丁聚賢謝興文許偉李寧李鼎鵬黃晉潘鑫戊宋敏蘇積亮宋學(xué)文

1. 甘肅中醫(yī)藥大學(xué)，甘肅 蘭州 730000 2. 甘肅省中醫(yī)藥研究院，甘肅 蘭州 730050 3. 甘肅省中醫(yī)院，甘肅 蘭州 730050

骨質(zhì)疏松癥(osteoporsis，OP)是以全身性骨量減少、骨脆性增加、易發(fā)生骨折為特征的全身代謝性骨病[1]。我國骨質(zhì)疏松的總患病率為6.6%～19.3%，平均為13%，其中約20%的患者會(huì)發(fā)生骨質(zhì)疏松性骨折[2]。OP患者因其自身骨基質(zhì)含量減少，骨密度(bone mineral density，BMD)降低，骨強(qiáng)度下降，骨皮質(zhì)變薄，骨小梁減少，受到輕微暴力即可發(fā)生骨折。有研究表明[3-5]，I型膠原纖維A1基因結(jié)構(gòu)區(qū)的突變、維生素D受體基因多態(tài)性的表達(dá)、雌激素受體基因型的表達(dá)、低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白5基因的突變、骨保護(hù)素(osteoprotegerin，OPG)遺傳多態(tài)性及血清神經(jīng)生長(zhǎng)因子水平的下降均會(huì)導(dǎo)致骨強(qiáng)度降低而增加脆性骨折的風(fēng)險(xiǎn)，其嚴(yán)重影響著OP患者的生活質(zhì)量。因此對(duì)于OP患者來說，在骨折發(fā)生前的防治尤為重要。近年來，葛根的主要有效成分葛根素憑借其具有的類雌激素效應(yīng)在骨質(zhì)疏松癥的治療中取得了較好的療效，越來越多的作用靶點(diǎn)及分子機(jī)制被闡明。本文將從影響OP的相關(guān)分子通路與葛根治療OP的相關(guān)分子機(jī)制方面進(jìn)行綜述，旨在為臨床運(yùn)用葛根治療OP提供方法和思路。

1 調(diào)控骨質(zhì)疏松癥發(fā)生發(fā)展的常見通路及相關(guān)分子機(jī)制

1.1 調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞增殖及分化的相關(guān)分子機(jī)制

生理狀態(tài)下，在骨的生長(zhǎng)周期中，參與骨形成的成骨細(xì)胞(osteoblast，OB)與骨吸收的破骨細(xì)胞(osteoclast，OC)始終處于動(dòng)態(tài)平衡、不斷重建的過程。當(dāng)破骨作用大于成骨作用時(shí)會(huì)導(dǎo)致OP的發(fā)生。任何影響骨細(xì)胞代謝的機(jī)制均會(huì)導(dǎo)致骨代謝紊亂，從而導(dǎo)致OP的發(fā)生，此類機(jī)制也成為了防治骨質(zhì)疏松的入手點(diǎn)。較早進(jìn)行研究的Ca、P元素代謝主要是通過促進(jìn)OB增殖及分化，抑制OC的生成及活性來調(diào)節(jié)骨代謝[6]。近年來，許多影響骨細(xì)胞代謝的信號(hào)通路及小分子機(jī)制不斷被闡明，且某些機(jī)制互相作用并影響。RANKL/RANK/OPG對(duì)維持OB和OC的平衡有著重大意義，與OP的發(fā)生、發(fā)展有著密切的關(guān)系[7]。Ca2+信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑參與調(diào)控RANKL誘導(dǎo)的OC的活化及分化過程，也參與調(diào)控OPG對(duì)OC分化與活化的抑制[8]。

