劉東明 綜述 郭華 審校

傳統(tǒng)意義上將“單一基因的缺陷不會對細胞產(chǎn)生殺傷作用，當兩種或多種基因同時缺陷時才可以殺傷細胞”這一現(xiàn)象稱為協(xié)同致死效應［1］。近年來，基因組測序的進展促進了惡性腫瘤治療觀念的轉(zhuǎn)變，即可通過短時間內(nèi)鑒別出患者腫瘤細胞和正常細胞間的遺傳和表觀遺傳的變化，為腫瘤的精準治療提供依據(jù)［2］。特異性致癌基因的改變不僅揭示了促進腫瘤進展的生物學變化，還可以針對這種改變進行靶向治療［3］。因此，基于腫瘤基因組個體化治療的應用越來越廣泛［4］。目前，大多數(shù)基因的靶向治療均是基于“致癌基因成癮”（oncogene addiction）這一現(xiàn)象進行干預，即特異性干預腫瘤所依賴的致癌基因或致癌通路。盡管一些小分子抑制劑已被證明對一些腫瘤的致癌基因有效，但并非所有的惡性腫瘤均具有該類致癌基因，相反獲得性耐藥卻更為常見［5］。對于不能通過傳統(tǒng)小分子抑制劑直接治療的惡性腫瘤，可利用另一靶點作為致癌和非致癌基因間相互作用的橋梁，進而產(chǎn)生相應的協(xié)同致死效應。

1 協(xié)同致死效應概念的提出與演變

協(xié)同致死效應源自果蠅和釀酒酵母這類模式生物的遺傳研究。Dobzhansky 等于1946年首次提出協(xié)同致死效應的概念，其在黑腹果蠅研究中觀察到若有兩個基因同時發(fā)生突變，就可能會帶來致死性的結(jié)果。1991年，Bender 等在出芽釀酒酵母實驗中發(fā)現(xiàn)大部分基因彼此之間存在這種協(xié)同致死效應，這些基因之間的協(xié)同致死關系也可應用到人類腫瘤的研究中。Hartwell 等［6］于1997年驗證了這一觀點，表明模式生物的遺傳學研究可以推廣應用于識別人類惡性腫瘤中的藥物靶點，并首次提出了協(xié)同致死效應的發(fā)展可能為抗癌療法提供新策略的觀點。

協(xié)同致死效應是揭示正常細胞和腫瘤細胞生物學機制的有效途徑，但其最終的目標是為個體化治療提供依據(jù)。2005年通過上述假說所設計的實驗發(fā)現(xiàn)了乳腺癌和其他癌癥中的高頻突變基因BRCA1和BRCA2 與PARP1 之間的協(xié)同致死效應［7-8］。具體來說，作為真核細胞中催化聚核糖化這一過程的DNA修復酶，PARP在修復細胞內(nèi)異常DNA損傷和維持基因組完整性等方面有著重要的作用。但細胞內(nèi)修復異常DNA損傷的系統(tǒng)并不是唯一的。正常情況下抑制腫瘤細胞中PARP的活性，可以導致其單鏈DNA斷裂的積聚，但腫瘤細胞內(nèi)的另外一套修復系統(tǒng)，如乳腺癌、卵巢癌等易感基因BRCA1/2 所介導的同源重組途徑，可以修復DNA損傷、維持染色體的穩(wěn)定。因此，抑癌基因BRCA1/2 缺陷或突變的卵巢癌細胞對PARP 抑制劑的敏感性是正常細胞的1 000 倍，在此基礎上抑制PARP 的活性可以產(chǎn)生更好的靶向殺傷腫瘤細胞的效果。PARP 抑制劑于2009年首次在BRCA1/2 突變的生殖細胞系腫瘤中通過協(xié)同致死效應被應用于臨床試驗中，同時也是目前唯一被批準用于癌癥患者的協(xié)同致死藥物［9］。這一發(fā)現(xiàn)引起開發(fā)PARP 同類抑制劑的熱潮。尤其是使用大規(guī)模的RNAi 篩選技術(shù)發(fā)現(xiàn)了一大批潛在的協(xié)同致死基因靶點［10］。

2 協(xié)同致死效應的相互作用形式

在協(xié)同致死效應中，對于細胞產(chǎn)生的殺傷作用不僅依靠其相應靶點的突變，還可以在靶向作用腫瘤細胞中“功能性缺失”（loss-of-function）的那些突變基因的基礎上擴大協(xié)同致死效應概念的應用范圍［3］。因此，根據(jù)能夠產(chǎn)生協(xié)同致死效應的不同基因組合各自所發(fā)生的改變，協(xié)同致死效應將分為以下幾種形式。

