程韶 舒冰 趙永見 王晶 趙世天 陶渝仁 楊駿杰 張偉強 盧盛 王擁軍

1.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院，上海 200032 2.上海中醫(yī)藥大學(xué)脊柱病研究所，上海 200032 3.教育部重點實驗室(筋骨理論與治法)，上海 200032 4.上海中醫(yī)藥大學(xué)，上海 201203

骨重建過程中穩(wěn)態(tài)的維持依賴于骨組織的形成與吸收功能之間的動態(tài)平衡，即骨形成相關(guān)細(xì)胞如骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞、成骨細(xì)胞、骨細(xì)胞與破骨細(xì)胞之間活性的平衡，一旦此平衡被打破，便會產(chǎn)生骨質(zhì)疏松癥、骨質(zhì)硬化癥等代謝性骨病[1]。近年來的研究表明[2-3]，活性氧(reactive oxygen species，ROS)誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激反應(yīng)(oxidative stress，OS)會引起骨重建穩(wěn)態(tài)的改變，使骨吸收增加、骨形成減少，從而導(dǎo)致骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生。因此，對骨質(zhì)疏松癥研究的重點逐步從以雌激素為中心轉(zhuǎn)向為以氧化應(yīng)激為中心[4]，為骨質(zhì)疏松癥的防治提供了新的思路。

1 氧化應(yīng)激的產(chǎn)生

在線粒體通過呼吸鏈氧化磷酸化生成三磷酸腺苷(adenosine triphosphate，ATP)的過程中，伴隨著電子的漏出。呼吸鏈漏出的電子與氧分子(O2)在細(xì)胞色素P-450、單氧酶等酶的作用下生成超氧陰離子 O2-，此為細(xì)胞內(nèi)初級ROS。之后超氧陰離子進(jìn)一步通過一系列酶促反應(yīng)形成羥自由基(OH-)和過氧化氫(H2O2)等次級活性氧，此途徑為細(xì)胞內(nèi)ROS產(chǎn)生的主要來源，同時其他酶系如還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH)氧化酶、環(huán)氧化酶、醛氧化酶、二氫乳清酸脫氫酶、色氨酸雙加氧酶、一氧化氮合酶、黃嘌呤氧化酶，也有助于細(xì)胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生[3]。此外，在衰老、雌激素缺乏、炎性細(xì)胞因子刺激、生長因子、環(huán)境毒素、化療藥物、紫外線或電離輻射刺激下機體內(nèi)也會產(chǎn)生ROS[4-5]。正常情況下，細(xì)胞內(nèi)的ROS作為次級信使，在調(diào)節(jié)信號通路、炎癥反應(yīng)、組織修復(fù)、細(xì)胞的增殖凋亡等過程中發(fā)揮著重要作用[6]。

機體針對ROS擁有一套完整的抗氧化系統(tǒng)，包括抗氧化酶體系和非酶類抗氧化體系，以防止ROS產(chǎn)生過多?？寡趸赴ǔ趸锲缁?superoxide dismutase，SOD)、過氧化氫酶(catalase，CAT)和谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase，GPx)[7]，非酶類抗氧化物包括有抗壞血酸(維生素C)、維生素E、類胡蘿卜素、類黃酮、輔酶Q10、白蛋白等[8]。隨著機體的衰老，細(xì)胞內(nèi)線粒體功能及抗氧化防御功能下降，使機體內(nèi)ROS的產(chǎn)生與抗氧化清除失衡，引起氧化應(yīng)激，導(dǎo)致細(xì)胞中脂質(zhì)、糖類、蛋白質(zhì)、DNA等大分子物質(zhì)發(fā)生空間結(jié)構(gòu)的變性、斷裂[9-10]，進(jìn)而造成對細(xì)胞的氧化損傷。過量的ROS也增加了線粒體外膜的通透性，使促凋亡因子細(xì)胞色素C漏出，引起細(xì)胞凋亡[11]。同時隨著年齡增長，骨組織中ROS也日益增多[12]，通過對細(xì)胞因子、酶活性以及信號通路的調(diào)節(jié)，影響核內(nèi)基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，促使骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞、成骨細(xì)胞、骨細(xì)胞的凋亡和破骨細(xì)胞的增殖分化，使骨重建失衡，形成以骨吸收為主的代謝性骨病，從而導(dǎo)致骨質(zhì)疏松癥。因此，ROS對于骨重建而言是一把雙刃劍，一方面是調(diào)節(jié)骨重建生理過程的重要信號分子，另一方面當(dāng)其過量時也會成為有害物質(zhì)影響骨重建的病理過程。

