黃景文 李生強(qiáng) 陳娟 謝麗華 陳玄 葛繼榮

福建省中醫(yī)藥研究院骨質(zhì)疏松證候基因組學(xué)研究室，福建 福州 350001

人口老齡化帶來(lái)的骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis, OP)及其導(dǎo)致的骨折成為了人類(lèi)需要面對(duì)的新問(wèn)題，其顯著的發(fā)病率和引起的死亡率嚴(yán)重影響著中老年人的健康[1]。 骨質(zhì)疏松會(huì)導(dǎo)致限制性肺病、駝背、腹脹和身高降低。常見(jiàn)骨折的部位為髖部、椎骨和腕部[2]。其中與較高死亡率相關(guān)的是髖部骨折，大部分患者會(huì)在骨折發(fā)生后的3～6個(gè)月內(nèi)死亡。多數(shù)幸存患者在他們今后的日常生活中將面臨巨大困難。盡管近年來(lái)對(duì)于骨質(zhì)疏松癥的診治技術(shù)不斷提高，其效果仍較差，減少骨質(zhì)疏松癥導(dǎo)致的骨折及預(yù)防其發(fā)生仍是關(guān)鍵[3]。中醫(yī)認(rèn)為， “腎”與骨存在著密切的內(nèi)部聯(lián)系，即所謂的“腎藏精，精生髓、髓藏于骨中，滋養(yǎng)骨骼”。腎精不足，則致精不充髓，髓無(wú)以養(yǎng)，故骨軟不堅(jiān)。強(qiáng)調(diào)骨的功能是否正常與腎的精氣盛衰密切相關(guān)，并且隨著年齡增長(zhǎng)，腎精逐漸虧虛，髓虧骨萎，則發(fā)生骨質(zhì)疏松，且逐漸加重[4]。通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)手段，獲得治療骨質(zhì)疏松癥中藥復(fù)方的活性成分，識(shí)別復(fù)方中藥物作用靶點(diǎn)，構(gòu)建相關(guān)基因網(wǎng)絡(luò)， 確定調(diào)控的重要信號(hào)通路及子網(wǎng)絡(luò)，分析和處理骨質(zhì)疏松癥相關(guān)的作用機(jī)制，從而方便實(shí)驗(yàn)人員查詢骨質(zhì)疏松的最新數(shù)據(jù)，研究探討骨質(zhì)疏松癥調(diào)控的分子網(wǎng)絡(luò)，將為骨質(zhì)疏松的治療和預(yù)防提供新的途徑。