2.1 傳統(tǒng)的協(xié)同致死效應

如前文所述，兩個基因同時發(fā)生突變進而殺傷細胞這一過程，是傳統(tǒng)的協(xié)同致死效應，也可稱為“狹義的”協(xié)同致死效應。Sinha等［11］通過探討在人類原發(fā)腫瘤數(shù)據(jù)中特定基因突變時所產(chǎn)生的特異性協(xié)同致死組合，預測出3 120個基因突變所產(chǎn)生的145 891個協(xié)同致死組合。并發(fā)現(xiàn)IDH1 的突變與ACACA 在白血病治療過程中可以產(chǎn)生協(xié)同致死效應。Williams等［12］利用大規(guī)模RNAi篩選技術(shù)，篩選出結(jié)直腸癌治療中的27 個必需基因，并以此確定了相應的協(xié)同致死組合。一般來說，傳統(tǒng)的協(xié)同致死效應依賴于大規(guī)模的基因篩選技術(shù)以確定相應的基因突變組合，但其在臨床中的應用較為局限［13］。

2.2 擴大范圍的協(xié)同致死效應

較寬泛的協(xié)同致死效應是在傳統(tǒng)的協(xié)同致死效應的基礎上提出的，是指一種突變或過表達的基因與一種常用的小分子抑制劑之間的相互作用［3］。Williamson等［14］研究提示ADID1A的突變可以增強腫瘤細胞對ATR抑制劑的敏感性，ARID1A的缺乏可導致拓撲異構(gòu)酶2A 的缺失和細胞周期的異常，同時增加其對ATR檢查點活性的依賴。因此，在ARID1A突變的腫瘤細胞中，ATR 抑制劑可引發(fā)早期有絲分裂、基因組不穩(wěn)定性和細胞凋亡，進而產(chǎn)生協(xié)同致死效應。Azzariti 等［15］研究表明SHP2 基因的低表達可增強HCC 細胞對于索拉非尼的敏感性，并抑制其體外培養(yǎng)的HCC 細胞的增殖能力，同時降低其黏附和遷移能力。因此，該研究提出SHP2抑制劑可以增強索拉非尼對于HCC 靶向治療的療效，延長這部分HCC患者的生存期。

在腫瘤細胞中，某些基因的過表達可能導致其體細胞拷貝數(shù)的變化［16］。腫瘤中過表達基因可通過與協(xié)同致死組合基因的抑制劑共同作用，以達到協(xié)同致死劑量。這種現(xiàn)象于1991年在酵母中首次被發(fā)現(xiàn)［17］，隨后Kroll 等［18］依據(jù)這種概念篩選出CTF13 與過表達的ORC6基因，發(fā)現(xiàn)這兩者之間存在著相互作用以殺傷細胞。MAD2 是一種在淋巴瘤、肝癌、肺癌和結(jié)直腸癌等多種惡性腫瘤中高表達的基因，Bian等［19］研究證實，通過敲除或者抑制PP2A 的活性，可以與過表達的MAD2 基因產(chǎn)生協(xié)同致死效應。具體來說，紡錘體檢查點對于確保染色體分離至關重要，從而保持基因組穩(wěn)定性。MAD2 是紡錘體檢查點的關鍵組成部分，在許多腫瘤細胞中過表達。由于紡錘體檢測點通路在酵母和人類之間高度保守，該研究首先在酵母中進行了遺傳陣列分析，揭示并分析了MAD2的過表達所誘導13個缺失的基因及其致死率。在候選基因的人類同源物中，敲低PP2A可以顯著抑制MAD2過表達腫瘤細胞的生長，這一現(xiàn)象主要是由于PP2A 的抑制誘導了MAD2 的磷酸化并抑制MAD2的蛋白水平，產(chǎn)生了相應的協(xié)同致死作用。此外，CKS1B這種經(jīng)常在乳腺癌、肺癌和肝癌中過度表達的基因與PLK1也可以產(chǎn)生協(xié)同致死作用［20］。

以上研究結(jié)果均表明針對腫瘤驅(qū)動基因涉及的關鍵信號通路，尋找到基于協(xié)同致死效應靶向藥物治療中的協(xié)同致死基因，并進行靶向干預，能夠提高腫瘤細胞對于靶向藥物的敏感性，在一定程度上逆轉(zhuǎn)藥物的耐藥現(xiàn)象，進而延長腫瘤患者的生存期。因此，腫瘤的協(xié)同致死效應在逆轉(zhuǎn)藥物的耐藥、提高腫瘤治療療效上扮演了重要角色，可用于設計靶向治療的藥物組合，設計個體化腫瘤治療策略，彌補單一治療的局限性。

