施甜甜，王玉棟

0 引言

小細胞肺癌（small cell lung cancer, SCLC）是一種具有高度侵襲性、致死性和廣泛轉(zhuǎn)移性的肺癌，具有腫瘤生長迅速，血管分布密集，基因組不穩(wěn)定，早期轉(zhuǎn)移等特點，TP53和RB1普遍失活，并常伴有多個信號通路的改變[1-2]。近年來，臨床前研究模型，包括細胞系，基因工程小鼠模型（genetically engineered mouse models, GEMMs）和患者來源的異種移植物（patient-derived xenografts,PDXs），全基因組測序和NGS等生物技術(shù)的發(fā)展大大增加了我們對SCLC分子發(fā)病機制的認識，為改善SCLC診治療效帶來新的曙光[3]。本文將對SCLC的分子發(fā)病機制研究進展進行綜述，探討SCLC基礎(chǔ)和臨床轉(zhuǎn)化研究的未來方向。

1 SCLC的神經(jīng)內(nèi)分泌特征

1.1 SCLC是高級別神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤

1968年，Bensch等在SCLC的組織樣本中發(fā)現(xiàn)稀疏微小而致密的核心顆粒，其為神經(jīng)內(nèi)分泌（neuroendocrine, NE）細胞的超微結(jié)構(gòu)標志，因此推測SCLC是由肺內(nèi)NE細胞產(chǎn)生。上世紀60年代，Pearse提出了 “胺前體吸收和脫羧酶”（amine precursor uptake and decarboxylation, APUD）細胞的概念。APUD細胞有分泌低分子量多肽類激素和生物胺的功能，現(xiàn)在被稱為NE細胞。該假設(shè)認為所有APUD細胞都來自中神經(jīng)嵴，而目前研究認為只有一部分NE細胞起源于神經(jīng)嵴，而另一部分細胞，如肺NE細胞來源于局部多能干細胞。之后研究證明SCLC細胞是具有APUD細胞特性的NE細胞，屬于高級別NE肺癌范疇。

1.2 SCLC神經(jīng)元轉(zhuǎn)錄因子

約75%的SCLCs表達細胞存活和生長所必需的轉(zhuǎn)錄因子acoete-scute同系物1（ASCL1，也被稱為ASH1）[4]。1997年，研究發(fā)現(xiàn)ASCL1是一種可誘導(dǎo)神經(jīng)元細胞和NE細胞分化的主要調(diào)節(jié)因子。ASCL1陽性的SCLC通常表達整套NE標記，ASCL1在神經(jīng)干細胞中表達。同時ASCL1是譜系特異性癌基因，是高級別NE肺癌的潛在治療靶點。ASCL1的表達與delta-like配體3（DLL3）表達緊密相關(guān)（DLL3編碼Notch信號通路的抑制劑），也與RE1沉默轉(zhuǎn)錄因子（REST）的表達缺失有關(guān)（REST可抑制神經(jīng)元細胞和NE細胞的分化）。約15%的SCLC細胞系和腫瘤細胞表達神經(jīng)源性分化因子1（NEUROD1），NEUROD1是一種神經(jīng)元主要調(diào)節(jié)因子，通常與ASCL1相關(guān)。大多數(shù)SCLC表達ASCL1和/或NEUROD1，有些SCLC兩者均表達或均不表達。ASCL1和NEUROD1作用于NE不同功能的基因位點[4]。若ASCL1失活，NEUROD1未失活，可以阻止基因工程小鼠模型中SCLC細胞的形成[4]。ASCL1還作用于癌基因RET，SRY-box 2（SOX2）和核因子I B（NFIB）以及Notch通路中的多個基因，包括DLL3和DLL1，而NEUROD1作用于MYC。從ASCL1到NEUROD1表達的轉(zhuǎn)變可能與SCLC “經(jīng)典”變異亞型有關(guān)。在復(fù)發(fā)的腫瘤中ASCL1表達的缺失更為常見。由MYC過表達導(dǎo)致基因工程小鼠模型的SCLC細胞經(jīng)歷了從ASCL1+/NEUROD1-經(jīng)典亞型到ASCL1-/NEUROD1+變異亞型的快速轉(zhuǎn)變，從而喪失了NE細胞標記[5]。約15%的SCLC缺乏這些轉(zhuǎn)錄因子，也不表達NE細胞標記。因此，變異亞型可能并不是由ASCL1基因驅(qū)動的，而是由NEUROD1基因驅(qū)動，或者二者均不表達[2,4-5]。同源盒蛋白NKX2.1（NKX2-1，也被稱為TTF1）是一種轉(zhuǎn)錄因子，其表達僅限于腦、甲狀腺和肺。其主要在細支氣管分泌細胞和肺泡Ⅱ型細胞中表達，對于外周肺和支氣管NE細胞的發(fā)育至關(guān)重要。TTF1在大多數(shù)肺腺癌中表達，作為譜系特異性的致癌基因發(fā)揮作用。SCLC中TTF1的表達與ASCL1密切相關(guān)，可能在NE的分化中發(fā)揮作用。