2 氧化應(yīng)激對骨重建的影響

2.1 氧化應(yīng)激對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的影響

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)具有多種分化潛能，能夠向成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞分化[13]。近年來研究表明，ROS能夠通過Wnt/β-catenin(Wingless Int1，Wnt)、磷脂酰肌醇3-激酶/絲氨酸-蘇氨酸激酶(phosphatidylinositol 3-kinase/serine-threonine kinase，PI3K/AKT)、p53、非嘌呤非嘧啶核酸內(nèi)切酶/氧化還原因子-1(Apurinic/apyrimidinic endonuclease-1/Redox Factor-1，APE/REF-1)等多條信號通路的轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，誘導(dǎo)BMSCs的衰老凋亡、削弱其增殖和成骨分化能力，導(dǎo)致成骨細(xì)胞生成減少、骨量降低，使骨重建失衡。經(jīng)典的Wnt/β-catenin信號通路能夠通過抑制脂肪形成相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子CCAAT增強子結(jié)合蛋白(CCAAT enhancer binding protein，C/EBP)和過氧化物酶增殖活化受體γ(peroxisome proliferator-activated receptorsγ，PPARγ)的表達(dá)使BMSCs更趨向于成骨細(xì)胞分化，在BMSCs定向分化中起到相當(dāng)重要的作用[14]。Song等[14]研究表明，在敲除小鼠前成骨細(xì)胞中的β-catenin后，PPARr的表達(dá)增加，前成骨細(xì)胞分化為脂肪細(xì)胞，導(dǎo)致骨量減少和骨髓脂肪化。隨著ROS的增多引起的氧化應(yīng)激，導(dǎo)致PPARr表達(dá)增加，激活蛋白酶體降解β-catenin[15]，由此削弱了BMSCs 通過Wnt/β-catenin途徑向成骨細(xì)胞定向分化，使成骨細(xì)胞生成減少脂肪細(xì)胞生成增多，從而影響骨形成及骨重建。PI3K/AKT信號通路參與了細(xì)胞在應(yīng)激狀態(tài)下的生理調(diào)控，AKT磷酸化后提高了p38β的活性，使細(xì)胞內(nèi)ROS水平降低，并抑制凋亡分子氨基末端激酶(c-Jun NH2-terminal protein kinase，JNK)的表達(dá)增加BMSCs的抗凋亡能力[16]。BMSCs中ROS增多時，通過p53及其下游p21Cip1(CDK-interacting protein1)抑制細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶/細(xì)胞周期蛋白(cyclin-dependent kinase cyclin， CDK/cyclin)復(fù)合體的活性，促使BMSCs的衰老，p53轉(zhuǎn)錄因子還可上調(diào)Bax(Bcl-2 Assaciated X protein)、Bak(Bcl-2 homologous antagonist killer)等促凋亡因子，下調(diào)B細(xì)胞淋巴瘤-2(B cell lymphoma-2，Bcl-2)、Bcl-x(B cell lymphoma-x，Bcl-x)等抗凋亡因子來促使BMSCs的凋亡[17]。APE/REF-1酶能夠修復(fù)ROS對機體造成的氧化性損傷，通過APE/REF-1信號途徑可阻礙細(xì)胞內(nèi)ROS的聚集，防止BMSCs的衰老、調(diào)控其分化[18]。