2.3 條件性協(xié)同致死效應

腫瘤細胞的異質(zhì)性以及其所在微環(huán)境的差異，均可以導致基因的改變，并且大多數(shù)為條件性的基因改變［21］。此外，遺傳背景對于協(xié)同致死效應的影響是雙向的，如一些基因間的相互作用需要三個或多個基因的缺失以促進協(xié)同致死效應進而產(chǎn)生其相應的表型［22］；而遺傳背景的突變有時也會導致協(xié)同致死效應的逆轉(zhuǎn)，如53BP1 的缺失可能抑制PARP1與BRCA1/2 在乳腺癌中的協(xié)同致死效應。因此，如抑癌基因p53 的缺失以及一些致癌基因的激活均有可能促進或抑制協(xié)同致死效應，這也為增加協(xié)同致死效應的有效性提供了新方向。

3 基于協(xié)同致死效應的相關篩選技術(shù)

通過某些無偏倚的篩選系統(tǒng)尋找協(xié)同致死作用靶點，是將協(xié)同致死效應推廣到臨床治療中的重要環(huán)節(jié)，而相關篩選技術(shù)的應用也越來越多地被重視。因此，根據(jù)不同的方法，將協(xié)同致死效應的相關篩選技術(shù)歸納為以下幾種。

3.1 全基因組RNAi文庫篩選技術(shù)

全基因組RNAi 文庫是人工構(gòu)建的，通過誘導RNAi 以抑制不同基因表達的混合文庫，其可以用于建立“功能性缺失”的細胞庫，進行相關表型的篩選［23］。在腫瘤細胞中，RNAi 文庫可以利用細胞活性測定以篩選出具有抑制腫瘤細胞增殖的基因，進而發(fā)現(xiàn)抗癌通路中的重要靶點［24］。RNAi文庫篩選技術(shù)作為一種大規(guī)?！肮δ苄匀笔А钡暮Y查方法，在人類腫瘤細胞中開啟了基于協(xié)同致死效應的高通量篩選時代［25］。Bou Samra［26］使用基于協(xié)同致死效應和轉(zhuǎn)錄組學分析的RNAi篩選技術(shù)，鑒定可以使BLM和胞苷脫氨酶同時產(chǎn)生缺陷的細胞系，進而尋找能夠耐受組成型DNA 損傷和復制應激的基因；進一步發(fā)現(xiàn)胞苷脫氨酶和微管相關蛋白Tau 間可以產(chǎn)生協(xié)同致死作用。這一研究對同時出現(xiàn)胞苷脫氨酶缺陷和Tau表達上調(diào)的惡性腫瘤的抗癌治療開辟了新的可能性。

3.2 全基因組CRISPR-Cas9篩選技術(shù)

目前廣泛使用的CRISPR-Cas9 系統(tǒng)是由Ⅱ型CRISPR 改造而來，在分子生物學的研究中有著重要作用［27］。CRISPR-Cas 系統(tǒng)是細菌中的一種免疫形式，適用于從酵母到人類細胞的基因組編輯［28］。作為一種基因組編輯技術(shù)，CRISPR 已迅速成為發(fā)現(xiàn)哺乳動物細胞中潛在協(xié)同致死組合的重要工具。CRISPR-Cas9 核糖核蛋白復合物由向?qū)NA（sgRNA）組成，能夠?qū)as9 內(nèi)切核酸酶靶向至基因組中的特定序列。與RNAi 篩選技術(shù)不同，CRISPR-Cas9 可以針對核基因組中的任何DNA 序列設計sgRNA，僅通過細胞修復途徑來修復雙鏈斷裂，不會影響內(nèi)源性的RNAi通路［29］。鑒于尋找惡性腫瘤靶向治療中的新靶點一直是癌癥研究的方向之一，因此這種基因組編輯與基因組測序相結(jié)合的突變靶點篩選技術(shù)在癌癥中的研究有重要的意義。Shi 等［30］通過CRISPR 系統(tǒng)完成了惡性腫瘤相關藥物靶點的篩選，提高了高通量分析基因與疾病間關系的精確度。

3.3 基于基因數(shù)據(jù)庫的篩選技術(shù)

除了上述兩種篩選技術(shù)外，使用人口統(tǒng)計學數(shù)據(jù)預測基因間的相互作用也可以作為協(xié)同致死效應的篩選策略［31］。具體來說，可以通過TCGA數(shù)據(jù)庫或者COSMIC數(shù)據(jù)庫尋找所研究癌種的高頻突變基因，以臨床數(shù)據(jù)為基礎進行協(xié)同致死基因組合的篩選。Jerby-Arnon等［32］使用大樣本量臨床數(shù)據(jù)與實驗研究數(shù)據(jù)相結(jié)合這一模式開發(fā)了集成三個數(shù)據(jù)源的“DAISY”系統(tǒng)，這其中包括體細胞拷貝數(shù)改變的數(shù)據(jù)、臨床樣本及細胞系的突變數(shù)據(jù)、不同細胞系RNAi技術(shù)篩選出的基因數(shù)據(jù)和不同細胞系基因的表達數(shù)據(jù)。該研究通過“DAISY”系統(tǒng)預測的潛在產(chǎn)生協(xié)同致死作用的基因已經(jīng)得到了相應驗證，而“DAISY”系統(tǒng)生成的協(xié)同致死基因的組合網(wǎng)絡也顯示出預測乳腺癌臨床預后的前景。