核因子KB(NF-kB)在骨重塑上具有重要的作用，參與著細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化等基因表達(dá)調(diào)控[9]。有研究認(rèn)為[10-11]，生長(zhǎng)轉(zhuǎn)化因子-β(TGF-β)在骨重建中能夠促進(jìn)成骨分化，增強(qiáng)骨密度，抑制OC的活性，促進(jìn)OB成熟。其中TGF-β1是骨代謝重要的偶聯(lián)因子。骨形成蛋白-2(BMP-2)具有誘導(dǎo)OB分化作用，是調(diào)節(jié)骨代謝的重要因子[10]。堿性磷酸酶(ALP)則是細(xì)胞早期礦化階段的主要標(biāo)志[12]。Smad2、Smad3[13]作為TGF-β1信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的信號(hào)分子，其活性間接影響著骨的形成、重塑及礦化過程。Runx2[14]有促成骨效應(yīng)，可誘導(dǎo)BMSCs發(fā)育為OB，缺失將導(dǎo)致骨發(fā)育不良。同時(shí)研究發(fā)現(xiàn)[15]，miR-204負(fù)調(diào)節(jié)Runx2而抑制成骨細(xì)胞基因的表達(dá)。Wnt/β-catenin信號(hào)通路與骨骼發(fā)育、成熟、重建有重要作用，其主要通過調(diào)控OB定向分化及特異基因的表達(dá)，增強(qiáng)OB活性，促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)的礦化過程[16]。有研究顯示[17]，Wnt/β-catenin信號(hào)通路可通過RANK/RANKL/OPG 信號(hào)通路抑制骨吸收，可能與β-catenin能夠上調(diào)成骨細(xì)胞表達(dá)OPG有關(guān)。促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)家族信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑參與細(xì)胞生長(zhǎng)、分化、凋亡等多種生理過程，能通過傳導(dǎo)胞外信號(hào)至胞內(nèi)及其核內(nèi)，激活轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)節(jié)基因表達(dá)[18]，可能與其增加鈣沉積、誘導(dǎo)ALP的表達(dá)有關(guān)。近年研究發(fā)現(xiàn)[19]，其家族成員ERK1/2在OB的增殖分化中發(fā)揮重要作用。PTH信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路既可促OB生成又抑制其凋亡，從而促進(jìn)骨形成代謝[20]，其主要機(jī)制是與受體(PTHR)結(jié)合后通過解離破骨復(fù)合物[21]并會(huì)激活Wnt信號(hào)通路來促進(jìn)骨的合成代謝。

1.2 調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞凋亡的相關(guān)分子機(jī)制

介導(dǎo)OC生成的細(xì)胞因子有RANKL、TNFα、IL-6、TGFβ、IGF I、IGF II等[22]。TNFα相關(guān)因子RANKL可誘導(dǎo)單核細(xì)胞分化為成熟OC，TNFα可通過MEK/ERK信號(hào)通路來抑制OC的調(diào)亡[23]。TGFβ可通過調(diào)節(jié)抗酒石酸酸性磷酸酶活性抑制OC的骨吸收功能[24]。IL-6 能提高OC活性并參與介導(dǎo)機(jī)體雌激素水平的下調(diào)，IGF I、IGF II在所有腫瘤標(biāo)本的基質(zhì)細(xì)胞中均有很強(qiáng)的表達(dá)[25]。若缺失此類細(xì)胞因子，可出現(xiàn)破骨細(xì)胞合成障礙。OPG[26]是一種由OB分泌的糖蛋白，既能促進(jìn)成骨細(xì)胞的分化，也可抑制破骨細(xì)胞的分化與合成，是抑制破骨細(xì)胞分化的關(guān)鍵因子，其基因多態(tài)性與骨強(qiáng)度有著密切關(guān)系。孫自強(qiáng)[27]研究發(fā)現(xiàn)AKT/mTOR/ULK1信號(hào)通路介導(dǎo)APG調(diào)控OC自噬并增強(qiáng)自噬水平。ULK1可促進(jìn)自噬小體的形成，AKT參與著多種細(xì)胞增殖、分化的調(diào)節(jié)，mTOR參與OC的生成。研究發(fā)現(xiàn)[28]，抑制AKT的磷酸化或mTOR活性均會(huì)抑制OC的分化和骨吸收。PPAR家族成員PPAR-γ通過直接調(diào)控骨細(xì)胞的分化而抑制OB活性，促進(jìn)破骨細(xì)胞形成，可能與Wnt 信號(hào)通路抑制有關(guān)[29]。PI3K/AKT/FoXO信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路主要通過對(duì)下游多種增殖和凋亡相關(guān)靶基因(Bmi、Bax、CytC、AIF、Caspase-3為參與增值與凋亡的關(guān)鍵基因)的調(diào)控以及對(duì)Wnt/β-catenin通路的抑制來介導(dǎo)細(xì)胞代謝過程[30-31]。其通道最終通過影響FoxOh系列分子的活性而抑制相關(guān)下游靶基因[32]，進(jìn)而介導(dǎo)成骨細(xì)胞增殖，破骨細(xì)胞凋亡過程。