2.2 氧化應(yīng)激對成骨細(xì)胞的影響

成骨細(xì)胞(osteoblast，OB)來源于BMSCs，負(fù)責(zé)合成、分泌、礦化細(xì)胞外基質(zhì)，參與骨形成。Wnt/β-catenin通路的激活能夠促進(jìn)BMSCs的增殖、OB分化以及抑制OB的凋亡[19]。β-catenin蛋白是Wnt/β-catenin通路中的關(guān)鍵蛋白，該通路激活后β-catenin能夠進(jìn)入細(xì)胞核，激活轉(zhuǎn)錄因子T細(xì)胞因子/淋巴細(xì)胞增強因子(T cell factor/lymphoid enhancer factor，TCF/LEF)，引起成骨相關(guān)基因Runx2、Osterix的表達(dá)，促進(jìn)OB分化。FoxO轉(zhuǎn)錄因子家族能夠保護(hù)細(xì)胞免于ROS損傷以及維持骨內(nèi)穩(wěn)態(tài)，當(dāng)細(xì)胞中ROS增多時，引起FoxO的基因表達(dá)上調(diào)，轉(zhuǎn)錄后能夠使抗氧化酶包括線粒體中的MnSOD(SOD2)和細(xì)胞中CAT的表達(dá)增加，以清除ROS[20]，通過對細(xì)胞抗氧化特性的調(diào)節(jié)，調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖分化，從而調(diào)控BMSCs向OB分化[4]。β-catenin作為FoxO轉(zhuǎn)錄的激活因子，當(dāng)ROS過多時，為了抵抗氧化應(yīng)激的影響，引起FoxO與Wnt通路競爭性結(jié)合β-catenin增多，從而將細(xì)胞內(nèi)有限的β-catenin從Wnt通路中的TCF/LEF轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)向FoxO轉(zhuǎn)錄，導(dǎo)致OB的生成和增殖分化減少，降低了骨形成[21]。隨著機體衰老導(dǎo)致氧化應(yīng)激增加，促使FoxO結(jié)合了更多的β-catenin，使Wnt/β-catenin通路的表達(dá)降低，從而導(dǎo)致骨形成減少和骨量丟失，這或許可以解釋老年性骨質(zhì)疏松癥的發(fā)病機制。以上研究證實，ROS能夠干預(yù)OB的增殖分化，進(jìn)而影響骨重建。

2.3 氧化應(yīng)激對骨細(xì)胞的影響

在成骨細(xì)胞成熟的過程中大約有20%[22]的成骨細(xì)胞嵌入到其分泌的細(xì)胞外基質(zhì)中，成為類骨質(zhì)骨細(xì)胞，之后隨著類骨質(zhì)的礦化及骨細(xì)胞樹突的逐漸形成，最終發(fā)育為成熟骨細(xì)胞，骨細(xì)胞能夠?qū)⑵鋵C械載荷的反應(yīng)信號通過樹突向骨表面的成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞進(jìn)行傳遞并調(diào)節(jié)它們的活性[23]。最近研究表明[22,24]，成熟骨細(xì)胞在骨重建的過程中起到了核心的調(diào)節(jié)作用，除了對成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞的活性調(diào)節(jié)外，骨細(xì)胞還可通過移除替代骨陷窩周圍的有機和無機成分，重塑骨陷窩周圍的生物學(xué)微環(huán)境，以維持骨的功能活力及正常的礦化水平。ROS不僅能夠誘導(dǎo)骨細(xì)胞的凋亡，抑制骨質(zhì)礦化和骨形成，還可促進(jìn)破骨細(xì)胞的增殖分化，增強骨吸收，導(dǎo)致骨轉(zhuǎn)換亢進(jìn)和骨量丟失[2,25]。骨細(xì)胞能夠分泌多種因子調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞的活性及骨重建的過程，其中最主要的是核因子κB受體活化因子配體(receptor activator for nuclear factor-κB ligand，RANKL)、骨保護(hù)素(osteoprotegerin，OPG)和骨硬化蛋白(sclerostin)[26]。RANKL能夠和RANK結(jié)合促進(jìn)破骨細(xì)胞的增殖分化提高破骨細(xì)胞的活性；OPG由Wnt/β-catenin信號通路激活后所產(chǎn)生，能夠和RANKL綁定結(jié)合，從而抑制破骨細(xì)胞的活性；sclerostin是骨細(xì)胞分泌的Wnt/β-catenin信號通路的抑制蛋白，對骨形成起到負(fù)性調(diào)節(jié)作用[22]。有學(xué)者[27-28]研究表明，ROS能夠激活JNK和細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶(extracellular signal-regulated kinase1/2，ERK1/2)信號通路引起骨細(xì)胞中RANKL及sclerostin的表達(dá)上調(diào)，OPG的表達(dá)下調(diào)，使RANKL/OPG的比值升高，并激活caspase-3誘導(dǎo)骨細(xì)胞的凋亡。即ROS能夠誘導(dǎo)骨細(xì)胞的凋亡降低骨形成，從而打破骨形成與骨吸收之間的動態(tài)平衡，改變骨重塑的過程。