1 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的概念

以往的藥物研發(fā)遵循“一個(gè)藥物、一個(gè)基因、一種疾病”的模式，然而許多有效的藥物成分是通過(guò)調(diào)節(jié)多個(gè)基因而不是單一目標(biāo)，這就是為什么70%的新藥會(huì)在臨床試驗(yàn)失敗的主要原因。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)[5]是隨著發(fā)現(xiàn)多靶點(diǎn)藥物理念的興起，基于系統(tǒng)生物學(xué)的理論，對(duì)疾病網(wǎng)絡(luò)多靶點(diǎn)進(jìn)行綜合分析的新學(xué)科，它的發(fā)展已逐漸成為一個(gè)熱門(mén)的研究模式。融合了多向藥理學(xué)思想和系統(tǒng)生物學(xué)的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)，將疾病與藥物利用網(wǎng)絡(luò)結(jié)合起來(lái)，通過(guò)分析網(wǎng)絡(luò)間模塊的關(guān)系，進(jìn)行全面的網(wǎng)絡(luò)分析，研究中藥復(fù)方的作用機(jī)制，通過(guò)新方法來(lái)獲得新數(shù)據(jù)和新成果[6]。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究中藥復(fù)方主要可分為四個(gè)部分：① 獲取中藥復(fù)方的活性成分。這部分可通過(guò)數(shù)據(jù)庫(kù)獲得；② 獲得活性成分的可能作用靶點(diǎn)。當(dāng)前獲取活性成分作用靶點(diǎn)的途徑主要是計(jì)算預(yù)測(cè)和數(shù)據(jù)庫(kù)查詢法。計(jì)算預(yù)測(cè)法是利用計(jì)算機(jī)對(duì)活性成分的三維空間結(jié)構(gòu)的模擬計(jì)算，與已知結(jié)構(gòu)的靶點(diǎn)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行對(duì)接，查找可能結(jié)合的結(jié)構(gòu)相似的化合物或者生物大分子，以此來(lái)預(yù)測(cè)中藥復(fù)方潛在的靶點(diǎn)，當(dāng)前常用的預(yù)測(cè)方法是反向分子對(duì)接[7]和化學(xué)相似性搜索[8]等方法。數(shù)據(jù)庫(kù)查詢法主要是基于前期大量實(shí)驗(yàn)和計(jì)算所得出的靶標(biāo)信息開(kāi)發(fā)得到的靶標(biāo)數(shù)據(jù)庫(kù)，如Drugbank[9]、TTD、STITCH[10]、PDTD[11]等，通過(guò)查詢這些數(shù)據(jù)庫(kù)，可以獲得所想要的靶點(diǎn)信息；③ 疾病相關(guān)基因的獲取和網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建。獲取疾病相關(guān)基因可通過(guò)數(shù)據(jù)庫(kù)查詢或者文獻(xiàn)挖掘獲取，數(shù)據(jù)庫(kù)如OMIM[12]、GAD(genetic association database)[13]、GeneCard[14]等。疾病網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建可以將獲取的疾病相關(guān)基因與背景網(wǎng)絡(luò)結(jié)合起來(lái)，得到這些基因間的全部相互作用，通過(guò)最近鄰居法[15]、最短路徑法[16]等算法預(yù)測(cè)藥物可能影響的相關(guān)基因，之后對(duì)病理機(jī)制深入分析；④ 藥物調(diào)控的信號(hào)通路和靶標(biāo)蛋白間的相互作用評(píng)價(jià)。蛋白富集信號(hào)通路的識(shí)別可以通過(guò)現(xiàn)有的信號(hào)通路數(shù)據(jù)庫(kù)KEGG(kyoto encyclopedia of genes and genomes)[17]、Biocarta等將藥物靶標(biāo)蛋白映射到信號(hào)通路中，靶標(biāo)蛋白顯著富集的通路則是藥物調(diào)控的可能通路。藥物靶標(biāo)間的蛋白相互作用的分析能夠確定藥物對(duì)疾病網(wǎng)絡(luò)的影響，但靶標(biāo)蛋白在全基因組的背景網(wǎng)絡(luò)下并不是都能在一起，因此可以通過(guò)啟發(fā)式算法[18]、Steiner最小生成樹(shù)算法[19]、網(wǎng)絡(luò)鄰近度打分算法[20]等來(lái)將藥物作用的靶標(biāo)蛋白相互作用聯(lián)系起來(lái)，這樣有利于對(duì)其治療效果進(jìn)行評(píng)價(jià)，從多方面了解中藥復(fù)方的作用方式。

2 傳統(tǒng)中藥研究與網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)

傳統(tǒng)中藥歷史悠久，在治療復(fù)雜病癥方面因其溫和的治療效果和較低的副作用引起了廣泛的關(guān)注。在西方，越來(lái)越多的人認(rèn)識(shí)到，以多種化合物和多種生物目標(biāo)為特征的中藥比單一的藥物治療更加有效，特別是治療復(fù)雜的慢性疾病，如精神分裂癥、抑郁癥和糖尿病等[21]。盡管中醫(yī)有經(jīng)驗(yàn)，但是缺乏適當(dāng)?shù)姆椒▉?lái)探索特定草藥的具體成分，對(duì)了解疾病的機(jī)制有著不小的挑戰(zhàn)。傳統(tǒng)藥理學(xué)認(rèn)為缺乏對(duì)藥物機(jī)制的理解意味著無(wú)法預(yù)測(cè)藥物的不良影響，從而阻礙了中藥醫(yī)學(xué)的全球化和現(xiàn)代化[22]。

