胞、皮膚附屬器等成分，真皮基質(zhì)大部分由膠原組成（圖1）。

2.2 ADSCs的培養(yǎng)鑒定及HADM的毒性檢測(cè)

ADSCs呈長(zhǎng)梭形，原代細(xì)胞培養(yǎng)3～4 d可形成集落，約1周后可傳代。成骨誘導(dǎo)28 d后，茜素紅染色可見散在的紅色結(jié)節(jié)；而成脂誘導(dǎo)21 d后油紅O染色可見紅染的脂滴（圖2a-c）。

電鏡觀察顯示，ADSCs在HADM上培養(yǎng)48 h后細(xì)胞黏附良好，細(xì)胞可從材料上伸出類似偽足的結(jié)構(gòu)，證明細(xì)胞能夠完全鋪展。CCK-8結(jié)果顯示，HADM浸提液培養(yǎng)的ADSCs在第1和第7天時(shí)的細(xì)胞增殖情況，與完全培養(yǎng)基培養(yǎng)的ADSCs沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，說(shuō)明HADM無(wú)明顯細(xì)胞毒性；而第 3和第5天時(shí)的增殖速度略慢于完全培養(yǎng)基 （P＜0.05），這可能是由于HADM的浸提液中含有能夠維持ADSCs干性的成分，使得其增殖略慢（圖2d-f）。

2.3 ADSCs在不同培養(yǎng)條件下的旁分泌因子表達(dá)

qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果表明，在HADM微環(huán)境下培養(yǎng)的ADSCs與在普通培養(yǎng)皿上培養(yǎng)的ADSCs相比，其促血管生成因子、炎癥調(diào)節(jié)因子以及干性因子等均有所上調(diào)，且結(jié)果有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）。

其中，參與多條炎癥通路調(diào)節(jié)的TGF-β上調(diào)了2.26倍；編碼PGE2蛋白這一重要巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)的因子COX-2上調(diào)了3.6倍；抗炎因子TSG-6則上調(diào)了4倍；與ADSCs活化相關(guān)的炎癥因子iNOS上調(diào)了2.14倍，而干性因子SOX-2則提高了6.7倍。VEGF、HGF和bFGF是三個(gè)重要的促血管形成因子，在血管形成的3種方式，即血管發(fā)生（Vasculogenesis）、血管新生（Angiogenesis）及動(dòng)脈形成（Arteriogenesis）中均有重要作用，而ADSCs這三種因子表達(dá)在HADM上培養(yǎng)時(shí)比在普通培養(yǎng)皿上培養(yǎng)時(shí)分別升高了2.7倍、1.9倍和8倍（圖3）。

圖1HADM性質(zhì)Fig.1 Characterization of HADM

2.4 ADSCs體外預(yù)培養(yǎng)對(duì)HADM植入體內(nèi)后的血管化及炎癥反應(yīng)的影響

組織學(xué)顯示，經(jīng)預(yù)培養(yǎng)的HADM在體內(nèi)4周后可見大量新生血管形成，且宿主細(xì)胞能夠均勻滲透到材料內(nèi)部；而未經(jīng)處理的HADM中新生血管明顯較少，且主要分布在材料周邊。宿主炎癥反應(yīng)方面，經(jīng)過(guò)預(yù)處理的HADM炎癥反應(yīng)較輕微，且主要集中于材料外周；而未經(jīng)處理的HADM炎癥反應(yīng)明顯更強(qiáng)，炎癥細(xì)胞在材料的中間及周圍廣泛分布。上述結(jié)果提示，ADSCs體外預(yù)培養(yǎng)能夠促進(jìn)移植物植入體內(nèi)后的新生血管形成，并緩解其炎癥反應(yīng)（圖4）。

圖2 ADSCs形態(tài)、多向分化潛能及HADM細(xì)胞毒性Fig.2 Morphology and multilineage differentiation potential of ADSCs and cytocompatibility of HADM

圖3 HADM微環(huán)境對(duì)rADSC旁分泌功能相關(guān)基因的影響（*：P＜0.05）Fig.3 Effect of HADM microenvironmenton on the rADSC paracrine related gene expression(*:P＜0.05)

圖4 體內(nèi)培養(yǎng)4周后各組HADM組織學(xué)觀察Fig.4 Histological analysis of HADM in each group after cultured for 4 weeks in vivo