2.4 氧化應(yīng)激對破骨細(xì)胞的影響

破骨細(xì)胞(osteoclast，OC)來源于骨髓造血干細(xì)胞，是一種多核細(xì)胞，通過向細(xì)胞外分泌HCl和溶解酶來溶解周圍骨組織，因此能量消耗巨大，胞內(nèi)含線粒體豐富，而線粒體所產(chǎn)生的ROS尤其是H2O2對OC的增殖分化及功能的調(diào)控具有重要的作用。Baek等[29]向人來源的骨髓單核細(xì)胞中加入H2O2培養(yǎng)后發(fā)現(xiàn)，H2O2能夠增加OC的活性，促進(jìn)抗酒石酸酸性磷酸酶的表達(dá)，刺激巨噬細(xì)胞集落刺激因子(macrophage colony-stimulating factor，M-CSF)、RANKL的表達(dá)，使RANKL/OPG的比值升高，導(dǎo)致OC數(shù)量增加，表明氧化應(yīng)激參與OC的生成，可引起骨吸收的增強，骨量的減少。腫瘤壞死因子-α(tumour necrosis factor α，TNF-α)作為骨吸收誘導(dǎo)劑，不僅能夠促進(jìn)破骨前體細(xì)胞的增殖分化，提高其對破骨因子RANKL的敏感性，增強骨吸收，還可通過Wnt/β-catenin信號通路抑制BMSCs向OB的分化[30-31]。RANKL也稱為與TNF相關(guān)的激活誘導(dǎo)細(xì)胞因子，在成骨細(xì)胞、骨細(xì)胞、干細(xì)胞和T細(xì)胞中均有表達(dá)[32]，通過與OC前體細(xì)胞表面的RANK結(jié)合，調(diào)節(jié)OC的成熟分化。OPG可由成骨細(xì)胞、骨細(xì)胞等分泌，作為RANKL的誘導(dǎo)受體，阻止RANKL與RANK的結(jié)合，調(diào)節(jié)OC的增殖分化，抑制骨吸收。與Baek等[29]研究證實的ROS直接參與骨吸收不同，有學(xué)者研究表明ROS還能夠通過激活ERK、JNK、NF-κB等信號通路，上調(diào)RANKL、TNF-α的表達(dá)，下調(diào)OPG的表達(dá)，提高骨吸收功能，間接地影響骨重建過程[4,27,32]。因此，ROS一方面能夠通過直接或間接的作用促進(jìn)破骨前體細(xì)胞向破骨細(xì)胞的分化，提高破骨細(xì)胞的活性及數(shù)目，加強骨吸收；另一方面ROS還可抑制BMSCs向OB的分化降低骨形成，從而進(jìn)一步導(dǎo)致骨吸收增加。