科學(xué)家在基于生物信息學(xué)研究中醫(yī)藥藥理的方面進(jìn)行了大量的研究，構(gòu)建了多種中藥數(shù)據(jù)庫(kù)。TCM[23]數(shù)據(jù)庫(kù)、3D-MSDT[24]、TCMID[25]和TCMDatabase@Taiwan數(shù)據(jù)庫(kù)等，這些數(shù)據(jù)庫(kù)都收錄了大量中藥及其主要的化學(xué)結(jié)構(gòu)。數(shù)據(jù)庫(kù)都是基于系統(tǒng)生物學(xué)理論，利用靶點(diǎn)預(yù)測(cè)和網(wǎng)絡(luò)路徑來(lái)分析解決中藥的復(fù)雜性問(wèn)題[26]。Wang等[27]利用TCMSP系統(tǒng)獲得治療心血管疾病中藥的18個(gè)活性成分，通過(guò)ADME系統(tǒng)檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)中藥的18個(gè)活性成分與218個(gè)治療靶點(diǎn)能發(fā)生相互作用，從而構(gòu)建藥物和靶點(diǎn)之間的網(wǎng)絡(luò)模塊，通過(guò)模塊GO通路富集分析(gene ontology analysis)和KEGG通路分析可以得到這些活性成分與炎癥的發(fā)生、心血管萎縮以及血管生成的相關(guān)通路有著密切的關(guān)系，是一種藥物靶點(diǎn)-信號(hào)通路-器官聯(lián)合治療疾病的新型治療模式。

全面分析破譯中藥配方的化合物，了解中藥的分子機(jī)制在研究中藥中是必不可少的。Liang等[32]采用一種新的方法來(lái)理解六味地黃丸配方的機(jī)制，是對(duì)于傳統(tǒng)中藥的一種新應(yīng)用。研究人員通過(guò)TCM Database@Taiwan[28]數(shù)據(jù)庫(kù)獲得六味地黃丸六味中草藥中的311種化合物，在PubChem上進(jìn)行物化特性計(jì)算[29]，計(jì)算包括分子質(zhì)量MW、脂水分配系數(shù)ALogP、氫鍵數(shù)量HBDs、分子極曲面面積PSA、可旋轉(zhuǎn)鍵的數(shù)量ROTBs以及芳香族的數(shù)量AROMs等在內(nèi)的數(shù)據(jù)，并與已批準(zhǔn)使用的771種藥物[30]進(jìn)行對(duì)比，結(jié)果發(fā)現(xiàn)被批準(zhǔn)使用的藥物分布緊湊，六味地黃丸分布廣并且與被批準(zhǔn)藥物間有很大的重疊，表明六味地黃丸中許多成分具有藥物潛力。再使用藥物相似性方法評(píng)估311個(gè)化合物中能成為藥物的概率，篩選出適合的化合物進(jìn)行CIPHER預(yù)測(cè)可能作用疾病的靶點(diǎn)，結(jié)果篩選出128個(gè)作用靶點(diǎn)。最后將篩選出的化合物和作用靶點(diǎn)構(gòu)建成網(wǎng)絡(luò)，進(jìn)行GO通路富集分析[31]這些化合物所涉及的疾病及通路。

3 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)在骨質(zhì)疏松癥中的應(yīng)用

骨質(zhì)疏松癥是一種代謝性骨疾病，其特征為骨質(zhì)量減少、骨骼的微觀結(jié)構(gòu)損傷、骨骼脆性增加和骨折風(fēng)險(xiǎn)增加。在一定程度上骨質(zhì)疏松癥影響了30%的女性和12%的男性，是全世界主要生活質(zhì)量的問(wèn)題，其防治研究已成為現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究的熱點(diǎn)之一[33]。目前迫切需要找到一個(gè)好的骨質(zhì)疏松標(biāo)志物，因此通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析得到治療靶點(diǎn)是非常必要的。

近年來(lái)有關(guān)骨質(zhì)疏松癥標(biāo)志物的文獻(xiàn)報(bào)道較多，在治療和防治骨質(zhì)疏松癥中有著重要的意義。利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法不僅可高效進(jìn)行蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)的分析，還可對(duì)所有基因產(chǎn)物進(jìn)行全面的功能分析。在網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)發(fā)展的基礎(chǔ)上，目前已累積了大量的蛋白質(zhì)相互作用數(shù)據(jù)，在解讀蛋白質(zhì)分子的作用方面具有重要意義。