1.3 腫瘤干細胞與瘤內(nèi)異質(zhì)性

腫瘤干細胞（cancer stem cells, CSCs）具有胚胎干細胞的諸多特征，具有高致瘤性，可導(dǎo)致一種或多種高度保守的信號通路的持續(xù)激活，且參與細胞發(fā)育和組織內(nèi)穩(wěn)態(tài)。Notch、Hedgehog和WNT等通路在SCLC中均可被激活[6]。CSCs生長速度相對緩慢，對常規(guī)治療耐藥后，需尋找新的治療。方法。研究發(fā)現(xiàn)，與NSCLC相比，SCLC中的CSCs大大增加（>所有腫瘤細胞的50%）。呼吸道上皮細胞包含多個干細胞巢，大多數(shù)SCLCs是由干細胞向NE細胞分化產(chǎn)生的[7]。ASCL1（又稱MASH 1）是SCLC細胞系中的一種致癌轉(zhuǎn)錄因子，在小細胞肺癌CSCs中高表達。最近的研究表明，在小細胞肺癌CSCs表面有Notch配體和ASCL1轉(zhuǎn)錄靶點DLL3的表達：利用抗體-藥物結(jié)合物靶向可能抑制小細胞肺癌細胞生長并阻止腫瘤擴展[8]。在SCLC中，編碼多能干細胞和神經(jīng)細胞分化的重要轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子SOX2常存在擴增和上調(diào)。在SCLC基因工程小鼠模型中，CSC亞群的MYC家族成員存在高表達，特別是MYCL[9]。因此，針對CSCs的潛在治療靶點包括Notch、SOX2和MYC等。

1.4 細胞轉(zhuǎn)化和瘤內(nèi)異質(zhì)性

SCLC可能含有NSCLC成分，通常稱為混合癌[10]。NE細胞由局部多能干細胞分化產(chǎn)生，其有助于我們理解混合癌的概念，也部分解釋了少見的腫瘤轉(zhuǎn)化現(xiàn)象。目前研究已發(fā)現(xiàn)NSCLC可轉(zhuǎn)化成SCLC，其基因型和組織學(xué)的轉(zhuǎn)變是酪氨酸激酶抑制劑治療的獲得性耐藥機制之一，具有SCLC特征的轉(zhuǎn)化腫瘤保留了原始的EGFR突變，并且存在RB1缺失和或TP53突變。對GEMMs的SCLCNSCLC混合癌的研究，證實SCLCs與其他肺部腫瘤有共同起源，且起源于共同的多潛能干細胞或其后代[11]。但值得注意的是，混合腫瘤中具有獨立的SCLC和NSCLC細胞結(jié)構(gòu)，并非轉(zhuǎn)化而來。

2 SCLC遺傳和分子改變

2.1 煙草與SCLC基因突變

全基因組研究大大提高了我們對SCLC分子發(fā)病機制的認識，并闡明了煙霧致癌物在其病因?qū)W中的作用[1]。SCLC和其他與大量吸煙相關(guān)的肺癌均具有較高的突變負荷，其中C:G>A:T顛換是最常見的堿基替代形式。研究顯示，APOBEC基因表達是另一個與煙草暴露有關(guān)的改變。