2 葛根治療OP的相關(guān)分子機(jī)制

2.1 葛根素促進(jìn)成骨分化的分子機(jī)制研究

葛根主要功能成分包括異黃酮類化合物、葛根甙類化合物、三萜皂甙等，其中異黃酮類化合物是葛根的主要有效活性成分[33]。葛根素又稱為葛根黃酮，是葛根提取物中粗異黃酮中的主要單體成分，分子式：C21H20O9，是天然的植物性雌激素。

錢康琦等[34]利用Western Bloting方法檢測(cè)葛根素提取液對(duì)OB 的TGF-β1、Smad2、Smad3基因表達(dá)，發(fā)現(xiàn)葛根素可以抑制TGF-β1蛋白與Smad2/3蛋白的表達(dá)，表明臨床運(yùn)用的葛根素可以通過抑制TGF-P1與Smad2/3基因表達(dá)來抗OP。張瑩瑩[35]的研究發(fā)現(xiàn)過表達(dá)miRNA-204可下調(diào)Runx2的蛋白表達(dá)，葛根素可通過下調(diào)miRNA-204來上調(diào)成骨細(xì)胞Runx2的表達(dá)、促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖和分化。曾祥偉[36]的研究顯示，葛根素可以可提高Runx2的表達(dá)，同時(shí)通過抑制TRPM3的表達(dá)來調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)外的Ca2+濃度，促進(jìn)OB的增殖、分化及礦化。路立花等[13]發(fā)現(xiàn)葛根素通過升高BMP-2的表達(dá)水平，活化ALP活性，從而促進(jìn)生物礦化。李海[37]研究發(fā)現(xiàn)葛根素能使去卵巢大鼠血鈣、血磷和ALP基本恢復(fù)正常，可以起到促進(jìn)礦化的作用。王曉暉等[38]研究發(fā)現(xiàn)在高糖情況下，成骨細(xì)胞的增殖、分化和Ⅰ型膠原mRNA表達(dá)處于抑制狀態(tài)，但加入葛根素后能提高成骨細(xì)胞的增殖、分化和Ⅰ型膠原表達(dá)，證明葛根素對(duì)糖尿病骨質(zhì)疏松癥有治療作用。王昌等[39]研究了葛根素對(duì)氧化應(yīng)激后OB的影響，發(fā)現(xiàn)葛根素對(duì)氧化損傷的OB具有抗氧化和清除氧自由基，增加OB增殖、分化和礦化功能的作用。呂海宏等[40]用葛根素培養(yǎng)液培養(yǎng)OB，檢測(cè)ERα mRNA表達(dá)及細(xì)胞增值率，發(fā)現(xiàn)葛根素能促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖，提髙ALP活性，可能與抑制雌激素受體α(ERα)啟動(dòng)子甲基化、增加ERα mRNA的表達(dá)有關(guān)。胡洪生等[30]的體外實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，葛根素能夠增強(qiáng)OB內(nèi)PI3K/AKT/FoXO信號(hào)通路的活性，抑制OB內(nèi)凋亡基因的表達(dá)量，促進(jìn)OB的增殖?？钓蔚萚41]研究發(fā)現(xiàn)葛根素能夠促進(jìn)ERK1/2蛋白的磷酸化，促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖周期轉(zhuǎn)變，并且能提高細(xì)胞周期蛋白cyclin D1和CDK4 的表達(dá)。由此可見，葛根素在促進(jìn)OB增殖、分化、成熟、骨礦化等方面有著多通絡(luò)、多靶點(diǎn)、以及多通絡(luò)協(xié)調(diào)作用。