3 討論

在前期的軟骨構(gòu)建研究中我們發(fā)現(xiàn)，移植物的炎癥反應(yīng)可能是影響組織工程構(gòu)建結(jié)果的重要因素。將軟骨細(xì)胞與支架材料體外預(yù)培養(yǎng)后，軟骨細(xì)胞能夠分泌細(xì)胞外基質(zhì)，包裹支架材料以隔絕材料與宿主組織的直接接觸，從而能夠顯著提升構(gòu)建軟骨的質(zhì)量[12]。雖然HADM去除了免疫原性的細(xì)胞成分，大大降低了其植入體內(nèi)后的宿主免疫反應(yīng)，但仍有不少報(bào)道稱HADM仍能引起慢性炎癥反應(yīng)，從而影響HADM植入體內(nèi)后的效果[13-14]。因此，我們?cè)O(shè)想能否通過(guò)將ADSCs與HADM體外預(yù)培養(yǎng)來(lái)解決以上問(wèn)題。本研究結(jié)果顯示，經(jīng)ADSCs預(yù)培養(yǎng)的HADM植入體內(nèi)后，其炎癥反應(yīng)較對(duì)照組明顯降低。其機(jī)制不同于軟骨細(xì)胞這類成體細(xì)胞，ADSCs并不能分泌可觀的細(xì)胞外基質(zhì)，并且大量研究認(rèn)為，由于移植后復(fù)雜的宿主反應(yīng)，ADSCs的多向分化能力與其治療性作用的關(guān)系也不大，而ADSCs的旁分泌產(chǎn)物則有可能在此過(guò)程中起到關(guān)鍵作用[15]。ADSCs能夠分泌包括促血管形成的VEGF、HGF[16]，調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)的TGF-β、TSG-6等眾多營(yíng)養(yǎng)因子[17]，在促進(jìn)血管形成、炎癥調(diào)節(jié)、抗凋亡、抗瘢痕形成以及調(diào)節(jié)宿主自身的祖細(xì)胞、干細(xì)胞方面有重要作用。有研究報(bào)道，ADSCs能夠改善支架材料植入體內(nèi)后的生物相容性及血管形成[18]，亦與本研究結(jié)果一致。

近期的研究顯示，支架材料由于其拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)、力學(xué)性能、化學(xué)性質(zhì)等的差異，能夠形成特殊的微環(huán)境，通過(guò)細(xì)胞-材料的相互作用對(duì)細(xì)胞行為產(chǎn)生影響[19-20]。然而，HADM能否為ADSCs旁分泌功能提供合適的微環(huán)境，目前尚未有文獻(xiàn)報(bào)道。本研究首次證明，HADM所產(chǎn)生的微環(huán)境能夠提高炎癥調(diào)節(jié)因子（TGF-β、iNOS、TSG-6、COX-2）、 促血管形成因子（VEGF、HGF、bFGF）表達(dá)上調(diào)。 有研究提出，使用聚已酸內(nèi)酯（PCL）材料證明，PCL來(lái)源的電紡絲材料能夠?qū)DSCs的旁分泌功能產(chǎn)生促進(jìn)作用，亦與本研究結(jié)果一致[21]。但不同的是，本研究中，ADSCs在HADM環(huán)境中培養(yǎng)時(shí)，iNOS這一促炎因子的水平亦明顯降低。這可能是由于電紡絲材料制備過(guò)程當(dāng)中的毒性物質(zhì)殘留，或者PCL材料降解時(shí)產(chǎn)生酸性物質(zhì)。作為一種天然來(lái)源的材料，HADM在這一方面有明顯的優(yōu)勢(shì)。

本研究證實(shí)，將ADSCs與HADM體外預(yù)培養(yǎng)能夠促進(jìn)HADM植入體內(nèi)后的血管形成，并緩解其炎癥反應(yīng)。其可能的機(jī)制在于ADSCs旁分泌所產(chǎn)生的營(yíng)養(yǎng)因子，可促進(jìn)了新生血管的形成，并調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)的強(qiáng)度。此外，我們還證明了HADM所產(chǎn)生的微環(huán)境能夠強(qiáng)化ADSCs的旁分泌作用。今后，我們將進(jìn)一步優(yōu)化HADM，從而為其更廣泛的應(yīng)用于臨床奠定基礎(chǔ)。