3.1 尋找調(diào)節(jié)骨吸收和骨形成的平衡蛋白

Liu等[35]從基因表達(dá)綜合數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得多個(gè)不同的骨質(zhì)疏松表達(dá)譜數(shù)據(jù)，通過(guò)KEGG[34]、維恩圖解(venn diagram analysis)和基因功能相互作用網(wǎng)絡(luò)共同進(jìn)行研究。在不同表達(dá)蛋白中發(fā)現(xiàn)Rho蛋白可以通過(guò)控制骨細(xì)胞來(lái)調(diào)節(jié)骨吸收和骨形成的平衡，溶酶體的途徑、有絲分裂中期和后期以及Rho蛋白發(fā)出的信號(hào)可能被視為治療骨質(zhì)疏松的治療靶點(diǎn)，這些結(jié)論需要進(jìn)一步的研究來(lái)驗(yàn)證。

3.2 識(shí)別治療骨質(zhì)疏松的小分子

Yu等[36]運(yùn)用經(jīng)典的t-test方法處理多個(gè)不同的骨質(zhì)疏松表達(dá)譜數(shù)據(jù)，對(duì)表達(dá)不同的基因進(jìn)行GO富集分析，確定異常調(diào)節(jié)的基因和不正常的信號(hào)通路，并通過(guò)CMap連接圖來(lái)識(shí)別出一些潛在治療骨質(zhì)疏松的小分子。結(jié)果表明，在骨質(zhì)疏松和對(duì)照組中有5 581個(gè)基因發(fā)生了變化，發(fā)現(xiàn)這些基因集中在9個(gè)信號(hào)通路中，主要包括粘附斑信號(hào)通路、MAPK信號(hào)通路和RANK/RANKL/OPG信號(hào)通路。通過(guò)小分子識(shí)別，發(fā)現(xiàn)小分子血根堿可能作為未來(lái)治療骨質(zhì)疏松的新方法，然而這需要進(jìn)一步的研究來(lái)予以證實(shí)。

3.3 發(fā)現(xiàn)相關(guān)信號(hào)通路中的轉(zhuǎn)錄因子

Zhu等[37]通過(guò)分析卵巢切除小鼠與假手術(shù)組的骨質(zhì)疏松表達(dá)譜數(shù)據(jù)，對(duì)不同表達(dá)的基因進(jìn)行GO富集分析和KEGG通路分析進(jìn)行鑒定，運(yùn)用蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)分析(PPI)對(duì)蛋白質(zhì)相互作用、PPI模塊、轉(zhuǎn)錄因子和化學(xué)物質(zhì)進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)分析。對(duì)兩組進(jìn)行比較后發(fā)現(xiàn)，有784個(gè)基因表達(dá)上調(diào)，729個(gè)基因表達(dá)下調(diào)，此外確定了2個(gè)上調(diào)的模塊和6個(gè)下調(diào)模塊;模塊中上調(diào)的基因主要集中在嗅覺(jué)功能和嗅覺(jué)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路上，發(fā)現(xiàn)部分基因?qū)儆谛嵊X(jué)受體家族;模塊中下調(diào)的基因主要集中在DNA復(fù)制起始功能和細(xì)胞周期通路中;發(fā)現(xiàn)的8個(gè)轉(zhuǎn)錄因子中，SP1和ETS-1與絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥有關(guān);化學(xué)物質(zhì)中發(fā)現(xiàn)雌二醇(estradiol)和白藜蘆醇(resveratrol)是相互作用于網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵化學(xué)物質(zhì);推測(cè)嗅覺(jué)作用、細(xì)胞復(fù)制起始通路、嗅覺(jué)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路和細(xì)胞周期路徑可能在絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥中發(fā)揮作用。此外基于網(wǎng)絡(luò)相互分析，可以考慮使用雌二醇和白藜蘆醇進(jìn)行絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的治療。