2.2 TP53和RB1失活

TP53和RB1基因在SCLC中幾乎全部失活[2]，這是SCLC中必不可少的始發(fā)分子事件。TP53和RB1基因突變通常發(fā)生于大氣道中表達ASCL1的正常NE細胞，也可在其他多能干細胞的次代細胞發(fā)生[7]。GEMMs研究證實，將突變失活的TP53和RB1基因?qū)胄∈蠓蝺?nèi)細胞可導(dǎo)致SCLC發(fā)生率陡增，但潛伏期較長（6~12月），且PTEN，NFIB等基因在此期間也會發(fā)生改變[12]。因此，利用這兩種基因的失活可獲得SCLC的GEMMs，且可同時存在一個或多個額外基因的突變[11]。針對INGN-225（P53修飾的腺病毒-轉(zhuǎn)移的樹突狀細胞疫苗）進行的Ⅰ/Ⅱ期臨床試驗表明，INGN-225可促使機體產(chǎn)生大量的免疫反應(yīng)（40%~50%）。然而，研究發(fā)現(xiàn)在使用INGN-225后立即接受化療的患者將出現(xiàn)較高的客觀腫瘤復(fù)發(fā)率，特別是當出現(xiàn)陽性免疫反應(yīng)時[13]。而現(xiàn)有的研究表明化療對維持免疫反應(yīng)是有害的。因此仍需進一步研究。

2.3 染色體3p區(qū)域抑癌基因

1982年Whang-Peng等在細胞遺傳學(xué)研究中發(fā)現(xiàn)了SCLC腫瘤細胞和細胞株中頻發(fā)非隨機的獲得性染色體異常（缺失3p）。在所有SCLC中，親本等位基因的缺失幾乎均出現(xiàn)在多個非隨機3p區(qū)域，并且在發(fā)病早期甚至在組織學(xué)正常的肺上皮中發(fā)生，反映了普遍存在的癌場效應(yīng)，進而導(dǎo)致了對于數(shù)個3p區(qū)域的腫瘤抑制基因（TSG）的深入研究。包括Ras相關(guān)結(jié)構(gòu)域家族成員1（RASSF1）的異構(gòu)體（RASSF1A）、透明質(zhì)酸氨基葡糖苷酶1（HYAL1）、HYAL2，信號素3B （SEMA3B）、SEMA3F、脆性組氨酸三聯(lián)體（FHIT）、環(huán)形交叉軸突導(dǎo)向受體同源物1（ROBO1）和von Hippel-Lindau腫瘤抑制因子（VHL）等表達異常的多個基因和與腫瘤抑制功能有關(guān)的蛋白質(zhì)已被研究證實。但至今對于TSG的確切作用仍知之甚少。

2.4 Notch信號通路

Notch在SCLC中是一種抑癌基因，負向調(diào)節(jié)NE的分化。Notch基因在大多數(shù)SCLC中是失活的，特別是在表達全套NE細胞標記基因的SCLC，要么表達DLK1和DLL3，要么Notch通路基因突變失活（約占25%）。相反，在NSCLC中，Notch基因作為致癌基因發(fā)揮功能[14-15]。Notch信號通過轉(zhuǎn)錄激活HES1、HEY1和其他特定家族成員來維持干細胞活性。Notch信號的激活伴隨著NE分化的喪失，一部分是通過激活編碼神經(jīng)元和NE分化的轉(zhuǎn)錄抑制物REST來介導(dǎo)。REST在諸多NSCLC細胞中表達，但在大多數(shù)SCLC細胞中并不表達。因此，在大多數(shù)SCLC中，尤其是那些表達全套NE細胞標記基因的細胞，Notch信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和REST表達均受到抑制。表達Notch的SCLC細胞生長緩慢，這符合Notch的抑瘤基因特點，但耐藥細胞也會表達Notch，這與Notch的致瘤作用一致。非功能性配體DLL3與ASCL1同時表達，并作為Notch信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的主要負向抑制因子發(fā)揮作用。某些DLL3可作為新抗原在SCLC細胞表面表達，但不在正常肺組織中表達。Rovalpituzumab tesirine（ROVA-T）是靶向DLL3的抗體-藥物偶聯(lián)物，在復(fù)發(fā)難治性SCLC中顯示出明顯的抗腫瘤活性。在DLL3表達的肺神經(jīng)內(nèi)分泌癌Ⅰ期研究中表現(xiàn)出顯著的單藥抗腫瘤活性，據(jù)報道，在DLL3高表達的SCLC患者中，ROVA-T的療效高于低DLL3表達的患者。其后續(xù)臨床試驗正在進行[15-17]。VPA（valproic acid）是組蛋白去乙酰化酶（HDAC）抑制劑，可在G1期抑制SCLC細胞的生長和細胞周期阻滯，并降低HDAC4表達，增加組蛋白H4（AcH4）的乙?；?，同時激活Notch信號通路，增加Notch1、Notch靶基因HES1和p21的表達。還觀察到VPA對生長抑素Ⅱ型受體（SSTR2）的表達有很大的促進作用，該受體在許多癌細胞中常被過度表達，并被用作抗癌藥物開發(fā)的靶點，為VPA和靶向SSTR2的細胞毒素的聯(lián)合治療提供了可能[18]。以上研究表明，Notch信號通路在SCLC中的作用非常復(fù)雜，并可能提供多種治療靶點。