4 基于協(xié)同致死效應的臨床治療策略、意義和挑戰(zhàn)

近年來，在腫瘤治療領域中基于協(xié)同致死原理的聯(lián)合治療受到了廣泛關注。大量基礎與臨床的研究結(jié)果表明，針對腫瘤驅(qū)動基因所涉及的關鍵信號通路，利用上文提出的相關篩選技術(shù)尋找到相應靶向藥物的增敏基因，并進行靶向干預，能夠取得較單一療法更優(yōu)的抗腫瘤效果［33］。協(xié)同致死效應可以擴大抗癌治療靶點的范圍，識別并靶向第二位點基因以促進腫瘤從無藥物靶向至可用藥物靶向這一過程的轉(zhuǎn)化，完成間接靶向治療［3］。如在肺腺癌的靶向治療中，由于DNA 損傷應答激酶ATM 的突變較為常見，Smida等［34］發(fā)現(xiàn)ATM的突變與抑制中樞生長因子激酶MEK1/2 活性的藥物（如曲美替尼）可以產(chǎn)生協(xié)同致死效應。在體內(nèi)和體外實驗中，ATM 的突變增加了肺癌細胞對MEK 抑制劑的敏感性。因此，肺腺癌中ATM 的突變與MEK 抑制劑之間所產(chǎn)生的協(xié)同致死效應，對于改善患者分期以及擴大靶向藥物在RAS 和BRAF 基因突變腫瘤中的適用性有著重要的作用。在卵巢癌的治療中，Kedves 等［35］提出，在泛素化水平較低的條件下，Polyubiquitin UBB 可以增強卵巢癌細胞對Polyubiquitin UBC 抑制劑的敏感性，提高這部分患者的生存期?；趨f(xié)同致死效應的治療策略有較多優(yōu)勢：1）協(xié)同致死效應對于腫瘤細胞特異性突變具有選擇性［36］；2）由于目前的放化療不良反應較大，應用協(xié)同致死效應可以降低藥物劑量并提高其有效率［37］；3）這種治療策略適用于惡性腫瘤的各種突變，包括抑癌基因以及無法靶向的基因。

盡管關于協(xié)同致死治療策略的研究較為深入，但也僅有PARP1與BRCA1/2這一對基于協(xié)同致死效應的基因組合被應用到臨床治療中。目前面臨的主要問題：1）協(xié)同致死效應的概念尚不夠清晰明確，大多數(shù)學者聚焦于研究兩個突變基因間的協(xié)同致死效應，但也有突變或過表達基因與小分子抑制劑間的協(xié)同致死效應組合；2）由于協(xié)同致死效應可以應用于基因組、轉(zhuǎn)錄組或者蛋白組，因此篩選協(xié)同致死效應靶點的前提是進行系統(tǒng)組學的分析，這也無疑增加了分析的難度；3）實現(xiàn)基于協(xié)同致死效應的臨床治療策略的最主要障礙為缺少對腫瘤細胞表型深層機制的認識［35］，如遺傳學、表觀遺傳學和腫瘤微環(huán)境等因素都會影響協(xié)同致死基因組合間的相互作用。因此，除了基因間的相互作用，了解其他因素對于協(xié)同致死效應的影響更有意義，能夠提供較為豐富的信息，為臨床治療提供更有針對性的指導。明確協(xié)同致死效應靶點之間內(nèi)在的相互作用機制有助于更好地理解協(xié)同效應，從功能至靶點的逆向分析也在提供更多協(xié)同靶點的同時，也顯示分析其內(nèi)在聯(lián)系的迫切性和必要性。

綜上所述，協(xié)同致死效應對于惡性腫瘤的研究有著重要的作用。使用來自模式生物的協(xié)同致死組合數(shù)據(jù)、來自腫瘤全基因組測序的生物信息學預測結(jié)果以及人類惡性腫瘤細胞系的直接篩選均可以識別出潛在的藥物靶點。但由于個體細胞代謝水平以及腫瘤微環(huán)境等差異，需要在闡明其深層機制的基礎上進行腫瘤細胞的選擇性殺傷，以實現(xiàn)個體化抗癌治療的可能。