2.2 葛根素抑制破骨活性的分子機(jī)制研究

袁斯遠(yuǎn)等[42]應(yīng)用葛根素對(duì)破骨前驅(qū)細(xì)胞RAW 264.7進(jìn)行干預(yù)，觀察葛根素對(duì)體外培養(yǎng)破骨細(xì)胞形成以及成骨細(xì)胞OPG、RANKL mRNA表達(dá)的影響。發(fā)現(xiàn)葛根素能夠抑制RAW 264.7誘導(dǎo)破骨細(xì)胞的形成，且能夠通過作用于成骨細(xì)胞MC3T3-E1上調(diào)OPG mRNA和下調(diào)RANKL mRNA的表達(dá)間接調(diào)控破骨細(xì)胞。黃漫華等[43]通過觀察葛根素對(duì)破骨細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白(LC3和p62蛋白)和AKT-mTOR信號(hào)通路相關(guān)蛋白(AKT、p-AKT)表達(dá)的影響，證明葛根素能有效促進(jìn)破骨細(xì)胞內(nèi)的自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)。早期已證實(shí)p62是自噬活性的有效標(biāo)記蛋白，但AKT-mTOR信號(hào)通路是否為其有效的通路，仍需后期實(shí)驗(yàn)佐證。

2.3 葛根素調(diào)控脂代謝的分子機(jī)制研究

王珣[44]通過體外試驗(yàn)研究絕經(jīng)后大鼠脂肪來源干細(xì)胞(ADSCs)的成骨分化能力，采用含葛根素的培養(yǎng)液進(jìn)行ADSCs的培養(yǎng)誘導(dǎo)，通過ALP檢測(cè)、茜素紅染色，發(fā)現(xiàn)葛根素具有體外促進(jìn) ADSCs 成骨分化的效能，且無毒劑量下其成骨分化效能與濃度呈正相關(guān)，12 μmol/mL 時(shí)為最大有效的無毒劑量。齊振熙等[45]研究發(fā)現(xiàn)中等劑量葛根素可能通過上調(diào)Wnt/β-catenin信號(hào)傳導(dǎo)通路的關(guān)鍵因子Wnt 10b mRNA及β-catenin蛋白的表達(dá)，或降低GSK3β mRNA的表達(dá)從而間接抑制激素誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向成脂分化，多應(yīng)用于激素性股骨頭壞死的治療，但具體作用機(jī)制尚未闡明。也有研究顯示[9,46]，低劑量的葛根素可通過AKT途徑Ser473蛋白的磷酸化促進(jìn)3T3-L1前體脂肪細(xì)胞向成熟脂肪細(xì)胞分化。由此可見，不同劑量下的葛根素可以抑制激素誘導(dǎo)的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向成脂分化，也可以促進(jìn)成熟脂肪細(xì)胞分化，這也提醒我們，從調(diào)節(jié)脂代謝來影響骨細(xì)胞代謝，可能會(huì)是葛根素治療OP的另一條機(jī)制。

3 結(jié)語

骨質(zhì)疏松癥是我國乃至全世界老年人骨折、骨痛的首要原因。其發(fā)病因素多、進(jìn)程緩慢、后期多并發(fā)承重骨的脆性骨折，以脊椎、股骨頸、股骨粗隆、肋骨骨折較為常見。目前臨床治療 OP的西藥主要有抑制骨吸收類(雌激素、雙膦酸鹽類、降鈣素等)和促進(jìn)骨形成類(氟化鈉、他汀類、雄激素、PTH)以及含維生素D的衍生物三大類。葛根素為中藥葛根的三大成分異黃酮類化合物的單體提取物。影響OP的通路與分子機(jī)制較多，因此也成為了治療OP的有效著手點(diǎn)。上述大量實(shí)驗(yàn)研究證明，葛根素在OB和OC的代謝中可以通過多種轉(zhuǎn)導(dǎo)通路、作用于多個(gè)靶點(diǎn)來調(diào)節(jié)骨合成代謝以對(duì)抗OP。同時(shí)，據(jù)上述研究也發(fā)現(xiàn)葛根素在脂代謝調(diào)節(jié)途徑中可間接抑制激素誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向成脂分化，并可促進(jìn)ADSCs向成骨分化，提示調(diào)整脂代謝可能也會(huì)是葛根素治療OP的另一種作用途徑。葛根素治療OP 的研究目前主要以實(shí)驗(yàn)為主，臨床試驗(yàn)研究較少，因此缺乏大樣本、多中心的臨床對(duì)照研究，且有數(shù)據(jù)表明葛根素可以引起發(fā)熱、變態(tài)反應(yīng)、藥疹、過敏性休克，甚至溶血、肝腎功能損害等毒副反應(yīng)[47]，提示研究人員在今后的研究中要逐漸傾向于臨床應(yīng)用及不良事件的排除，令葛根素成為治療OP安全、高效的中藥提取物。