3.4 在膜蛋白中發(fā)現(xiàn)與骨質(zhì)疏松相關(guān)途徑密切相關(guān)的蛋白

Zeng等[38]使用定量無(wú)標(biāo)記蛋白組學(xué)方法和多個(gè)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法對(duì)骨質(zhì)疏松患者的蛋白進(jìn)行基因富集分析、功能注釋、途徑和網(wǎng)絡(luò)分析，發(fā)現(xiàn)有1 070個(gè)膜蛋白發(fā)生變化。通過(guò)比較這些蛋白表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)36種不同的蛋白質(zhì)在骨密度高低間有不用的表達(dá)。經(jīng)分析后發(fā)現(xiàn)P4HB、ITGB1、CD36和ACTN1與骨質(zhì)疏松相關(guān)途徑密切相關(guān)，包括受體相互作用、鈣離子結(jié)合、白細(xì)胞轉(zhuǎn)移和白細(xì)胞索鈣水平降低。證明了P4HB、ITGB1、CD36和ACTN1對(duì)骨質(zhì)疏松病因有著重要的影響。

3.5 對(duì)于查找中藥治療骨質(zhì)疏松靶點(diǎn)有著預(yù)測(cè)作用

梁學(xué)振等[39]利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)對(duì)中藥補(bǔ)腎活血膠囊進(jìn)行了查找靶點(diǎn)的研究，利用中藥數(shù)據(jù)庫(kù)TCMSP查找出補(bǔ)腎活血膠囊中中藥成分1 186個(gè)及入血活性成分249個(gè)，發(fā)現(xiàn)可作用的預(yù)測(cè)靶點(diǎn)145個(gè)。接著通過(guò)GEO數(shù)據(jù)庫(kù)獲取基因芯片數(shù)據(jù)篩選出124個(gè)差異基因，同時(shí)檢索疾病相關(guān)數(shù)據(jù)庫(kù)獲取已知與骨質(zhì)疏松發(fā)生發(fā)展相關(guān)的靶點(diǎn)基因356個(gè)。通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析骨質(zhì)疏松靶點(diǎn)基因和補(bǔ)腎活血膠囊預(yù)測(cè)靶點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)226個(gè)關(guān)鍵基因。通過(guò)GO分析等篩選出關(guān)鍵基因涉及的信號(hào)通路，如Wnt信號(hào)通路、TGF-β信號(hào)通路、Notch信號(hào)通路、P13 K-AKT信號(hào)通路、VEGF信號(hào)通路和甲狀腺素信號(hào)通路等，這些通路與骨重建、調(diào)節(jié)成骨破骨代謝平衡、骨微環(huán)境等作用相關(guān)，這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果為未來(lái)深入研究補(bǔ)腎活血膠囊治療骨質(zhì)疏松疾病的作用機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

4 結(jié)語(yǔ)

21世紀(jì)是生命科學(xué)大發(fā)展的時(shí)代，隨著計(jì)算機(jī)技術(shù)和信息論方法的不斷進(jìn)步，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)影響的范圍越來(lái)越廣，作為一門(mén)新型學(xué)科，發(fā)揮著其特殊的橋梁作用和整合作用。在中藥治療骨質(zhì)疏松的研究中，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)不僅可以通過(guò)計(jì)算發(fā)現(xiàn)新基因以及確定新的中藥藥物靶點(diǎn)，還可以進(jìn)行創(chuàng)新中藥的研究。新基因的發(fā)現(xiàn)可以讓研究者們更有效地了解骨質(zhì)疏松的分子機(jī)制，新靶點(diǎn)的發(fā)現(xiàn)與確立能幫助人們?cè)谒幬镅邪l(fā)中更早、更快地找到最佳作用靶點(diǎn)，減少研發(fā)時(shí)間。創(chuàng)新藥物的研究具有重要的社會(huì)效益和經(jīng)濟(jì)效益，隨著網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的興起出現(xiàn)了更多的新理論和新思路。運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究方法處理生物信息學(xué)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)、發(fā)現(xiàn)與疾病密切相關(guān)的基因或基因群、進(jìn)行后續(xù)研究驗(yàn)證，是一種新型的、高效的研究途徑。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)現(xiàn)已普遍運(yùn)用于醫(yī)學(xué)的各個(gè)研究思路中，對(duì)于疾病基因的發(fā)現(xiàn)、新藥物作用靶點(diǎn)的發(fā)現(xiàn)、新型藥物的設(shè)計(jì)以及基因芯片的設(shè)計(jì)與芯片數(shù)據(jù)處理等方面起著重要作用。在骨質(zhì)疏松癥治療中促進(jìn)了對(duì)于新的骨質(zhì)疏松標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)，極大提高了對(duì)于骨質(zhì)疏松的診斷和防治水平。