2.5 MYC家族的作用

MYC家族中包括MYC、MYCL和MYCN三個成員，在SCLC腫瘤細胞中常存在擴增或過度表達，特別是在SCLC變異亞型中。MYC在20%的SCLC中存在擴增，且與患者生存期縮短有關(guān)（4周 vs. 26周）。RB1、TP53和p130缺失的肺NE細胞在培養(yǎng)過程中生長并保留全套的NE標記基因，但是沒有致瘤性；而在RB1、TP53和p130缺失的GEMM的癌前NE細胞中，MYC家族成員，特別是MYCL的異常表達在幾周內(nèi)就會導(dǎo)致腫瘤的形成[19]。而RB1、TP53和p130缺失的SCLC的GEMM中，MYCL的缺失會抑制腫瘤生長，這提示MYCL可能成為MYCL擴增型SCLC的治療靶點。SCLC細胞系中顯性失活“OmoMyc”構(gòu)建體的外源表達抑制腫瘤細胞生長[20]。Aurora激酶已被確認為是導(dǎo)致SCLC細胞系中MYC家族通路擴增的關(guān)鍵激酶。Aurora激酶B（AURKB）使RB基因磷酸化，調(diào)控有絲分裂后的檢查點，并預(yù)防異常有絲分裂所致的多倍體產(chǎn)生。抑制AURKA和AURKB可選擇性地抑制MYC過表達的SCLC細胞的生長, 并產(chǎn)生多倍體[21]。另外，約6%的SCLC腫瘤細胞中會出現(xiàn)編碼MYC結(jié)合蛋白MAX基因的失活，且往往與MYC家族擴增相互排斥。相關(guān)研究表明，具有cMYC擴增/高基因表達的SCLC腫瘤經(jīng)常對Aurora B抑制劑產(chǎn)生反應(yīng)，臨床研究與預(yù)測生物標志物相結(jié)合[20]。一項隨機Ⅱ期研究表明，MYC陽性的SCLC腫瘤患者，作為對SCLC的二線治療，在紫杉醇聯(lián)合alisertib可顯著改善PFS[22-23]。

2.6 激酶信號通路

在臨床應(yīng)用中，EGFR基因突變和EML4-ALK基因融合的肺腺癌患者靶向治療取得了突破性進展，同時促進了在SCLC的激酶基因中尋找靶點的研究。與NSCLC相比，SCLC中激酶基因突變的數(shù)量較少。PI3CA的突變（編碼PI3K的催化亞基）可能在SCLC中發(fā)生，針對PI3K-AKT-mTOR通路的臨床試驗正在進行。PTEN是PI3K-AKT-mTOR途徑的抑制基因，PTEN失活將導(dǎo)致TP53和RB1失活的GEMM的SCLC加速生長和轉(zhuǎn)移。SCLCs具有激活成纖維細胞生長因子（FGF）-FGF受體1（FGFR1）通路，表現(xiàn)為FGF2、FGF9或FGFR1蛋白和（或）mRNA等表達和擴增。FGFR1蛋白的表達與FGFR1 mRNA水平和FGFR1基因拷貝數(shù)相關(guān)。針對FGFR1和配體表達的研究顯示可能選擇靶向FGFR1抑制劑治療SCLC患者。與NSCLC相反，EGFR或KRAS突變，以及EGFR或KRAS其他信號的干擾，包括下游的RAF-MEK-ERK通路的突變，在SCLC中極為罕見。實際上在SCLC中從未發(fā)現(xiàn)KRAS突變，該通路失活可能對SCLC有利[24]。

3 SCLC的表觀遺傳變化

盡管在SCLC中發(fā)現(xiàn)大量的DNA序列改變，但表觀遺傳學(xué)改變在SCLC發(fā)病中起著至關(guān)重要的作用。表觀遺傳變化可影響許多基因，這些變化對腫瘤生長有害也有利，靶向特定的表觀遺傳學(xué)改變可能會為SCLC帶來更多獲益[25]。