3 骨質(zhì)疏松癥的抗氧化治療

由于氧化應(yīng)激及ROS在骨重建過程中的重要作用，因此對于使用抗氧化物治療骨質(zhì)疏松癥的研究引起了越來越多學(xué)者的關(guān)注。體內(nèi)外實驗研究表明，食物中所含的多酚類化合物具有抗氧化特性，能夠預(yù)防心血管疾病、糖尿病、骨質(zhì)疏松癥等疾病[33]。綠茶中含有多種類型的茶多酚，具有抗氧化特性，能夠減少骨量和骨基質(zhì)中膠原的流失，抑制成骨細(xì)胞的衰老，降低破骨細(xì)胞的分化及骨吸收，預(yù)防卵巢切除大鼠骨質(zhì)疏松癥的形成[34-35]。白藜蘆醇是一種天然多酚類抗氧化物，能夠提高骨質(zhì)疏松患者的骨密度及骨堿性磷酸酶的表達(dá)[36]。Tou[37]研究表明，白藜蘆醇能夠通過降低老齡大鼠和卵巢切除大鼠的氧化應(yīng)激，防止骨量丟失。中藥丹參成分中丹參酚酸類的結(jié)構(gòu)和白藜蘆醇極其相似，也是天然抗氧化的有效成分，能提高機體SOD的活性，清除ROS，減少氧化應(yīng)激引起的骨質(zhì)疏松大鼠中成骨細(xì)胞的凋亡[38]。黃酮類化合物具有抗氧化、促進(jìn)成骨、抑制破骨等作用。其中骨碎補總黃酮、淫羊藿總黃酮、大豆異黃酮等黃酮類化合物已被證實具有抗骨質(zhì)疏松的活性，其相應(yīng)的活性成分有柚皮苷、淫羊藿苷、大豆苷元等[39]。吳新濤等[40]通過使用柚皮苷的主要代謝產(chǎn)物柚皮素干預(yù)H2O2處理后的成骨細(xì)胞，結(jié)果表明柚皮素促進(jìn)在氧化應(yīng)激條件的成骨細(xì)胞增殖，抑制其凋亡，上調(diào)Bcl-2并下調(diào)Bax、Caspase-3表達(dá)。孫振雙等[41]則使用中藥湯劑溫腎固疏方觀察其對去卵巢大鼠骨密度、骨代謝及氧化應(yīng)激指標(biāo)的影響，結(jié)果表明中藥湯劑溫腎固疏方能夠增加骨形成，降低骨吸收，提高血清中SOD的水平，具有抗骨質(zhì)疏松及抗氧化應(yīng)激作用。鑒于氧化應(yīng)激與動脈粥樣硬化及骨質(zhì)疏松癥之間密切的聯(lián)系[15]，通常用于高脂血癥的辛伐他汀類藥物，由于其具有抗氧化的特性，Moon等[42]將其用于骨質(zhì)疏松方面的研究，結(jié)果表明辛伐他汀能夠減少單核巨噬細(xì)胞(破骨細(xì)胞前體細(xì)胞)中ROS的生成，下調(diào)破骨細(xì)胞形成的相關(guān)通路，抑制破骨細(xì)胞的生成分化，降低其骨吸收活性，為骨質(zhì)疏松癥及病理狀態(tài)的骨吸收提供了新的治療思路。

4 小結(jié)

綜上所述，氧化應(yīng)激通過對相關(guān)分子和信號通路的調(diào)節(jié)引起了骨重建的生理過程中骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化減弱、成骨細(xì)胞的生成減少、骨細(xì)胞凋亡增加、破骨細(xì)胞活性增強等細(xì)胞增殖分化的改變，介導(dǎo)了骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生發(fā)展，但其具體作用機制尚未完全闡明，今后仍需通過基礎(chǔ)研究進(jìn)一步探究氧化應(yīng)激在骨重建及骨質(zhì)疏松癥中的作用機制。同時，我國擁有豐富的中醫(yī)藥資源，立足于中藥抗氧化的研究或許可為骨質(zhì)疏松的防治提供新的方法，具有良好的科研前景。