3.1 DNA甲基化和EZH2

至今仍缺乏對SCLC全基因甲基化的研究，且相關(guān)報道較少。一項全甲基化研究發(fā)現(xiàn)，在非惡性肺組織和SCLC腫瘤組織、異種移植組織和細胞系之間，DNA甲基化模式存在相當大的差異，異種移植更能代表腫瘤中發(fā)現(xiàn)的基因突變模式[26]。經(jīng)典和變異亞型的SCLC具有不同的甲基化模式，尤其是影響神經(jīng)分化基因。重要的表觀遺傳沉默基因包括NEUROD1、REST、轉(zhuǎn)錄因子2（TCF2，也稱為HNF1B）、視黃酸受體β（RARB）和BCL2以及許多位于3p染色體上的基因，包括RASSF1A和zeste homologue 2（EZH2）的基因編碼增強因子。EZH2是轉(zhuǎn)錄的主要調(diào)節(jié)因子，可通過上調(diào)DNA甲基轉(zhuǎn)移酶影響DNA甲基化。其在許多惡性腫瘤中被上調(diào)，并與不良預(yù)后有關(guān)。EZH2過表達可抑制TGFβ-SMAD通路甲基化，而使ASCL1失活，進而導(dǎo)致SCLC進展。因此，EZH2已成為治療SCLC的熱門靶點。EZH2抑制劑，如GSK-126、tazemetostat和CPI-1205，以及參與染色質(zhì)重組的靶標EZH2，均被設(shè)計用來開發(fā)合成藥物[16]。

3.2 染色質(zhì)修飾

染色質(zhì)模型獲取濃縮基因組的DNA，從而保證轉(zhuǎn)錄過程。SCLC亞組可發(fā)生編碼結(jié)構(gòu)相似的組蛋白修飾物EP300和CREBBP的互斥突變，或編碼相關(guān)組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶的KMT2A和KMT2D的互斥突變[27]。含溴結(jié)構(gòu)域和外部結(jié)構(gòu)域（BET）可調(diào)控MYC的表達，且BET在MYC家族擴增的SCLC細胞系中表達更高。目前，幾種BET抑制劑正在進行SCLC早期臨床試驗。EZH2在SCLC中經(jīng)常過表達，而并不突變，可導(dǎo)致DNA甲基化改變。EZH2主要通過維持干細胞活性、抑制細胞凋亡、提高細胞增殖、抑制ASCL1表達（通過抑制TGFβ信號轉(zhuǎn)導(dǎo)）和誘導(dǎo)化療耐藥（通過抑制SLFN11）等機制在SCLC中發(fā)揮作用，已成為腫瘤治療的優(yōu)選靶點。

3.3 超增強子和染色質(zhì)重塑和轉(zhuǎn)錄

染色質(zhì)修飾和轉(zhuǎn)錄因子占據(jù)超增強子導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄增加。SCLC譜系關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄因子ASCL1和NEUROD1的基因位于SCLC細胞系的超增強子的活性染色質(zhì)區(qū)域[19]。而超增強子也與已知的SCLC癌基因有關(guān)，如MYCL、MYC、NFIB和BCL2。Faber等臨床前的研究表明，BCL2蛋白家族促凋亡成員BIM的表達水平可能預(yù)測機體對ABT-263（誘導(dǎo)細胞凋亡的BH3模擬劑）的敏感度[28]。抑制BET基因組中BRD4或cyclin依賴性激酶CDK7的活性，將阻斷與超增強子有關(guān)的NE譜系特異性基因和MYC的表達，這也提供了潛在的治療靶點[19]。

3.4 NFIB和腫瘤轉(zhuǎn)移

NFIB是一種編碼胚胎肺和大腦發(fā)育所必需的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，同時也是一種與癌癥發(fā)生、進展、侵襲和轉(zhuǎn)移相關(guān)的驅(qū)動性癌基因，在SCLC中存在過表達和擴增[27,29-30]。與原發(fā)腫瘤相比，NFIB在轉(zhuǎn)移腫瘤中往往是擴增和過表達的，且與低分化的鈣粘蛋白1（CDH1）陰性表達的亞組有關(guān)。由于NFIB表達能重新配置遠端調(diào)控位點的染色質(zhì)開放區(qū)域，使其更容易訪問，因此NFIB表達在SCLC轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要作用[31]。

綜上所述，SCLC是一種具有高度侵襲性的癌癥，其特征在于快速增殖，多信號通路失調(diào)，血管豐富，凋亡失衡和遺傳不穩(wěn)定性。未來針對SCLC的臨床轉(zhuǎn)化性研究和靶向Notch、SOX2、MYC和EZH2等靶點的新型藥物的臨床試驗結(jié)果值得期待。